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用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法

文檔序號:5906096閱讀:732來源:國知局
專利名稱:用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法
技術領域
本發(fā)明屬于納米材料和生物技術領域,涉及納米生物技術,具體地說是一種用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法。
背景技術
對于生物和生物醫(yī)學檢測,熒光納米晶是一種具有潛在應用價值的熒光探針,傳統(tǒng)的熒光探針一般使用的是有機染料。有機染料作為生物檢測探針,它存在著許多弊端,主要表現(xiàn)在有機染料所發(fā)射的熒光光譜的半峰寬是熒光納米晶發(fā)射熒光光譜半峰寬的3-5倍左右,這將帶來光譜的重疊,影響檢測的靈敏度,同時有機染料的激發(fā)波長要比熒光納米晶要窄,這就限制了激發(fā)光源的范圍,也就是一種染料必須用一種特定波長的光激發(fā),而具有廣泛的激發(fā)光譜,所以可以用一個寬范圍內的光作為激發(fā)光源而能使熒光納米晶均能發(fā)射熒光。另外,有機染料在光輻射下是不穩(wěn)定的,一般熒光納米晶的熒光壽命大約是有機染料的20倍。
對于納米晶用于熒光免疫檢測國際上最早使用的是金納米晶,并且現(xiàn)在已經(jīng)商品化。它的基本原理主要利用金的金屬反射顏色。首先用化學溶膠-凝膠方法合成表面帶有負電荷的金納米晶,然后通過靜電相互作用使這種納米金與抗體的正電區(qū)連接。最后讓這種帶有抗體的納米金通過帶有抗原的層析試紙,抗體與抗原的特異性識別將抗體截住,金納米晶聚集而顯色。這種金標的探針可以滿足一種抗體的檢測,但是對于多種抗體同時檢測是不能夠實現(xiàn)的。
熒光納米晶(主要是CdSe納米晶)由于在達到納米尺寸范圍內,其尺寸的變化會帶來發(fā)射熒光波長的改變,因此通過控制合成條件,可以得到不同尺寸的CdSe納米晶,也就得到了在可見光范圍內的發(fā)射不同波長的納米晶,由此人們將CdSe納米晶開發(fā)作為生物多色標記的潛在的材料,但是對于解決它與生物的相容性問題確是現(xiàn)在國際上所面臨一難點。早在1998年,聶書明和Alivasatos就在Science上發(fā)表了將CdSe納米晶用于生物檢測的文章,前者利用CdSe納米晶表面帶的巰基乙酸的羧基端與蛋白的氨基端通過縮合反應偶連到一起,然后在Hela細胞中培養(yǎng)帶有轉鐵蛋白的和不帶蛋白的熒光納米晶,然后通過熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)帶有轉鐵蛋白的熒光納米晶被帶進了細胞中,細胞中出現(xiàn)了熒光納米晶的熒光。同時Alivasatos也用帶有表面功能團的SiO2對CdSe進行了表面修飾,再與生物連接,在檢測的過程中也得到了同樣的結果。但是這兩種方法的缺點在于熒光納米晶在與蛋白偶連的過程中,將帶來熒光納米晶和蛋白的聚集和沉降。另外,對于巰基修飾的量子點,巰基是過量的,這樣蛋白在與巰基乙酸的作用過程會造成蛋白與溶液中游離的巰基乙酸結合,這會影響檢測的靈敏度。接著在2000年聶又用聚苯烯小球對熒光納米晶進行了包覆,但由于聚苯烯小球在溶液中會出現(xiàn)溶漲問題,結果使得熒光納米晶泄漏,這也限制了納米晶的應用。因此發(fā)明能夠有效的包覆量子點,并且具有生物相容性的復合體系是解決目前問題的關鍵。

發(fā)明內容
本發(fā)明通過合成高熒光特性的半導體材料,選用具有雙親集團的物質并且與生物組織相接近的磷脂類化合物對納米材料進行包覆,目的是提供一種用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法。
在結合國際上進行量子點包覆的基礎上,本發(fā)明從兩個方面來考慮這個問題,第一,合成的量子點表面帶有的配體是一種疏水基團,這使得合成出的量子點必須在有機相中存在,但對于生物檢測則要求合成出的熒光納米晶應轉移到水相,這就涉及到相轉移的過程。第二,熒光納米晶要與生物連接,那么所選用的熒光納米晶表面包覆材料必須是生物相容性的?;谶@兩點,本發(fā)明在合成高熒光特性的半導體材料的基礎上,選用了具有雙親集團的并且與生物組織相接近的磷脂類化合物對納米材料進行包覆。這種通過微乳反應的包覆一方面解決了相轉移的問題,另一方面包覆之后的復合材料表面會帶有很強的負電荷,形成一種可直接與蛋白相連接的條件,通過靜電作用可以直接將囊泡與蛋白連接到一起。本發(fā)明對于油相合成CdSe的納米晶的相轉移及其與生物偶連等問題提出具體的解決方案。
一、制備具有高熒光特性的CdSe半導體納米晶半導體納米晶是由數(shù)目極少的原子或分子組成的原子或原子團簇。對于油相合成的CdSe納米粒子,通過改變反應的實驗條件可以獲得不同尺寸的納米晶,因為晶體的尺寸是與發(fā)光相關的,不同發(fā)射波長對應不同的粒子尺寸,也就是對應不同尺寸的納米晶,因此可以通過控制反應條件在可見區(qū)內得到不同發(fā)射顏色的納米晶。
本發(fā)明合成半導體CdSe納米晶經(jīng)過如下過程。首先將CdO與硬脂酸同時放入到一個反應容器中,混合攪拌并加熱,生成硬脂酸鎘,再將溫度降至室溫,使硬脂酸鎘固化。另將三辛基氧化磷(TOPO)和十六烷基胺(HDA)放入到上述反應容器中,并同時升溫,在此溫度下向反應容器中注入Se的配體溶液。這些是常規(guī)的合成膠體的方法,彭笑剛等在2002年已在美國化學學會雜志(JACS)發(fā)表過具體的合成方法。
由于CdSe納米晶的發(fā)光是在可見光范圍內,不同尺寸的納米晶會發(fā)出不同波長的熒光。這些使得人們致力于開發(fā)CdSe納米晶用于生物熒光標記,這種熒光納米晶用于熒光標記與傳統(tǒng)的熒光染料相比具有許多的優(yōu)越性,例如窄的發(fā)射波長,寬的激發(fā)波長,光化學的穩(wěn)定性。但是,按上述方法合成的CdSe由于其表面有懸鍵,這些懸鍵構成了無輻射發(fā)射的中心,因此降低了CdSe發(fā)射熒光的效率。為了提高納米晶的熒光效率,要對CdSe納米晶的表面進行修飾。本發(fā)明是在傳統(tǒng)的兩步法合成核殼納米晶的基礎上,提出了一步法控制合成不同熒光效率的核殼納米晶的方法。具體作法是在按上述方法合成CdSe納米晶的過程中,注入的Se配體是過量,注入Se的量比Cd多20%~30%。在完成CdSe納米晶的生長之后,直接向體系中注入硬脂酸鋅甲苯溶液,由于體系中Se是過量的并吸附在CdSe表面,當硬脂酸鋅注入后,鋅將直接與Se結合形成具有ZnSe殼層結構為CdSe/ZnSe-TOPO脂溶性CdSe熒光納米晶,ZnSe層抑制了無輻射發(fā)射,提高了CdSe晶體的熒光效率。
對于晶體尺寸的控制,主要是利用晶體的生長過程是一個吸熱的過程,控制Se溶液的注入溫度,并選定在注入溫度之下的一定范圍內的生長溫度,就可以得到一系列尺寸的CdSe納米晶,反應在光譜上是對應著不同波長的熒光光譜,它們所發(fā)射的熒光顏色主要是從蘭色到紅色共八種。這對于生物熒光標記是非常有意義的。具體的合成反應如下
二、制備復合有CdSe/ZnSe納米晶的熒光囊泡為了獲得生物兼容性的半導體材料熒光復合體,需要將脂溶性的熒光納米晶由有機相轉移到水相,囊泡對熒光納米晶的包覆完成了相轉移,并同時使其具有生物相溶性。囊泡的熒光發(fā)光性質由囊泡中納米晶的性質及不同種類的熒光納米晶的配比決定。本發(fā)明采用的是反相膠束法制備囊泡包覆的熒光納米晶。
反相膠束法包覆熒光納米晶合成囊泡的具體步驟如下(1)首先將脂溶性的熒光納米晶與磷脂、膽固醇、高分子材料共同溶在非極性有機溶劑中,然后將混合體系用常規(guī)的方法在氮氣條件下吹干,在容器表面形成薄的單層膜,單層膜需繼續(xù)在通氮的條件下干燥1-2小時。所述的磷脂是電中性的卵磷脂(PC)、磷脂酰胺(PE)和帶負電性的磷脂,如磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)。在形成囊泡的過程中,磷脂是主要成分,電中性的磷脂可以單獨使用,也可以將電中性的磷脂與負電性的磷脂混合使用,不同做法最終決定所形成囊泡的表面電勢。膽固醇是一種中性脂質,主要作用是與磷脂相結合,阻止磷脂凝結成晶體結構。所述的高分子材料主要的作用是阻止囊泡之間的非特異性吸附,從而導致的囊泡聚集。高分子材料可以是聚乙烯醇(PEG),也可以是聚丙烯酰胺。有機溶劑采用的是非極性的溶劑,如氯仿,乙醚,正己烷等。
(2)將上述形成的單層膜加入上述非極性的有機溶劑,使單層膜溶解,然后再加入10~40ml磷酸緩沖溶液(PBS),此時溶液中形成水油兩相。為了使兩相乳化從而形成復合熒光納米晶的囊泡,需將此溶液在磁力攪拌器上劇烈攪拌使之乳化。向乳化后的材料中再次加入20~30mlPBS緩沖溶液并進一步攪拌,從而形成分散的、尺寸均一的復合熒光囊泡。
乳化之前形成的單層膜主要是熒光納米晶與磷脂,膽固醇等形成的單層有序排列,這是一種反相的排列,即在非極性有機相中,親油端朝外的反相膠束排列。但在乳化之后,這種有序的排列被打破,在加入水之后,形成磷脂類的親水端朝外的雙脂質層結構,此時熒光納米晶被包覆在雙層中間,既形成所需的復合熒光囊泡。
通過上述方法,合成了尺寸均一,熒光效率達到50%~70%的不同尺寸的CdSe/ZnSe半導體納米晶。將這些有機相合成的CdSe/ZnSe納米晶通過磷脂類的材料對其進行表面修飾包覆,得到了生物相容性的復合熒光囊泡。
三、復合熒光囊泡與蛋白的偶連通過改變囊泡溶液的PH來調節(jié)囊泡的表面電位,得到不同表面電位的囊泡。通過靜電作用可以使囊泡與蛋白或核酸的帶電區(qū)結合從而形成熒光生物探針。利用這種生物探針可以實施對病毒,毒品,多基因片段的生物免疫檢測。
本發(fā)明主要是利用免疫層析試紙如硝酸纖維素膜對乙肝病毒,蔬菜中殘留農(nóng)藥,以及對毒品的檢測。試紙條證明了這種復合熒光囊泡能夠用于生物檢測。這一發(fā)明首次選用囊泡作為包覆材料,并通過層析試紙進行免疫檢測的方法。它將親脂性表面CdSe納米晶進行了相轉移并構建使之具有生物相容性。


圖1為通過在不同的溫度下生長而得到不同尺寸的CdSe納米晶所對應的不同波長的發(fā)射光譜。
圖2為用于免疫檢測的層析試紙條基本構造的示意圖。
圖3為帶有納米晶抗體與抗原的特異性識別的示意圖。
具體實施例方式
1、制備CdSe/ZnSe核殼結構的納米晶選取99.9%的CdO0.0128-0.0150g,Se粉0.079-0.158g,硬脂酸0.114-0.328g。
在140-150℃之間,CdO與硬脂酸反應生成硬脂酸鎘,再將生成物的反應容器降至室溫,并在室溫的條件下向容器中加入TOPO、HDA,然后將反應器的溫度升至300-320℃,在此溫度下向體系中注入TOPSe,,注入之后迅速降溫,降溫區(qū)間為250~280℃,不同降溫時間可以得到不同尺寸的納米晶,即得到了尺寸從3~5nm的納米晶。晶體的熒光顏色隨著時間的加長逐漸紅移,即從綠色逐漸變?yōu)榧t色。圖1顯示了在上述條件下合成的不同尺寸的熒光光譜。在合成不同CdSe納米晶的基礎上,向體系中直接注入Zn,Zn與CdSe表面上過量的Se結合生成CdSe/ZnSe核殼結構。
2、制備復合熒光納米晶囊泡選用的材料是90%蛋黃卵磷脂(PC)、磷脂酰氨(PE),膽固醇(Ch)和聚乙烯醇(PEG)。首先按重量比蛋黃卵磷脂PC50-70%,膽固醇Ch20-30%,磷脂酰氨PE5-10%,聚乙烯醇PEG0.5-1%的比例關系稱取,并將這些材料溶在3ml氯仿中并放入一反應容器中,同時取0.5-3毫克的CdSe/ZnSe核殼納米晶溶入上述體系中。將混合溶液吹干,然后再次向瓶中加入體積比為40∶1的水和氯仿混合液,接下來劇烈攪拌2小時得到乳白色的粘稠液體。向體系中再次加入25毫升PBS緩沖溶液繼續(xù)攪拌直至形成分散的乳液;通過電鏡可以確定所形成的囊泡的尺寸為50~200納米,比較復合前后的發(fā)光光譜可以認為半導體納米晶在復合前后的發(fā)光特性沒有改變。在調節(jié)囊泡溶液的PH從6-9的變化過程中,囊泡表面的電位也發(fā)生改變,既隨著PH增加,表面的負電勢將增大。
本發(fā)明選取PH為8-9的PBS作為囊泡的母液,用電位分析儀測定表面電勢平均為-30~-48mev。
3、復合熒光囊泡同蛋白的偶連(1)復合熒光囊泡用于乙肝病毒免疫檢測。
這里分三個步驟進行a)將帶有抗乙肝單抗的硝酸纖維素膜的干的試紙條的低部吸水區(qū)(試紙條的結構如圖2所示)放入到合成的熒光復合囊泡溶液中,由于毛吸作用,囊泡被吸附到試紙條上,同時在檢測限位置由靜電作用被檢測限上的抗體攔截而使囊泡非特異性吸附在試紙條上。這樣在檢測線上用熒光分光光度計可以探測到有熒光。這一步的目的是檢測囊泡與試紙條上的孔隙的匹配性。b)采用1%牛血清白蛋白(BSA)溶液使其與囊泡在4℃的冰柜中攪拌12小時,此時BSA作為封閉劑已與囊泡結合,這樣囊泡的表面完全被BSA所包覆。然后在將同樣的試紙條侵入到此溶液中,發(fā)現(xiàn)在檢測限上無熒光,這可以認為泡囊與BSA結合,并被封閉上了。c)最后將泡囊與乙肝抗原在4℃冰柜中再反應12小時,然后用BSA封閉,再重復將相同的試紙條侵入到此溶液中,這時在檢測限觀察到熒光,由此可確定囊泡已與抗體偶連,并可以用此來進行乙肝病毒的檢測。
(2)蔬菜中殘留農(nóng)藥的高靈敏度檢測。
將培植的抗農(nóng)藥單抗1毫克/毫升,滴加于硝酸纖維素膜上3微升,空氣干燥后采用1%PEG封閉,將封閉后的侵入待檢測的蔬菜的洗液中,侵入大約1小時,經(jīng)4次洗滌后,烘干。再制備的抗農(nóng)藥抗原-熒光復合囊泡偶連體。將含有抗農(nóng)藥單抗的硝酸纖維素膜侵入到上述得到的熒光偶連體物溶液中,在侵1小時,再用PBS緩沖溶液洗滌5次,采用熒光分光光度計探測膜上的熒光強度,以判定蔬菜中農(nóng)藥的含量。
(3)本發(fā)明另一種實施方式是,在制備囊泡的過程中選用了中性磷脂PC與負電性的磷脂酰甘油PG結合,并按上述制備囊泡的過程制備囊泡,得到的囊泡表面帶負電,這種方法直接通過調節(jié)PG的含量,并不需要調節(jié)PH即可得到表面帶負電的囊泡。其中PC的重量含量為70-80%,PG為9-20%,Ch為9-20%,PEG為0.5%-1%。
權利要求
1.一種用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法,包括制備具有熒光特性的納米晶,該納米晶與蛋白的氨基端通過縮合反應偶連等過程,其特征是在制備CdSe納米晶的過程中,注入過量的Se配體,對CdSe納米晶的表面進行修飾,注入Se的量比Cd多20%~30%,形成結構為CdSe/ZnSe-TOPO的脂溶性CdSe熒光納米晶;用反相膠束法包覆CdSe熒光納米晶合成囊泡;通過改變上述囊泡溶液的PH來調節(jié)囊泡的表面電位,得到不同表面電位的囊泡。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法,其特征是在合成核殼納米晶的基礎上,直接向體系中注入硬脂酸鋅甲苯溶液,使Se比Cd過量,其過程可表示為所述的反相膠束法包覆過程是,將脂溶性的熒光納米晶與磷脂、膽固醇、高分子材料共同溶在非極性有機溶劑中,混合體系用常規(guī)的方法在氮氣條件下吹干,在容器表面形成薄的單層膜,單層膜繼續(xù)在通氮的條件下干燥1-2小時,然后將上述形成的單層膜加入上述非極性的有機溶劑,使單層膜溶解,再加入10~40mlPB緩沖溶液,溶液中形成水油兩相,在磁力攪拌器上劇烈攪拌使之乳化,乳化后進一步超聲,形成分散的、尺寸均一的復合熒光囊泡。
3.根據(jù)權利要求2所述的用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法,其特征是所述的磷脂是電中性的卵磷脂(PC)、磷脂酰胺(PE)和帶負電性的磷脂,高分子材料可以是聚乙烯醇(PEG)、也可以是聚丙烯酰胺,非極性有機溶劑為氯仿、乙醚或正己烷。
4.根據(jù)權利要求3所述的用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法,其特征是所述的磷脂是電中性的卵磷脂(PC)、磷脂酰胺(PE)。
5.根據(jù)權利要求3所述的用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法,其特征是帶負電性的磷脂為磷脂酰甘油(PG)或磷脂酰肌醇(PI)。
6.根據(jù)權利要求4所述的用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法,其特征是所用的蛋黃卵磷脂PC重量比50-70%,膽固醇Ch重量比20-30%,磷脂酰氨PE重量比5-10%,聚乙烯醇PEG重量比0.5-1%;將上述材料溶在3ml氯仿中并放入一反應容器中,同時取0.5-3mg的CdSe/ZnSe核殼納米晶溶入上述體系中;混合溶液吹干,再次向瓶中加入體積比為40∶1的水和氯仿混合液,接下來劇烈攪拌2小時;選取PH為8-9的磷酸緩沖溶液(PBS)作為囊泡的母液,調節(jié)囊泡溶液的PH從6-9。
7.根據(jù)權利要求5所述的用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法,其特征是選用中性卵磷脂PC與負電性的磷脂酰甘油PG作為磷脂,其中卵磷脂PC的重量含量為70-80%,磷脂酰甘油PG為9-20%,膽固醇Ch為9-20%,聚乙烯醇PEG為0.5-1%。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米材料和生物技術領域,是一種用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡的制備方法。通過合成高熒光特性的半導體材料,選用具有雙親集團的物質并且與生物組織相接近的磷脂類化合物對納米材料進行包覆,合成用于熒光免役檢測的CdSe納米晶復合脂質體微囊泡。本發(fā)明包括制備油性CdSe半導體納米晶,復合油性納米晶囊泡的合成及通過改變pH值來調節(jié)表面電位從而使囊泡與生物蛋白通過靜電連接等三個步驟。本發(fā)明主要是利用免疫層析試紙如硝酸纖維素膜對乙肝病毒,蔬菜中殘留農(nóng)藥,以及對毒品的檢測。試紙條證明了這種復合熒光囊泡能夠用于生物檢測,將親脂性表面CdSe納米晶進行了相轉移并構建使之具有生物相容性。
文檔編號G01N21/64GK1542452SQ20031011000
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月6日 優(yōu)先權日2003年11月6日
發(fā)明者單桂曄, 孔祥貴, 馮力蘊 申請人:中國科學院長春光學精密機械與物理研究所, 中國科學院長春光學精密機械與物理研
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