專利名稱：一種廣譜、低毒性的酞菁類殺菌劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類具有選擇性的新型酞菁類光敏劑的制備方法，及其作為一種廣譜低毒的殺菌劑在牙周病治療方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
使用細(xì)胞毒性物質(zhì)是抑制或殺滅細(xì)菌的方案之一(Photodynamicantimicrobial chemotherapy(PACT).J Antimicrobial Chemotherapy.1998，4213-28)，與傳統(tǒng)的抗菌素相比，具有可抑制或殺滅的細(xì)菌種類范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)它也有選擇性差的弱點(diǎn)。本項(xiàng)發(fā)明設(shè)計(jì)并發(fā)展一種對(duì)細(xì)菌具有選擇親和力的新型殺菌劑，以克服這個(gè)選擇性差的弱點(diǎn)。
光動(dòng)力滅菌化學(xué)療法(Photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)是一種新的治病方法，其特點(diǎn)是利用藥物在特定波長光的作用下產(chǎn)生單線態(tài)氧以殺死細(xì)菌。本發(fā)明的目的是制備對(duì)牙齦卟啉菌具有一定的靶向作用的金屬酞菁化合物，使其在光的作用下能殺死牙齦卟啉菌，而對(duì)鄰近的正常細(xì)胞不至有大的傷害，從而成為治療牙周病的有效藥物。通常的光動(dòng)力療法(Photodynamic Therapy，PDT)主要用于某些實(shí)體惡性腫瘤的治療，已成功地應(yīng)用于膀胱癌、食管癌、支氣管癌、口腔癌、皮膚癌、肋膜間皮瘤、鼻咽癌、喉癌、肝癌、乳腺癌、以及腦癌。最近，光動(dòng)力療法也開始用于其他方面的治療。例如2000年，經(jīng)美國食品藥物管理局批準(zhǔn)的用于光動(dòng)力療法治療老年性視網(wǎng)膜黃斑變性(age related macular degeneration，AMD)的光敏劑Visudyne，是第一個(gè)能夠有效治療老年性黃斑變性的藥物。1993年，光動(dòng)力治療新藥光敏素(photofrin)在加拿大被批準(zhǔn)上市，標(biāo)志著PDT正式成為除手術(shù)、放療和化療以外的第四種成熟的腫瘤治療方法，同時(shí)也掀起了醫(yī)藥界尋找第二代和第三代PDT藥物的高潮。酞菁及其衍生物不但可以用作染料，而且在光電材料、非線性光學(xué)材料、催化劑、光記錄介質(zhì)材料等高科技領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。酞菁及其衍生物以其良好的光熱穩(wěn)定性，光毒性小，在600nm-800nm之間的某一特定波長有強(qiáng)的吸收等優(yōu)點(diǎn)，成為新一代光敏劑中的佼佼者。本項(xiàng)發(fā)明主要是制備一類新型酞菁類光敏劑，并在此基礎(chǔ)上使其與對(duì)細(xì)菌表面有親和力的標(biāo)記物耦合，以增加該光敏劑的選擇性，同時(shí)也減少了它對(duì)正常細(xì)胞的毒性。
口腔疾病中最常見的主要有齲齒和牙周病等。第二次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國成人的恒牙患齲率為49.88％，兒童的乳牙患齲率為76.55％。牙周疾病是由口腔病原菌，如格蘭氏陰性的牙齦卟啉菌的過度增殖所引起的。如不及時(shí)治療，牙周炎將導(dǎo)致牙齒周圍空洞的形成，造成牙齒松動(dòng)，甚至牙齒的早期脫落。抑制或消除口腔病菌的生長，能有效地防治牙周炎或控制疾病的急性發(fā)作，是治療牙周炎的關(guān)鍵?？谇徊【才c身體健康的其他方面有關(guān)，越來越多的研究報(bào)告指出，口腔病菌可能與血管硬化、心臟病突發(fā)、中風(fēng)、早產(chǎn)、甚至腫瘤的發(fā)病有關(guān)。例如，引發(fā)牙周病的細(xì)菌牙齦卟啉菌，曾在人體消化道以及堵塞血管、造成心臟病的堵塞物里面被檢測(cè)出。目前臨床上治療牙周病的潔治術(shù)和根面平整，主要是用機(jī)械的方法去除牙斑或齒垢，近年來，也越來越經(jīng)常附加上抗菌素療法。然而，后者往往會(huì)引發(fā)細(xì)菌的抗藥性及對(duì)口腔微環(huán)境的破壞。因而相當(dāng)多的病人在治療后出現(xiàn)重復(fù)感染，需要進(jìn)一步治療。由此可見，用光動(dòng)力療法消除口腔病菌在齲齒和牙周病防治上有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和重大的實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本項(xiàng)發(fā)明的目的在于公開一種新型酞菁類光敏劑，即2-單羧基取代酞菁鋅與各種氨基酸、多肽及其帶有氨基基團(tuán)的化合物之間的偶合物的合成方法。本項(xiàng)發(fā)明以其中一種化合物2-單羧基取代酞菁鋅-寡聚賴氨酸的偶合物(2-ZnPcC1-PL，其中C1代表單取代羧基，PL代表寡聚賴氨酸)的合成方法為例。并將該光敏劑2-ZnPcC1-PL作為一種對(duì)細(xì)菌具有靶向性質(zhì)的新型抗菌劑應(yīng)用于牙周病方面的治療。目前在國內(nèi)外均未見有此化合物的相關(guān)報(bào)道。
此項(xiàng)發(fā)明采用以無水醋酸鋅為模板劑，鉬酸銨為催化劑，使前驅(qū)物鄰苯二甲酸酐與偏苯三甲酸酐的摩爾比大于3∶1，并在160℃-190℃的固相條件下反應(yīng)3-4小時(shí)，合成出2-單酰胺取代酞菁鋅，然后在90℃-100℃的溫度條件下將2-單酰胺取代酞菁鋅水解，24小時(shí)后得到2-單羧基取代酞菁鋅的粗產(chǎn)物。接下來我們使用硅膠作為固定相，以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)與丙酮作為混合洗脫劑對(duì)2-單羧基取代酞菁鋅的粗產(chǎn)物進(jìn)行反復(fù)的分離，最終得到較純的2-單羧基取代酞菁鋅。最后對(duì)2-單羧基取代酞菁鋅的羧基進(jìn)行活化并與寡聚賴氨酸進(jìn)行偶合得到最終產(chǎn)物2-ZnPcC1-PL。
傳統(tǒng)合成單取代金屬酞菁衍生物的方法(Synthesis of UnsymmetricallySubstituted Subphthalocyanines，Chem.Eur.J.2000，6，No.12)一般是先合成無取代亞酞菁，然后再與含有取代基的前軀物(比如3-羧基鄰苯二甲腈)和金屬一起合成得到最終的單取代金屬酞菁衍生物。而本發(fā)明所采用的方法不但可以減少合成的步驟和操作的復(fù)雜性，而且其中優(yōu)化的分離提純方法是重要的。
本項(xiàng)發(fā)明合成出的2-單羧基取代酞菁鋅由于只帶有一個(gè)羧酸基團(tuán)，因此與多羧基取代酞菁鋅相比，在與寡聚賴氨酸進(jìn)行偶合的過程中避免了大量的交連而引起的產(chǎn)物溶解性的下降。因此單羧基取代酞菁鋅在拓展合成方面更具潛力。
本項(xiàng)發(fā)明的最終產(chǎn)物2-ZnPcC1-PL是通過引入一段具有生物活性的寡聚賴氨酸基團(tuán)，使其表面帶有大量的正電荷。這樣，一方面，由于分子之間的靜電相斥作用，減小了2-ZnPcC1-PL分子之間的聚集；另一方面，由于帶有足量的正電荷，因而促使2-ZnPcC1-PL分子對(duì)表面帶有負(fù)電荷的革蘭氏陰性菌的靶向作用。本項(xiàng)發(fā)明通過涂板計(jì)數(shù)法與MTT法對(duì)細(xì)菌和細(xì)胞的體外活性實(shí)驗(yàn)表明光敏劑2-ZnPcC1-PL對(duì)革蘭氏陰性的牙齦卟啉菌有很好的殺傷作用，但同時(shí)對(duì)人牙周膜細(xì)胞的影響很小(如圖6、圖7所示)。因此這項(xiàng)研究結(jié)果將在牙周病的治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為2-單酰胺取代酞菁鋅的合成示意圖。
圖2為2-單羧基取代酞菁鋅的合成示意圖。
圖3為利用HPLC分析儀在677nm下跟蹤分析分離過程中收集的各組分的示意圖(1)為無取代酞菁鋅的分析曲線；(2)為實(shí)施例一中的最終產(chǎn)物的HPLC分析曲線，根據(jù)曲線可以清楚的判斷出一個(gè)組分為2-單酰胺取代酞菁鋅而另一個(gè)組分為無取代酞菁鋅；(3)為實(shí)施例三層析分離過程中先被洗脫下來的組分的分析曲線，因?yàn)榍€與(2)相當(dāng)?shù)奈呛纤钥梢哉J(rèn)為先被洗脫下來的組分中含有2-單酰胺取代酞菁鋅和無取代酞菁鋅；(4)為實(shí)施例三中第二次重復(fù)分離后洗脫下來的組分的分析曲線；(5)為實(shí)施例三中得到的最終樣品的分析曲線；(6)為洗脫梯度流程，其中A為水，B為N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。
圖4為實(shí)施例三中得到的最終樣品2-單羧基取代酞菁鋅的質(zhì)譜圖。其中主峰621.8(理論值為621.92)為該化合物的分子離子峰，該峰經(jīng)過ms/ms之后的576.4(理論值為576.9)的峰即為無取代酞菁鋅的分子離子峰。
圖5為2-單羧基取代酞菁鋅與寡聚賴氨酸進(jìn)行偶合的示意圖。
圖6中(1)為在波長670nm，能量密度1.2J/cm2的激光作用下，不同溶度的光敏劑2-ZnPcC1-PL對(duì)牙齦卟啉菌的抑菌率曲線；(2)為670nm下10uM的光敏劑在不同能量密度下的抑菌率曲線。其中所述的抑菌率＝(對(duì)照組個(gè)數(shù)平均值-實(shí)驗(yàn)組個(gè)數(shù)平均值)/對(duì)照組個(gè)數(shù)平均值。
圖7為在波長670nm、能量密度15J/cm2的激光作用下10uM光敏劑2-ZnPcC1-PL對(duì)牙齦卟啉菌和人牙周膜細(xì)胞抑制作用的對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一2-單酰胺取代酞菁鋅的合成在帶有回流裝置和攪拌子的500ml三頸瓶中加入充分研細(xì)的偏苯三甲酸酐2.40g(0.0125mol，Merck)，鄰苯二甲酸酐12.96g(0.08750mol)，無水醋酸鋅22.00g(0.1002mol)，尿素60g(1mol)，鉬酸銨0.50g(0.4mmol)，氯化銨2.00g(0.0374mol)。在油浴中加熱至170℃，反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后用0.5M的HCl洗滌數(shù)次，再用純水洗至中性，得到22.25g固體。產(chǎn)率67％，由HPLC判斷其中22％為2-單酰胺取代酞菁鋅。
實(shí)施例二2-單羧基取代酞菁鋅的合成取15.00g實(shí)施例一所制備的2-單酰胺取代酞菁鋅于250ml的三頸瓶中，加入1M的KOH 100ml，在100℃下攪拌回流24h。待反應(yīng)結(jié)束后抽濾，得到綠色固體，加入0.5M KOH洗滌并抽濾，直到濾液無色為止。然后用1M的HCl洗滌數(shù)次，再用水洗至中性烘干。
實(shí)施例三2-單羧基取代酞菁鋅的分離純化選用40cm長，內(nèi)徑為3cm的層析柱，以100目的硅膠為吸附劑，DMF∶丙酮＝3∶1的混合溶劑為洗脫劑，用DMF∶丙酮＝3∶1的混合溶劑濕法裝柱，裝柱高度為30cm。將上一步反應(yīng)處理后的粗產(chǎn)品1.85g溶于37ml的DMF中。每次加樣量為1ml，柱子可反復(fù)使用多次。在洗脫過程中可以發(fā)現(xiàn)藍(lán)綠色的酞菁樣品分為兩個(gè)部分，收集第二部分(后洗脫下來的)。將收集下來的樣品冷凍干燥。將干燥好的樣品按照上述的方法再次進(jìn)行過柱分離，如此反復(fù)三到四次即可除去無取代酞菁鋅和2-單酰胺取代酞菁鋅。最后再將樣品用丙酮溶解并洗脫即可得到較純的2-單羧基取代酞菁鋅。純化過程中收集的樣品使用HPLC高效液相色譜跟蹤分析。
實(shí)施例四2-單羧基取代酞菁鋅-寡聚賴氨酸偶合物(2-ZnPcC1-PL)的合成稱取20.95mg(0.0337mM)2-單羧基取代酞菁鋅放入50ml帶有攪拌子的圓底燒瓶，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺氫氯化物(EDC)9.68mg(0.0505mM)，N-羥基丁二酰亞胺5.81mg(0.0505mM)，最后加入6mlDMSO使固體樣品溶解。常溫避光條件下，使羧酸取代基活化。24h后加入寡聚賴氨酸56.2mg(0.0225mM)和0.6ml吡啶繼續(xù)反應(yīng)24h。待反應(yīng)完全后，加入10ml純水，用Maxi Dry Lyo真空濃縮/凍干機(jī)抽干，將抽干后的固體用50ml純水溶解，離心后取上清液，清液用二氯甲烷反復(fù)萃取4-5次，以除去未反應(yīng)完全的EDC，N-羥基丁二酰亞胺等雜質(zhì)，取水層用同上的方法抽干，得水溶性的藍(lán)色固體，即2-ZnPcC1-PL 81.7mg。
實(shí)施例五光敏劑(2-ZnPcC1-PL)對(duì)牙齦卟啉菌抑制作用的研究用PBS稀釋牙齦卟啉菌制成細(xì)胞懸濁液(2.5×106-3.0×106個(gè)細(xì)菌/ml)，以每孔92ul接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，往96孔板中加入8ul不同濃度光敏劑2-ZnPcC1-PL，以達(dá)到最終設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)濃度(每個(gè)不同的濃度做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn))，實(shí)驗(yàn)中還設(shè)置了空白對(duì)照孔。室溫下在暗室中用波長670nm的激光器照射相應(yīng)的時(shí)間。光照后每孔取出10ul用PBS稀釋104倍后取100ul涂板(細(xì)菌培養(yǎng)板)，之后將細(xì)菌培養(yǎng)板放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中，在37℃下培養(yǎng)，待長出菌落后(約24小時(shí))計(jì)數(shù)。研究結(jié)果如附圖6的說明中所述，在很低能量密度作用下光敏劑2-ZnPcC1-PL對(duì)牙齦卟啉菌就有很好的殺傷作用，在某一特定的藥物濃度和能量密度下其抑制率甚至可以達(dá)到99％以上。
實(shí)施例六光敏劑(2-ZnPcC1-PL)對(duì)牙周膜細(xì)胞影響的研究將轉(zhuǎn)接三代后的牙周膜細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后以5×104個(gè)細(xì)胞/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200ul。待2小時(shí)后細(xì)胞貼壁，加入光敏劑2-ZnPcC1-PL以達(dá)到最終的實(shí)驗(yàn)濃度(每個(gè)不同的濃度各做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn))，室溫下在暗室中用波長670nm的激光器照射相應(yīng)的時(shí)間。光照后吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的培養(yǎng)基放入37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后每孔加入5ul MTT試劑并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。吸出培養(yǎng)基，加入200ul DMSO溶解代謝后的固體顆粒，待完全溶解后用酶標(biāo)儀在波長為578nm下檢測(cè)其吸光度。圖7顯示了光敏劑2-ZnPcC1-PL對(duì)細(xì)胞的影響，并與牙齦卟啉菌做了比較。
權(quán)利要求
1.一種廣譜、低毒性的酞菁類殺菌劑，即2-單羧基取代酞菁鋅-寡聚賴氨酸偶合物，其特征在于，它的表達(dá)式為2-ZnPcC1-PL(其中C1代表單個(gè)羧基，PL代表寡聚賴氨酸)，它的結(jié)構(gòu)式為
2.如權(quán)利要求1所述的殺菌劑2-ZnPcC1-PL，其特征在于，它是由2-單羧基取代酞菁鋅與寡聚賴氨酸偶合而得到的，其中2-單羧基取代酞菁鋅的結(jié)構(gòu)式為
3.一種權(quán)利要求1的廣譜、低毒性的酞菁類殺菌劑2-ZnPcC1-PL的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)以無水醋酸鋅為模板劑，鉬酸銨為催化劑，使前驅(qū)物鄰苯二甲酸酐與偏苯三甲酸酐的摩爾比大于3∶1，并在160℃-190℃的固相條件下合成出2-單酰胺取代酞菁鋅；(2)將步驟(1)的產(chǎn)物在90℃-100℃下水解，生成2-單羧基取代酞菁鋅的粗產(chǎn)物；(3)利用液相色譜分離的辦法將步驟(2)所得的粗產(chǎn)物分離純化，具體方法是，以硅膠作為固定相，DMF與丙酮的混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行色譜分離，并收集后洗脫下來的組分；再將收集到的樣品根據(jù)前面所述的分離步驟反復(fù)多次，即可得到較純的2-單羧基取代酞菁鋅；(4)將步驟(3)所得的產(chǎn)物在常溫下將其所帶的羧酸基團(tuán)活化，并與寡聚賴氨酸進(jìn)行偶合得到2-ZnPcC1-PL。
4.一種權(quán)利要求1的廣譜、低毒性的酞菁類殺菌劑2-ZnPcC1-PL的用途，其特征在于，它作為臨床上治療牙周病等由細(xì)菌引起的疾病的藥物。
全文摘要
一種廣譜、低毒性的酞菁類殺菌劑，即2－單羧基取代酞菁鋅－寡聚賴氨酸偶合物及其制備方法和用途。該殺菌劑是以醋酸鋅，鄰苯二甲酸酐和偏苯三甲酸酐為起始原料，經(jīng)固相合成、水解、層析柱分離而得到較純的2－單羧基取代酞菁鋅，然后將2－單羧基取代酞菁鋅與寡聚賴氨酸偶合得到最終產(chǎn)物。這種新型的殺菌劑具有多種用途，能殺死不同種類的細(xì)菌，具有一定的廣譜性。另一方面，該殺菌劑含有能與細(xì)菌表面特異性結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)，可達(dá)到特異性殺死細(xì)菌而不傷及正常細(xì)胞的低毒性的目的。研究發(fā)現(xiàn)，該藥物在很小的濃度和光劑量下對(duì)牙周病的主要致病菌牙齦卟啉菌的殺傷率高于97％，但同時(shí)對(duì)人牙周膜細(xì)胞的影響很小，因此可作為治療牙周病的有效藥物。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1939919SQ20051010777
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者黃明東, 陳錦燦, 李永東, 王俊東, 黃金陵, 陳耐生, 閆福華, 鄭瑜謙 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所, 福州大學(xué), 福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院