專利名稱：中藥杏仁在溶菌酶海藻酸鈉微球中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥杏仁作為腸道吸收促進(jìn)劑的新用途，特別是中藥杏仁在溶菌酶海 藻酸鈉微球中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
溶菌酶(Lysozyme)是一種有效的抗菌劑，能使細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)的不溶性多糖分解 成可溶性糖肽，細(xì)菌內(nèi)容物逸出，使革蘭氏陽性菌溶解。在生物體內(nèi)環(huán)境中，由于有分泌型 免疫球蛋白A和補(bǔ)體參與，溶菌酶還能水解某些革蘭陰性菌。同時(shí)溶菌酶也參與生物體內(nèi) 的多種免疫反應(yīng)，改善和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的吞噬功能，從而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。它還 能激活血小板功能，改善局部組織的血液循環(huán)障礙，起到止血、消腫、加快組織修復(fù)的作用。市面上溶菌酶作為化學(xué)藥物有溶菌酶含片、溶菌酶腸溶膠囊等，其作用多是在消 化道中抗菌消炎，而不能通過腸道屏障進(jìn)入血液循環(huán)，其體內(nèi)的生物利用度很有限。鑒于溶 菌酶在體內(nèi)的重要作用，為提高溶菌酶的血藥濃度，目前已有溶菌酶的注射制劑申請專利， 可應(yīng)用于治療由耐藥菌引起的各種炎癥及感染性疾病。但注射給藥不僅使病人的順應(yīng)性 差，而且頻繁給藥給病人造成很多不便?？诜o藥作為更安全、方便的給藥途徑長期以來被人們廣泛關(guān)注，由于消化系統(tǒng) 對口服蛋白類藥物的分解，使其體內(nèi)吸收效率低下，而微球等藥物載體能保護(hù)蛋白類藥物 的穩(wěn)定，使其不受蛋白酶的降解。眾多研究表明載藥微球具有良好的負(fù)載、控釋等作用，還 有一定的靶向性。其中海藻酸鈉微球因其天然高分子材料的特點(diǎn)，具有良好的生物相容性 和可生物降解性，適用于蛋白類藥物的口服給藥(Machluf M，0rsola A，Atala A，Contmlled release of therapeutic agents :slow delivery and cell encapsulation, World J. Urol, 2000,18 (1) =80-83.)。適合海藻酸鈉微球制備的W/0乳化-離子交聯(lián)法不僅制作 工藝簡單，乳化及離子交聯(lián)過程在室溫下進(jìn)行，而且不使用戊二醛等交聯(lián)劑，更有利于蛋白 ML夕舌個(gè)生白勺## (N. H. Cho, S. Y. Seong, K. H. Chun, et al, Novel mucosal immunization with polysaccharide-protein conjugates entrapped in alginate microspheres, J.Controlled Release,1998，53 :215_224.)。為增加蛋白類藥物的生物利用度，在藥物口服后需保護(hù)其生物活性并促進(jìn)胃腸道 對其的吸收。雖然藥物載體能提高蛋白類藥物的穩(wěn)定性，但在腸道促進(jìn)吸收方面仍需要各 類促進(jìn)劑的輔助，才能真正提高蛋白類藥物的血藥濃度。目前的腸道吸收促進(jìn)劑分為小分 子和聚合物兩種，如中鏈脂肪酸鈉鹽、膽酸鹽類、一氧化氮供體等為小分子類吸收促進(jìn)劑， 而聚合物類吸收促進(jìn)劑有殼聚糖、交聯(lián)聚丙烯酸酯等。其中多數(shù)吸收促進(jìn)劑的作用與其細(xì) 胞毒性高度相關(guān)，所以無毒而有效的腸道吸收促進(jìn)劑是研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。中藥作為我國中醫(yī)的特有藥物，從豐富的中藥材中篩選獲得與現(xiàn)有的腸道吸收促 進(jìn)劑功能相同的藥物，有望找到毒性小、安全性好的新型腸道吸收促進(jìn)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中藥杏仁作在溶菌酶海藻酸鈉微球中作為腸道吸收促 進(jìn)劑的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)中藥材——杏仁(Bitter Apricot Seed)，杏仁歸屬肺、脾、大腸經(jīng)，在中醫(yī)中起祛 痰止咳、平喘、潤腸、下氣開痹的功效。溶菌酶海藻酸鈉微球按文獻(xiàn)參考采用W/0乳化-離子交聯(lián)法制備采用W/0乳 化-離子交聯(lián)法制備溶菌酶微球，以含海藻酸鈉和溶菌酶的溶液作為水相，以加入Span-80 的1-辛醇作為油相。將水相加入油相中，探針式超聲2min，形成W/0乳劑。在磁力攪拌下， 緩慢滴加氯化鈣(CaC12)溶液，滴加完畢后持續(xù)攪拌lOmin交聯(lián)固化。最后用異丙醇洗滌 微球懸濁液，離心分離微球，真空干燥。選擇海藻酸鈉的濃度為5% (W/V)，溶菌酶的濃度為 1% (W/V)，果糖的濃度為2% (W/V)作為最佳制備工藝條件，制得的微球具有良好的分散性 和穩(wěn)定性，其平均粒徑為(9. 45 士 3. 1) y m,包封率為57.6%，載藥量為7.2%，溶菌酶酶活 為原來的76. 1%.將中藥杏仁按常規(guī)方法煎制得中藥杏仁干重0.4g/ml的湯劑備用；中藥杏仁與溶 菌酶海藻酸鈉微球的質(zhì)量比為14-28 1。本發(fā)明以海藻酸鈉微球作為蛋白類藥物溶菌酶的載體，通過實(shí)驗(yàn)證明了杏仁能明 顯促進(jìn)口服溶菌酶的腸道吸收，提高其生物利用度，并且長期服用該藥物后使溶菌酶在體 內(nèi)的停留時(shí)間延長至一周。本發(fā)明結(jié)果表明，小鼠僅口服溶菌酶溶液后其腸道吸收不足1 %，而小鼠連續(xù)口服 杏仁與溶菌酶微球4天后其溶菌酶的腸道吸收高達(dá)8 %，再次延長口服杏仁與溶菌酶微球 的時(shí)間至14天后小鼠對溶菌酶的腸道吸收超過11%，而且停止給藥后7天內(nèi)仍能在血液中 檢測出溶菌酶?？梢娦尤誓艽蠓却龠M(jìn)溶菌酶海藻酸鈉微球的腸道吸收。


圖1為溶菌酶的間接競爭ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2為溶菌酶海藻酸鈉微球的光學(xué)顯微鏡圖；圖3為中藥杏仁對溶菌酶海藻酸鈉微球的腸道吸收促進(jìn)作用圖；圖4中藥杏仁對溶菌酶的藥效動力學(xué)影響圖(飼喂14天后停藥)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖1-圖4進(jìn)一步說明本發(fā)明是如何實(shí)現(xiàn)的。實(shí)施例1.稱取杏仁4g(10只小鼠用量)用常規(guī)方法煎煮至10ml液體，離心取上清，每只 小鼠口服約1.0ml每次。2.使用間接競爭ELISA法對溶菌酶的血藥濃度進(jìn)行測定間接競爭ELISA法檢測步驟如下①包被0. 5 u g/ml的溶菌酶包被酶標(biāo)板，每孔加入100 yl，置4°C冰箱中過夜。②封閉每孔加入300 u 1封閉液，37°C溫育2小時(shí)。
③競爭每孔加入不同濃度的溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)液50 u 1和抗血清溶液50 u 1，充分混合 后37°C溫育1小時(shí)。④二抗每孔加入HRP-羊抗兔IgG100iil，37°C溫育1小時(shí)。⑤顯色每孔加入底物顯色液100iil，37°C溫育20min。⑥終止每孔加入50 u 1終止液。⑦檢測使用酶標(biāo)儀在490nm處檢測其吸光度。間接競爭ELISA法的線性范圍為0. 1 y g/ml-30 u g/ml之間，回歸方程為y =-0. 0702x+0. 716，線性相關(guān)度為0. 99，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖1。3.溶菌酶海藻酸鈉微球的制備按文獻(xiàn)參考采用W/0乳化-離子交聯(lián)法進(jìn)行 制備，其中加入適量果糖作為蛋白保護(hù)劑，制得的海藻酸鈉微球?yàn)榘咨勰?，光學(xué)顯微鏡 檢測(參見圖2)呈圓形，表面光滑圓整，球體分散均勻，粘連少，不破損，微球的粒徑在
5.6-13. 8 iim 之間，平均粒徑為(9. 45士3. 1) ii m(n = 20)。4.杏仁對溶菌酶海藻酸鈉微球的腸道吸收促進(jìn)作用實(shí)驗(yàn)組小鼠同時(shí)口服杏仁湯劑8_16g/kg和溶菌酶海藻酸鈉微球0. 56g/kg ；中藥 對照組僅口服溶菌酶海藻酸鈉微球0. 56g/kg ；實(shí)驗(yàn)對照組僅口服杏仁湯劑8-16g/kg，連續(xù) 口服4天后，根據(jù)該藥物藥效動力學(xué)曲線，選取8小時(shí)(血藥濃度最高)眼眶取血，檢測溶 菌酶的血藥濃度，結(jié)果參見圖3 實(shí)驗(yàn)組的溶菌酶血藥濃度為(17. 18士5. 22) u g/ml,是實(shí)驗(yàn)對照組血藥濃度的
6.53倍，可見溶菌酶的腸道吸收明顯增加。按小鼠總血量5ml計(jì)，經(jīng)腸道吸收的溶菌酶總量 為85. 90 y g，生物利用度最高達(dá)到8. 59%，較實(shí)驗(yàn)對照組僅為左右的生物利用度，有了 明顯的提高。5.杏仁對溶菌酶的藥效動力學(xué)影響(飼喂14天后停藥)因常規(guī)中藥湯劑以一至兩周為療程，為進(jìn)一步研究杏仁對溶菌酶的腸道吸收和體 內(nèi)有效時(shí)間的維持，各組小鼠喂藥連續(xù)14天，停藥后8小時(shí)以及隔日取血，檢測溶菌酶的血 藥濃度，考察杏仁對溶菌酶的藥效動力學(xué)影響，結(jié)果參見圖4 實(shí)驗(yàn)組停藥后8小時(shí)后溶菌酶血藥濃度為(24. 75士 1. 06) u g/ml，按小鼠總血量 5ml計(jì)，經(jīng)腸道吸收的溶菌酶總量為123. 75 ug,比實(shí)施例一中實(shí)驗(yàn)組的生物利用度提高了 3. 79%，可見適當(dāng)延長服藥周期，可能更有利于中藥作用的發(fā)揮，可以提高溶菌酶的腸道吸 收。實(shí)驗(yàn)對照組小鼠停藥24小時(shí)后血藥濃度為3. 6 ii g/ml，48小時(shí)后接近于0 ；而實(shí) 驗(yàn)組的血藥濃度在停藥24小時(shí)后血藥濃度為14. 55 u g/ml, 48小時(shí)后仍有6. 75 y g/ml，而 且在之后的3 7天內(nèi)實(shí)驗(yàn)組的血藥濃度在(3. 4 1. 9) y g/ml之間，是原吸收最大值的 20%左右，可見較長時(shí)間的連續(xù)服藥后小鼠體內(nèi)溶菌酶的停留時(shí)間有所延長，可能是藥物 的累加作用使溶菌酶在小鼠體內(nèi)維持了 一段時(shí)間。6.血液中溶菌酶的生物活性為驗(yàn)證口服溶菌酶海藻酸鈉微球后經(jīng)腸道吸收的溶菌酶是否仍保持其生物活性， 以實(shí)施例二中各組小鼠停藥后8小時(shí)的血清檢測其酶活，采用溶菌酶微球菌比濁法進(jìn)行檢 測，以其水解溶壁微球菌(Micrococcus luteus)的速度計(jì)算血清中溶菌酶的比活，結(jié)果如 表1所示
表1各組小鼠的溶菌酶血藥濃度及比活
組別溶菌酶血藥濃度(11溶菌酶的比活溶菌酶的活性保存g/ml)(U/wg)率實(shí)驗(yàn)組24. 75±1. 061683. 567. 34%中藥對照組4. 75±3. 841681. 567.26%實(shí)驗(yàn)對照組5. 05±0. 932437. 597.50%*標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶的比活為2500U/mg。實(shí)驗(yàn)組和中藥對照組的溶菌酶生物活性有所損失，通過微球形式吸收的溶菌酶生 物活性的保存約為原來的67%左右，這與微球的制備工藝有關(guān)，使溶菌酶在裝載微球的過 程中損傷了一部分的蛋白活性，但大部分的溶菌酶活性得以保存，并且以較高的腸道吸收 率進(jìn)入體內(nèi)。
權(quán)利要求
中藥杏仁在溶菌酶海藻酸鈉微球中的應(yīng)用，其特征在于將中藥杏仁按常規(guī)方法煎制得中藥杏仁干重0.4g/ml的湯劑備用；采用W/O乳化 離子交聯(lián)法制備溶菌酶海藻酸鈉微球，使用時(shí)，中藥杏仁與溶菌酶海藻酸鈉微球的質(zhì)量比為14 28∶1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥杏仁在溶菌酶海藻酸鈉微球中的應(yīng)用，其特征在于優(yōu) 化制備工藝條件后制得的溶菌酶海藻酸鈉微球的平均粒徑為(9. 45士3. 1) ym，包封率為 57.6%，載藥量為7.2%，溶菌酶酶活為原來的76. 1%。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥杏仁在菌酶海藻酸鈉微球中作為腸道吸收促進(jìn)劑的應(yīng)用，將中藥杏仁按常規(guī)方法煎制得中藥杏仁干重0.4g/ml的湯劑備用；采用W/O乳化-離子交聯(lián)法制備溶菌酶海藻酸鈉微球，使用時(shí)，中藥杏仁與溶菌酶海藻酸鈉微球的質(zhì)量比為14-28∶1。中藥杏仁能明顯促進(jìn)溶菌酶海藻酸鈉微球的口服吸收，大幅度提高溶菌酶海藻酸鈉微球的腸道吸收效率，提高溶菌酶的血藥濃度。并且溶菌酶在體內(nèi)保持良好的生物活性，能較好的行使其生物學(xué)功能。
文檔編號A61P7/04GK101947315SQ20101027332
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者沈彥萍, 沈文婧, 陳宇光 申請人:上海沈李科工貿(mào)有限公司