專利名稱：伊立替康納米長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的 新方法。
背景技術(shù)：
伊立替康(羥基喜樹堿-11，CPT-11)系我國(guó)天然特有的珙桐科植物喜樹中提取分 離的左旋微量生物堿，為半合成的可溶性喜樹堿衍生物，是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topo-I)抑制 劑[1]，伊立替康與其代謝物SN-38通過與DNA-Τορο-Ι復(fù)合體的穩(wěn)定結(jié)合引起DNA單鏈的斷 裂，使DNA產(chǎn)生不可逆的損傷而死亡。研究表明，多種腫瘤細(xì)胞，特別是結(jié)直腸癌、宮頸癌、 卵巢癌等細(xì)胞內(nèi)的Topo-I含量大大高于正常組織，由于伊立替康獨(dú)特的作用機(jī)制，對(duì)上述 腫瘤細(xì)胞有著較高的選擇性，從而發(fā)揮其特異性抗腫瘤的活性，并降低其對(duì)正常細(xì)胞的毒 性。作為一種新型的抗腫瘤藥物，自從上世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)以來，在世界范圍內(nèi)已引起了 臨床的廣泛關(guān)注，被譽(yù)為90年代抗癌藥物的三大發(fā)現(xiàn)之一 [2]。
目前國(guó)內(nèi)上市的伊立替康產(chǎn)品僅為其鹽酸鹽的注射劑，該藥在劑量較大時(shí)可引起嚴(yán)重 的腹瀉和骨髓抑制[3]，這兩種不良反應(yīng)被認(rèn)為是與劑型相關(guān)的毒性。因此該藥在臨床上更 廣泛地使用存在一定的局限性。脂質(zhì)體是一種微粒分散體系，粒徑在IOO-IOOOnm之間，物理、化學(xué)穩(wěn)定性都較差。 由于腫瘤的血管間隙可以達(dá)到100-780nm，正常血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙通常在2nm左右。 靜脈注射給藥后，大粒徑的脂質(zhì)體很容易被體內(nèi)的單核巨噬系統(tǒng)所吞噬，從而被迅速清除。 小粒徑的脂質(zhì)體在血液循環(huán)過程無法進(jìn)入正常組織，但可有效的穿透腫瘤區(qū)的血管，因此 納米脂質(zhì)體(<200nm)可以被動(dòng)的聚集在腫瘤區(qū)，更好的發(fā)揮治療作用，是人們?cè)O(shè)計(jì)的較理 想的脂質(zhì)體藥物載體。納米顆粒作為藥物載體的研究已有20年歷史，它是一種應(yīng)用領(lǐng)域 廣泛、性能突出的新型藥物載體，是國(guó)際藥劑學(xué)界研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。大量的研究表明它 在靶向給藥領(lǐng)域有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。由于納米顆粒具有可改變藥物體內(nèi)分布、藥物釋 放速度、生物利用度、藥物對(duì)生物膜的透過性及藥物在局部的滯留性等優(yōu)點(diǎn)M，使其可以載 帶多種藥物，用于器官靶向、胞內(nèi)靶向、骨髓靶向等藥物傳遞系統(tǒng)中，或用于注射劑、口服制 齊U、眼用制劑、透皮制劑中。Messerer[5]等以二硬脂酰磷脂酰膽堿和膽固醇為膜材，采用MnSO4梯度裝載法制 備了伊立替康脂質(zhì)體。發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體可以有效保護(hù)藥物的活性內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，使伊立替康活性內(nèi) 酯形式在血漿中的清除明顯降低。
PharmaEngine公司對(duì)伊立替康的劑型進(jìn)行改良，開發(fā)出了新的脂質(zhì)體劑型，通過脂 質(zhì)體膜對(duì)藥物的包封和緩釋作用，不僅可以增加藥物在受試者體內(nèi)的靶向性和延長(zhǎng)作 用時(shí)問。更降低了藥物毒性，增加了用藥安全性。美國(guó)FDA于2008年12月3日同意 PharmaEngine公司在代謝性胰腺癌受試者體內(nèi)進(jìn)行伊立替康脂質(zhì)體注射液的II期臨床試 驗(yàn)。美國(guó)腫瘤學(xué)會(huì)2008年度會(huì)議的報(bào)告表明，在臺(tái)灣進(jìn)行的I期臨床試驗(yàn)中。該藥對(duì)晚期 頑固性腫瘤受試者呈現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)、有效性和耐受性。
但是，目前脂質(zhì)體應(yīng)用程度受限的主要因素之一就是穩(wěn)定性問題。雖然脂質(zhì)體制 備方法有多種，但尚未制備出在體內(nèi)外均穩(wěn)定的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)后，由于血中的 白蛋白、調(diào)理素、抗體等各種因素作用，脂質(zhì)體發(fā)生破裂，包封藥物快速滲漏，很快被網(wǎng)狀內(nèi) 皮系統(tǒng)識(shí)別、吸收，限制了它的“導(dǎo)彈”功能。為此，人們從各種途徑想辦法解決脂質(zhì)體的體 內(nèi)外穩(wěn)定性，制備穩(wěn)定的長(zhǎng)循環(huán)在脂質(zhì)體。通過高分子物質(zhì)來改變脂質(zhì)體表面親水性亞結(jié) 構(gòu)，形成表面有高分子材料包裹的脂質(zhì)體，，尤其是用聚乙二醇(PEG)修飾的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體 (long—circulationliposomes，LCL)，表面暴露的親水性基團(tuán)所產(chǎn)生的空間位阻可以增加 脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性，不但提高了對(duì)靶向組織的選擇性，而且能夠逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) 的捕獲，以獲得更充足的時(shí)間到達(dá)靶向部位，被稱為“隱形脂質(zhì)體”(stealth liposomes, S-liposomes)，又稱立體穩(wěn)定脂質(zhì)體或空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(sterically stabilized liposomes)。由于聚乙二醇價(jià)廉易得、可以大規(guī)模生產(chǎn)、分子量易于控制、物理化學(xué)性質(zhì)良 好，可以事先將其制備成聚乙二醇一磷脂衍生物，同時(shí)制劑工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，已成為目前高分 子修飾脂質(zhì)體的研究重點(diǎn)。Sadzuka[6]等制備了 PEG修飾的脂質(zhì)體，小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，PEG修飾的脂體可提 高藥物在腫瘤的聚集，使伊立替康向活性代謝產(chǎn)物SN-38的轉(zhuǎn)變提高而增加治療效果。此 外，由于膽汁中藥物濃度的下降，伊立替康的胃腸道的不良反應(yīng)減少。因此，將納米長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體作為藥物載體，結(jié)合伊立替康研制一種伊立替康的長(zhǎng) 循環(huán)納米脂質(zhì)體，對(duì)腫瘤的治療具有重要意義。制備脂質(zhì)體的方法有很多，分為被動(dòng)載藥法和主動(dòng)載藥法兩種，其中被動(dòng)載藥法 在制備含藥脂質(zhì)體時(shí)，根據(jù)藥物性質(zhì)首先將藥物溶于水相或有機(jī)相中，然后按適宜的方法 制備含藥脂質(zhì)體，該法適于脂溶性強(qiáng)的藥物，所得脂質(zhì)體具有較高包封率，而對(duì)于水溶性藥 物通常包封率不理想。被動(dòng)載藥法大致可以分為四類
第一類是以薄膜分散法為基礎(chǔ)的。將磷脂溶解在有機(jī)溶劑中減壓蒸發(fā)，得到干燥的磷 脂膜。水化磷脂膜則可以得到多層脂質(zhì)體。但是此時(shí)得到的多層脂質(zhì)體由于“溶劑擠出”效 應(yīng)，層與層之間溶質(zhì)分布不均勻，需要反復(fù)凍融處理。為了減小脂質(zhì)體的粒度，超聲或微射 流等手段通常是必需的。這類方法是制備脂質(zhì)體最基本的方法，尤其適用于實(shí)驗(yàn)室的小規(guī) 模制備。但是迄今為止也沒有應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。追究其原因主要在于(1)需要特殊 的設(shè)備，如擠出儀、微射流及交叉流注射等，這些設(shè)備有的還無法買到，無法放大生產(chǎn)；(2) 很難得到無菌(無熱原)的脂質(zhì)體產(chǎn)品；(3)由于氯仿、甲醇等有毒溶媒的使用，限制了其 應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。第二類方法要求形成W/0的乳劑或W/0/W的復(fù)乳。這類方法主要包括反相
蒸發(fā)法和二次乳化法。其中二次乳化法己經(jīng)成功的應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。但是應(yīng)用此類 方法，在生產(chǎn)過程中仍然需要使用有毒溶媒氯仿。第三類方法是去污劑透析法。采用該方法制備脂質(zhì)體必須先形成膠束。這類方法 最主要的應(yīng)用就是包封膜蛋白。通過此類方法可以將病毒或其它病原體的膜蛋白重建在脂 質(zhì)體雙層膜上，制成脂質(zhì)體疫苗或者是膜融合脂質(zhì)體。通常這種方法不適合小分子藥物或 極性較強(qiáng)的生物大分子。第四類方法基本上都和注入技術(shù)尤其是乙醇注入法有關(guān)系。根據(jù)藥物的性質(zhì)，將類脂質(zhì)(和脂溶性藥物)溶于有機(jī)溶劑中(油相)，然后把油相均速注射到水相(含水溶性藥 物)中，攪拌揮盡有機(jī)溶劑，再乳勻或超聲得到脂質(zhì)體。根據(jù)溶劑的不同可分為乙醇注入法 和乙醚注入法。目前這類方法在工業(yè)上應(yīng)用最廣，設(shè)備簡(jiǎn)單，無需“整?！奔纯傻玫絹單⒚?、 單分散的單室脂質(zhì)體；工藝簡(jiǎn)單，易于放大；且容易得到無菌制劑。主動(dòng)載藥法，是利用兩親性的藥物能以電中性的形式跨越脂質(zhì)雙層，但其電離形 式卻不能跨越的原理來實(shí)現(xiàn)的。通過形成脂質(zhì)體膜內(nèi)、外水相的PH梯度差異，使脂質(zhì)體外 水相的藥物自發(fā)地向脂質(zhì)體內(nèi)部聚集。此法通常用脂質(zhì)體包封酸性緩沖鹽，然后用堿把外 水相調(diào)成中性，建立脂質(zhì)體內(nèi)外的PH梯度。藥物在外水相的pH環(huán)境下以親脂性的中性形 式存在，能夠透過脂質(zhì)體雙層膜。而在脂質(zhì)體內(nèi)水相中藥物被質(zhì)子化轉(zhuǎn)為離子形式，不能再 通過脂質(zhì)體雙層回到外水相，因而被包封在脂質(zhì)體中。主動(dòng)載藥法廣義上就是指PH梯度 法。人們把其細(xì)分為(1)ρΗ梯度法；(2)硫酸銨梯度法；(3)醋酸鈣梯度法。其中硫酸銨 梯度法和醋酸鈣梯度法只是PH梯度法的兩種特殊形式。因鹽酸伊立替康化合物以鹽酸鹽的形式存在，在水溶液中以兩種形式呈動(dòng)態(tài)平 衡一種是內(nèi)酯形式；另一種是羧基形式。在酸性環(huán)境下，偏向內(nèi)酯形式。而在生理?xiàng)l件下 (37 °C，pH 7.4)會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)轸人猁}形式，但其內(nèi)酯環(huán)卻是抗腫瘤活性的必須結(jié)構(gòu)[7]。故采取 硫酸銨梯度法這種主動(dòng)載藥法，依靠?jī)?nèi)外水相硫酸銨梯度產(chǎn)生的較高驅(qū)動(dòng)力來進(jìn)行載藥， 既解決了采用傳統(tǒng)的被動(dòng)載藥法包封率低的問題，同時(shí)用硫酸銨梯度法將藥物載入具有酸 性環(huán)境的內(nèi)水相中，可以保持其內(nèi)酯形式不發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而更好地保持其抗癌活性。韓婷 [8]，張儉儉[9]，張自強(qiáng)_等采用薄膜分散、逆向蒸發(fā)、乙醇注入與薄膜分散-硫酸銨梯度法 制備伊立替康脂質(zhì)體，并比較各種方法制得的脂質(zhì)體粒徑與包封率，發(fā)現(xiàn)硫酸銨梯度法制 得的包封率明顯優(yōu)于其他方法，可達(dá)到90%以上。因鹽酸伊立替康為一種酸式鹽，水溶性較好，實(shí)驗(yàn)室采用被動(dòng)載藥方法如薄膜分 散，逆向蒸發(fā)，乙醇注入制備脂質(zhì)體粒徑分布不均，包封率不高，不穩(wěn)定；為得到小粒徑的脂 質(zhì)體往往需要采用超聲、研磨或者擠出的方法，這往往造成工藝復(fù)雜，其過程中產(chǎn)生的熱量 也會(huì)造成磷脂的氧化和分解，且制備無菌制劑困難；薄膜分散聯(lián)合硫酸銨梯度法的制備方 法目前也僅限于實(shí)驗(yàn)室操作，不易于生產(chǎn)放大。綜上所述，只有真正解決了上述問題，才能獲得有效的伊立替康長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)制備脂質(zhì)體粒徑分布不均，包封率不高，不穩(wěn)定的缺陷，本發(fā)明提供 一種乙醇注入法和硫酸銨梯度主動(dòng)載藥法相結(jié)合制備伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體藥物的 新方法。本發(fā)明中一種伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體，其特征在于，該脂質(zhì)體成分包括伊立 替康、磷脂、膽固醇、泊洛沙姆188和聚乙二醇類化合物；組成比例為磷脂膽固醇泊洛 沙姆188 聚乙二醇類化合物伊立替康=100: (20-50) (10-40) (8-15) (5-20)；活性成 分為鹽酸伊立替康；泊洛沙姆188為增溶劑和分散劑；聚乙二醇類化合物為PEG-DSPE或 PEG2000。制備本發(fā)明中一種伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的具體實(shí)施方案包括以下步驟 a、采用乙醇注入法制備長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體將濃度為75-150mg/ml的磷脂、膽固醇和泊洛沙姆188按照一定質(zhì)量比溶于乙醇中形成溶液A，其中磷脂與膽固醇質(zhì)量比為 5:1-2:1,磷脂與泊洛沙姆188質(zhì)量比為10 1-5 2 ；在水浴攪拌下將溶液A注入溶解了聚乙 二醇類化合物的濃度為0. 15-0. 25mol/L的硫酸銨溶液水化介質(zhì)中，其中磷脂與聚乙二醇 類化合物質(zhì)量比為20:1-5:1，乙醇溶液與水化介質(zhì)的體積比為1:5-1:2 ；—定溫度通N2條 件下保溫?cái)嚢枰欢〞r(shí)間，形成空白脂質(zhì)體；
b、將a所得空白脂質(zhì)體在生理鹽水中透析8-12h；
c、將伊立替康藥物濃度按磷脂/伊立替康質(zhì)量比為20:1-10:1配制成伊立替康溶液 加入空白脂質(zhì)體中，調(diào)節(jié)外相PH 7. 0-7. 5，在一定溫度下孵育8-12 min載藥即得伊立替康 長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體。本發(fā)明中，在步驟a形成的水化介質(zhì)中加入蔗糖或甘露醇等凍干保護(hù)劑，將所得 的伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體在液氮或低溫裝置凍結(jié)，然后在凍干機(jī)上干燥，用于制備其 凍干粉針劑；磷脂與保護(hù)劑的質(zhì)量比為1/10-1/5 ；采用微孔濾膜過濾除菌得到無菌制劑。具體操作要求
實(shí)施本發(fā)明時(shí)，步驟a中磷脂濃度為75-150 mg/ml，濃度過高形成脂質(zhì)體過程中分散 不好，易形成多室脂質(zhì)體，形態(tài)不好，濃度過低形成的脂質(zhì)體濃度也低，載藥量同時(shí)也就減 少，不符合生產(chǎn)和市場(chǎng)要求；乙醇溶液/水化介質(zhì)的體積比應(yīng)控制在1:5-2:5之間，乙醇比 例過低所得脂質(zhì)體分散不好，粒徑分布不均，比例過高又不易于很好的除去乙醇，造成有機(jī) 溶媒殘留過高。步驟a中泊洛沙姆188是一種表面活性劑，可作為增溶劑和分散劑增加脂質(zhì)體的 溶解度以減小粒徑并使形成的脂質(zhì)體粒徑分布窄而均勻；同時(shí)，泊洛沙姆188和聚乙二醇 類化合物均可作為附加劑制備長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體；其中磷脂與泊洛沙姆188質(zhì)量比控制在 10:1-5:2之間，聚乙二醇類化合物可采用PEG2000-DSPE、PEG2000，磷脂與聚乙二醇類化合 物質(zhì)量比控制在20:1-5:1之間，所得空白脂質(zhì)體粒徑在80-150nm之間，電鏡檢查結(jié)果顯示 脂質(zhì)體形態(tài)圓整，分布均勻。為提高脂質(zhì)體抗氧化能力，可于步驟a中制備脂質(zhì)的乙醇溶液 中加入脂溶性抗氧化劑vitamin Ε。本發(fā)明的成功實(shí)施，以獲得高包封率的伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體，采用硫酸銨 溶液作水化介質(zhì)，透析后調(diào)節(jié)外相PH以獲得主動(dòng)載藥的濃度梯度是必要的，硫酸銨溶液的 濃度控制在0. 15-0. 25mol/L之間時(shí)，包封率較理想。實(shí)施本發(fā)明時(shí)，在步驟a形成的水化介質(zhì)中加入蔗糖、甘露醇等載體物質(zhì)作為凍 干保護(hù)劑，將所得的伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體在液氮或低溫裝置凍結(jié)，然后在凍干機(jī)上 干燥即可獲得該脂質(zhì)體的凍干粉針劑，載體物質(zhì)的加入可使所得凍干物不易吸潮，可長(zhǎng)期 保存。同時(shí)通過調(diào)節(jié)載體物質(zhì)的比例，可以控制脂質(zhì)體的粒徑分布均勻，避免形成多層次的 多室脂質(zhì)體，影響脂質(zhì)體的質(zhì)量。磷脂/載體物質(zhì)質(zhì)量比在1/10-1/5之間效果較好。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明由于采用長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體作為藥物載體，結(jié)合伊立 替康制備而成，因而能夠明顯提高藥物的體內(nèi)外穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，提高靶向性。 2、本發(fā)明伊立替康長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體注射給藥，伊立替康在腫瘤組織的停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，有 利于腫瘤病灶部位的吸收。3、本發(fā)明伊立替康納米脂質(zhì)體的粒徑范圍為80-150 nm，能有效 的穿透腫瘤區(qū)的血管，被動(dòng)的聚集在腫瘤區(qū)，無法進(jìn)入正常組織，同時(shí)避免傳統(tǒng)大粒徑的脂 質(zhì)體很容易被體內(nèi)的單核巨噬系統(tǒng)所吞噬，從而被迅速清除掉的缺點(diǎn)。4、本發(fā)明用乙醇注
6入法制備空白脂質(zhì)體，較薄膜分散法更容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，并解決了脂質(zhì)體粒徑分布不均的 問題。5、本發(fā)明用硫酸銨梯度法主動(dòng)載藥，解決了水溶性藥物包封率低的問題，同時(shí)其酸性 內(nèi)水相的環(huán)境可使伊立替康保持其內(nèi)酯環(huán)活性結(jié)構(gòu)，更好的發(fā)揮其抗癌效應(yīng)。根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典2005年版第二部，對(duì)本發(fā)明伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì) 體及其制劑的質(zhì)量進(jìn)行檢查，結(jié)果表明，伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體形態(tài)粒徑分布均一，包 封率達(dá)90%以上，滲漏率低，氧化指數(shù)低，穩(wěn)定性良好。本發(fā)明具體制備方法，由以下實(shí)施實(shí)例舉例說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍，不局限于 此。


圖-1是伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體粒徑分布圖。圖-2是伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體與鹽酸伊立替康注射劑體外釋放曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的制備。選取PEG-DSPE作為制備長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的附加劑，將磷脂，膽固醇，泊洛沙姆188， ^溶解于乙醇溶液中，在55°C水浴攪拌條件下注入溶解了 PEG-DSPE的硫酸銨溶液中，磷脂 濃度為100mg/ml，磷脂、膽固醇、泊洛沙姆188,PEG-DSPE質(zhì)量比為3 1 0. 6 0. 3，通N2條件 下保溫?cái)嚢?. 5-lh，所得長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體在生理鹽水中透析過夜，調(diào)節(jié)外相pH為7-7. 5， 在55°C水浴條件下加入伊立替康溶液(伊立替康/磷脂質(zhì)量比1:10)孵育5-15min，即得 伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體。本實(shí)施例制備的伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果如下
該批次制得的伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體粒徑為80-150nm(圖1)，表面光滑圓整，且粒 度均一，分布均勻。透析法測(cè)包封率，采用紫外風(fēng)光光度計(jì)于370 nm處檢測(cè)，測(cè)定吸光度。 本實(shí)施例制備的伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體經(jīng)檢驗(yàn)測(cè)定計(jì)算，其包封率為95. 3%，載藥量為 9. 53 %。
進(jìn)行伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體體外釋放測(cè)定，并與鹽酸伊立替康溶液比較，計(jì)算體 外累積釋放度。以PBS CpH 7.0)為釋放介質(zhì)，分別精密吸取一定量鹽酸伊立替康脂質(zhì)體和 注射劑溶液(含主藥IOmg)，加至經(jīng)預(yù)處理過的透析袋(截留分子量1000)中，將袋口扎緊， 固定于槳上，置于裝有500mL PBS緩沖液的溶出杯中，37°C恒速lOOr/min，定時(shí)吸取4mL透 析液，并及時(shí)補(bǔ)充等量恒溫的PBS。分別測(cè)定3批樣品，體外釋放曲線見圖2。結(jié)果如圖可 知，鹽酸伊立替康溶液釋放較快，Ih釋放32%左右，9h即釋放87%，一天即釋放完全；而脂質(zhì) 體釋放較慢，2h釋放23%左右，具有突釋效應(yīng)，12h釋放55%，12h后進(jìn)入釋放相對(duì)平穩(wěn)的緩 釋相，2天釋放率為75%，7天后累計(jì)釋放率達(dá)到90%，具有明顯的緩釋效應(yīng)，表明制得的長(zhǎng)循 環(huán)脂質(zhì)體具有緩釋釋放藥物的特征，可以延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，有長(zhǎng)效的作用。脂質(zhì)體初步穩(wěn)定性考察4°C冰箱貯存脂質(zhì)體，定期取樣，用測(cè)定包封率的方法測(cè) 定脂質(zhì)體包封量，與貯存前包封的藥量比較，計(jì)算滲漏率，實(shí)施例制備的伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納 米脂質(zhì)體經(jīng)檢驗(yàn)測(cè)定計(jì)算，其滲漏率為14. 5%。實(shí)施例2、伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的制備
選取PEG2000作為制備長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的附加劑，將磷脂，膽固醇，泊洛沙姆188，VE溶解 于乙醇溶液中，在55°C水浴攪拌條件下注入溶解了 PEG2000的硫酸銨溶液中，磷脂濃度為100mg/ml，磷脂、膽固醇、泊洛沙姆188、PEG2000質(zhì)量比為10:5:2:1，通N2條件下保溫?cái)嚢?0. 5-lh，所得長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體在生理鹽水中透析過夜，調(diào)節(jié)外相pH為7.5，在55°C水浴條 件下加入伊立替康溶液(伊立替康/磷脂質(zhì)量比1:10)孵育5-15min，即得伊立替康長(zhǎng)循環(huán) 納米脂質(zhì)體。本實(shí)施例所得伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)粒徑在80-150nm，表面光滑圓整，且粒度 均一，分布均勻。包封率為92. 7%，載藥量為9. 27%，滲漏率為15. 4%。實(shí)施例3、伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體注射劑的制備
將實(shí)施例1和2制備所得伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后，充氮?dú)?灌裝于安剖瓶中，即得伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的注射液。實(shí)施例4、伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體凍干粉針劑的制備
本實(shí)施例制備脂質(zhì)體時(shí)，將磷脂，膽固醇，泊洛沙姆188，Ve溶解于乙醇溶液中，在55°C 水浴攪拌條件下注入補(bǔ)加了蔗糖(蔗糖/磷脂質(zhì)量比為5:1)的溶解了 PEG-DSPE的硫酸銨 溶液中，磷脂濃度為100mg/ml，磷脂、膽固醇、泊洛沙姆188、PEG-DSPE質(zhì)量比為10:5:2:1, 通N2條件下保溫?cái)嚢?. 5-lh，所得長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體在生理鹽水中透析過夜，調(diào)節(jié)外相pH 為7. 5，在55°C水浴條件下加入伊立替康溶液(伊立替康/磷脂質(zhì)量比1:15)孵育5-15min， 將所得伊立替康長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體溶液經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后，置于安剖瓶中，預(yù)凍48h后經(jīng) 冷凍干燥，充氮?dú)夥饪诤蠹吹靡亮⑻婵甸L(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的凍干粉針劑。參考文獻(xiàn)HsiangYH, Hertzber R, Hecht S, et al. Camptothecin induced protein-linked DNA breaks vis mammalian DNA topoisomerase I [J]. J Bio Chem, 1985， 260 (27): 14873-14878.曾云，周黎明.喜樹堿類藥物作用機(jī)制及其耐藥現(xiàn)狀的研究進(jìn)展[J].四川生理 科學(xué)雜志，2007，29 (1) 31-33.王麗焱.抗腫瘤藥伊立替康的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)，2004，2 (13) 7-11.蔣正立，朱萍.納米脂質(zhì)體研究新進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2008，20(11):5-7.MessererCL, Ramsay EC, Waterhouse D, et al. Liposomal irinotecan formulation development and therapeutic assessmet in murinexenograft models of colorectal cancer[J], Clin Cancer Res, 2004, 10(19): 6638-6649.SadzukaY, Hirotsu S, Hirota S. Effect of liposomalization on the antitumor activity, side-effects and tissue distribution of CPT-Il[J]. Cancer Lett,1998， 127(1-2): 99-106.黃敏，丁健.拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2007，16 (13) 990-1000.韓婷.鹽酸伊立替康脂質(zhì)體的制備[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2008，6(17):36-38.張儉儉，張佳佳，楊建坤.鹽酸伊立替康脂質(zhì)體的制備及體外釋藥特性研究[J]. 中國(guó)藥房，2008，19 (10) 762-764.張自強(qiáng)，朱家璧，姚靜等.pH梯度法制備伊立替康脂質(zhì)體[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008，39(4) 312-316.
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權(quán)利要求
一種伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體，其特征在于，該脂質(zhì)體成分包括伊立替康、磷脂、膽固醇、泊洛沙姆188和聚乙二醇類化合物；組成比例為磷脂:膽固醇:泊洛沙姆188:聚乙二醇類化合物:伊立替康=100:(20 50):(10 40):(8 15):(5 20)；活性成分為鹽酸伊立替康；泊洛沙姆188為增溶劑和分散劑；聚乙二醇類化合物為PEG DSPE或PEG2000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種伊立替康的長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體，其特征在于所述伊立 替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的粒徑在80-150nm之間，包封率達(dá)90%以上，載藥量在8%_15%。
3.一種制備權(quán)利要求1所述伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的方法，其特征在于，采用乙 醇注入聯(lián)合硫酸銨主動(dòng)載藥法制備，制備過程包括以下步驟采用乙醇注入法制備長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體將濃度為75-150mg/ml的磷脂、膽固醇和泊洛沙姆188按照一定質(zhì)量比溶于乙醇中形成溶液A，其中磷脂與膽固醇質(zhì)量比為 5:1-2:1,磷脂與泊洛沙姆188質(zhì)量比為10 1-5 2 ；在水浴攪拌下將溶液A注入溶解了聚乙 二醇類化合物的濃度為0. 15-0. 25mol/L的硫酸銨溶液水化介質(zhì)中，其中磷脂與聚乙二醇 類化合物質(zhì)量比為20:1-5:1，乙醇溶液與水化介質(zhì)的體積比為1:5-1:2 ；—定溫度通N2條 件下保溫?cái)嚢?. 5-lh，形成空白脂質(zhì)體；b、將a所得空白脂質(zhì)體在生理鹽水中透析8-12h;c、將伊立替康藥物濃度按磷脂/伊立替康質(zhì)量比為201-10:1配制成伊立替康溶液 加入空白脂質(zhì)體中，調(diào)節(jié)外相PH7. 0-7. 5，在一定溫度下孵育8-12min進(jìn)行載藥即得伊立替 康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的一種伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在 于在步驟a形成的水化介質(zhì)中加入蔗糖或甘露醇等凍干保護(hù)劑，將所得的伊立替康長(zhǎng)循 環(huán)納米脂質(zhì)體在液氮或低溫裝置凍結(jié)，然后在凍干機(jī)上干燥，用于制備其凍干粉針劑；磷脂 與保護(hù)劑的質(zhì)量比為1/10-1/5。
5.根據(jù)權(quán)利要求書4所述的一種伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體的制備方法，其特征在 于采用微孔濾膜過濾除菌得到無菌制劑。全文摘要
本發(fā)明提供了伊立替康的一種新型載體——長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體，及其制備新方法——乙醇注入聯(lián)合硫酸銨主動(dòng)載藥法。制備過程如下a、將用于形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)物質(zhì)溶于乙醇中形成溶液；b、將聚乙二醇類化合物溶解于硫酸銨溶液中作為水化介質(zhì)；c、將a所得溶液在水浴攪拌下注入b所得水化介質(zhì)中，通N2條件下保溫?cái)嚢枰欢〞r(shí)間，形成長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體；d、將c所得空白脂質(zhì)體在生理鹽水中透析；e、將伊立替康溶液加入空白脂質(zhì)體中，調(diào)節(jié)外相pH值，在一定溫度下孵育載藥即得伊立替康長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體。該工藝過程簡(jiǎn)單，粒徑80-150nm，包封率達(dá)95%以上，且易得無菌制劑，可滿足產(chǎn)業(yè)化的要求。
文檔編號(hào)A61K47/28GK101953792SQ20101027329
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者何剪太, 何穎, 劉勇, 張陽德, 李堅(jiān), 陳玉祥, 陳長(zhǎng)生 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部肝膽腸外科研究中心;中南大學(xué)