專利名稱：雙酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥與酶工程領(lǐng)域，具體地說是采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶聯(lián)合制備分子量可控的藥用右旋糖酐的工藝。
背景技術(shù)：
右旋糖酐(Dextran)是若干葡聚糖脫水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1，6糖苷鍵連接而成，由腸膜狀明串菌株(Leuconstoc mesenteriodes)產(chǎn)生的右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase ；E. C. 2. 4. I. 5)合成的右旋糖酐含有95%的α -I, 6糖苷鍵，同時(shí)含有少量其它糖苷鍵的分支結(jié)構(gòu)。因其具有安全、無毒等多種優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、工業(yè)、食品等多個(gè)領(lǐng)域。高分子右旋糖酐可以被用來作為藥物載體，以及常用的凝膠色譜填料。臨床上常用的有中分子右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20，主要用作血漿代用品，用于出血性休克、創(chuàng)傷性休克及燒傷性休克等。重均分子量6-8 kDa的右旋糖酐常被用于制成右旋糖酐鐵，用于治療嚴(yán)重的貧血癥。重均分子量低于5 kDa的右旋糖酐常被硫酸化，用于抗血栓。小分子右旋糖酐I (Dextran I, Mw 1000 Da)近來被發(fā)現(xiàn),可以避免由于右旋糖酐70及40而引起的人體自身免疫的變態(tài)反應(yīng)。分子量更小的低聚異麥芽糖則被用于益生
J Li ο目前國內(nèi)多采用發(fā)酵方法制備高分子右旋糖酐，再利用鹽酸水解得到不同分子量的藥用右旋糖酐，由于生產(chǎn)的右旋糖酐含有大量的氯化物嚴(yán)重影響了右旋糖酐的質(zhì)量和品質(zhì)，在臨床使用過程中常出現(xiàn)過敏反應(yīng)，可引起皮膚反應(yīng)、嚴(yán)重的呼吸和循環(huán)衰竭，甚至導(dǎo)致死亡。同時(shí)由于是酸催化水解，水解過程無序，得到的產(chǎn)品分子量分布不集中，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。另外，由于利用鹽酸水解需要高溫高酸等惡劣條件，不利于環(huán)保、低碳。而采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶酶法制備藥用級(jí)右旋糖酐，就能減少氯化物對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響，同時(shí)由于酶對(duì)底物的特異性水解，能得到分子量分布集中的高品質(zhì)右旋糖酐，產(chǎn)品達(dá)到高產(chǎn)率。此外，酶催化降解反應(yīng)條件溫和、能耗低，從而實(shí)現(xiàn)了中、小分子量多糖生產(chǎn)工藝的綠色、環(huán)保、低碳的目標(biāo)。目前國外已有學(xué)者直接采用分別產(chǎn)右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的菌株發(fā)酵制備藥用右旋糖酐，但是由于直接發(fā)酵，菌株產(chǎn)生的代謝物種類繁雜，不利于產(chǎn)品的分離純化，同時(shí)由于產(chǎn)率低，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。另外也有學(xué)者采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶雙酶聯(lián)合制備藥用糖酐，但是由于產(chǎn)率較低(36%)，從而不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了避免現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，提供一種采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶雙酶聯(lián)合制備分子量可控的藥用右旋糖酐的方法，該方法不僅綠色、環(huán)保、低成本、簡(jiǎn)便；而且使制備獲得的右旋糖酐分子量可控。本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下方案雙酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐，該方法按如下步驟進(jìn)行(I)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，、
采用pH 5.4 O. 02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制終體積濃度12%的蔗糖溶液1000 mL，所述緩沖液中添加0.05g/L CaCl2 ;將配置好的蔗糖溶液置于25°C保溫10 min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其終濃度為2 IU/mL，置于25°C恒溫、120r/min反應(yīng)4小時(shí)，再置于25°C條件下保溫20小時(shí)；然后終止右旋糖酐蔗糖酶的催化反應(yīng)，將反應(yīng)液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解；所述右旋糖酐蔗糖酶的一個(gè)酶活I(lǐng)U是指，以pH5. 4的醋酸-醋酸鈣緩沖液配制終體積濃度為10%的蔗糖溶液為底物；所述緩沖液中含醋酸鈣0.05 8/1、冰醋酸0.02 mol/L ;25°C條件下，每毫升底物反應(yīng)液中每小時(shí)催化蔗糖產(chǎn)生O. I mg果糖所需要的酶量；(2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐
向步驟I)經(jīng)右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反應(yīng)液中加入右旋糖酐酶使其終濃度為O. 23 U/mL，置于35°C條件下攪拌反應(yīng)160min_180 min，然后終止酶促反應(yīng)；所述右旋糖酐酶的一個(gè)酶活U是指，以pH 5. O的醋酸鹽緩沖液配制的終體積濃度為3%的重均分子量為70 kDa的右旋糖酐溶液為底物，在35°C條件下，每分鐘產(chǎn)生I μ mol還原糖所需要的右旋糖酐酶量；(3)去除雜質(zhì)將上述步驟2)經(jīng)右旋糖酐酶催化水解的反應(yīng)液置于80°C保溫3小時(shí)，隨后采用多層紗布過濾雜質(zhì)，重復(fù)過濾兩次，隨后采用中速定性濾紙過濾上清液；然后再將上述過濾后的上清液加熱煮沸15 min，待上清液冷卻后，再利用中速定性濾紙過濾去除雜質(zhì)，清澈無色的濾液用于下一步乙醇分級(jí)醇沉；(4)乙醇分級(jí)醇沉及真空干燥采用4級(jí)劃分，一級(jí)劃分乙醇體積濃度為39%，在攪拌裝置下，向步驟(3)所得濾液中緩慢加入體積濃度95%乙醇，定時(shí)測(cè)定濾液中乙醇體積濃度，當(dāng)乙醇體積濃度達(dá)到39%時(shí)停止醇沉，將濾液置于40度保溫22小時(shí)，然后倒出上清液，再向沉淀中加入適量乙醇取出大分子雜質(zhì)；二級(jí)劃分乙醇體積濃度為43%，向一級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)43%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的濾液置于34度保溫22小時(shí)，然后倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇獲得右旋糖酐70產(chǎn)品；三級(jí)劃分乙醇濃度為47%，向二級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)47%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的慮液置于40度保溫12小時(shí)，倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇獲得右旋糖酐40產(chǎn)品；四級(jí)劃分乙醇濃度為57%，向三級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)57%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的慮液置于常溫，2小時(shí)后，再加入乙醇獲得右旋糖酐20產(chǎn)品；將上述乙醇劃分所得到的產(chǎn)品分別置于80°C真空干燥箱中干燥4小時(shí)，去除產(chǎn)品中殘留的乙醇及水分，即得到相應(yīng)的右旋糖酐產(chǎn)品。本發(fā)明優(yōu)選使用申請(qǐng)?zhí)枮?00710134765. 4的專利公開文本中的重組右旋糖酐蔗糖酶，該酶具有高酶活性，平均酶活達(dá)到40IU/mL，能夠高效的催化蔗糖轉(zhuǎn)化為右旋糖酐，蔗糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%以上；同時(shí)本發(fā)明優(yōu)選使用申請(qǐng)?zhí)枮?01110117071.6的專利公開文本中的右旋糖酐酶，該酶催化水解高分子右旋糖酐具有較強(qiáng)的底物特異性，該酶在催化高分子右旋糖酐時(shí)，能夠優(yōu)先催化降解分子量較大的糖酐，從而實(shí)現(xiàn)中小分子右旋糖酐的富集，利于酶法定向制備分子量可控的藥用右旋糖酐，同時(shí)獲得較高的產(chǎn)品收率；也可以使用從土壤中篩選出的棘孢青霉菌株發(fā)酵而成的右旋糖酐酶，該菌株GenBank登錄號(hào)為HQ647326。本發(fā)明采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶聯(lián)合制備分子量可控的藥用右旋糖酐，方法具有如下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明先用蔗糖酶作用于蔗糖合成高分子的右旋糖酐，轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%，之后再加入右旋糖酐酶降解160-180min，得到系列右旋糖酐產(chǎn)品，該方法不僅綠色、環(huán)保、低成本、簡(jiǎn)便；而且能夠大幅度提聞廣品收率，獲得聞品質(zhì)藥用右旋糖野。(2)本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)藥用右旋糖酐的分子量可控生產(chǎn)，通過控制反應(yīng)條件，調(diào)節(jié)催化反應(yīng)時(shí)間可以定向制備以右旋糖酐20為主的產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步解釋說明。
實(shí)施例I(I)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，包含以下A、B兩步A :右旋糖酐蔗糖酶活力測(cè)定用pH5. 4的醋酸-醋酸鈣緩沖液(含醋酸鈣O. 05 g/L、冰醋酸O. 02 mol/L)蔗糖溶液的終濃度配制為10%，加入適量稀釋酶液在25°C條件下靜置反應(yīng)lh。反應(yīng)完成后取樣500 μ I加入DNS試劑375 μ I (稀釋10倍)，沸水浴中加熱準(zhǔn)確煮沸5min，然后取出將其冷卻至室溫，加入蒸餾水定容至5. 375ml。以未反應(yīng)的對(duì)照液作為參照，用分光光度計(jì)在波長520nm處測(cè)量光密度值，根據(jù)果糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算果糖量，最終計(jì)算出酶活力。一個(gè)酶活單位(IU)定義為在上述條件下，每毫升底物反應(yīng)液中每小時(shí)催化蔗糖產(chǎn)生O. I mg果糖所需要的酶量。檢測(cè)結(jié)果顯示右旋糖酐蔗糖酶粗酶液活力達(dá)110IU/mL。B :酶法合成高分子右旋糖酐工藝條件采用pH 5. 4 O. 02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(添加O. 05g/L CaCl2)配制12%的蔗糖溶液5000 mL，置于25°C保溫10 min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其終濃度為2 IU/mL,加入右旋糖酐蔗糖酶總活力單位10000 IU，置于25°C恒溫、120r/min反應(yīng)4小時(shí)，再置于25°C條件下保溫20小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液置于70°C保溫20 min終止右旋糖酐蔗糖酶的催化反應(yīng)。反應(yīng)液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解。反應(yīng)液取樣檢測(cè)，采用高效液相色譜檢測(cè)樣品的重均分子量達(dá)IOOOkDa以上，蔗糖轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%以上。(2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐，包含以下A、B兩步A :右旋糖酐酶活力測(cè)定右旋糖酐酶的活力測(cè)定將4ml O. 02mol/L pH 5. O的醋酸鹽緩沖液配制的3%右旋糖酐70 kDa溶液置于35°C保溫lOmin，再加入適當(dāng)稀釋的酶液Iml保溫Ih后，利用3，5- 二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定生成的還原糖。以在上述條件下每分鐘產(chǎn)生I μ mol還原糖(葡萄糖當(dāng)量)所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。檢測(cè)結(jié)果顯示右旋糖酐酶粗酶液活力達(dá)500U/mL。B :右旋糖酐酶的催化降解向上述步驟I)經(jīng)右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反應(yīng)液中加入右旋糖酐酶使其終濃度為0.23 U/mL，加入右旋糖酐酶總活力單位為1150U，置于35°C條件下攪拌反應(yīng)160min-180 min,反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液置于100°C水浴保溫10 min或通入水蒸氣5min,使右旋糖酐酶變性失活，以終止酶促反應(yīng)。(3)去除雜質(zhì)將上述步驟2)經(jīng)右旋糖酐酶催化降解的反應(yīng)液置于80°C保溫3小時(shí)，反應(yīng)液保溫3小時(shí)后，會(huì)有大量絮狀變性蛋白析出，隨后采用八層紗布過濾雜質(zhì)(主要為加熱變性的右旋糖酐蔗糖酶)，以上步驟重復(fù)兩次，隨后采用中速定性濾紙過濾上清液。然后再將上述反應(yīng)液過濾后的上清液加熱煮沸15 min，待上清液冷卻后，再利用中速定性濾紙過濾雜質(zhì)，清澈無色的濾液用于下一步乙醇分級(jí)醇沉，即雜蛋白的去除分為兩步進(jìn)行。(4)乙醇分級(jí)醇沉及真空干燥采用4級(jí)劃分，一級(jí)劃分乙醇體積濃度為39%，在攪拌裝置下，向步驟(3)所得濾液 中緩慢加入體積濃度95%乙醇，定時(shí)測(cè)定濾液的溫度和酒精度，并根據(jù)溫度和酒精度值查表得濾液中乙醇體積濃度，當(dāng)乙醇體積濃度達(dá)到39%時(shí)停止醇沉，將濾液置于40度保溫22小時(shí)，然后倒出上清液，再向沉淀中加入適量乙醇取出大分子雜質(zhì)；二級(jí)劃分乙醇體積濃度為43%，向一級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)43%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的濾液置于34度保溫22小時(shí)，然后倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇獲得右旋糖酐70產(chǎn)品；三級(jí)劃分乙醇濃度為47%，向二級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)47%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的慮液置于40度保溫12小時(shí)，倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇獲得右旋糖酐40產(chǎn)品；四級(jí)劃分乙醇濃度為57%，向三級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)57%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的慮液置于常溫，2小時(shí)后，再加入乙醇獲得右旋糖野20廣品；最后獲得三種分子量不同的藥用右旋糖酐，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，三種產(chǎn)品的分子量分別為 69376,38251 和 21364 Da，保留時(shí)間分別為 13. 866 min, 14. 390 min 和 15. 037min，分子量分布系數(shù)分別為2. 08、I. 39、I. 21，三種產(chǎn)品的總產(chǎn)率為80. 32%，對(duì)應(yīng)的產(chǎn)率為5. 77%、12. 55%、62%。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為160min_180min，可以定向制備右旋糖酐20為主要的產(chǎn)
品O本實(shí)施例中的右旋糖酐蔗糖酶為申請(qǐng)?zhí)枮?00710134765. 4的專利公開文本中的重組右旋糖酐蔗糖酶；右旋糖酐酶為申請(qǐng)?zhí)枮?01110117071.6的專利公開文本中的右旋
糖酐酶。
權(quán)利要求
1.雙酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐，其特征在于，該方法按如下步驟進(jìn)行 (1)右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐， 采用pH 5.4 0. 02 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制終體積濃度12%的蔗糖溶液1000mL，所述緩沖液中添加0.05g/L CaCl2;將配置好的蔗糖溶液置于25°C保溫10 min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其終濃度為2 IU/mL,置于25°C恒溫、120r/min反應(yīng)4小時(shí)，再置于25°C條件下保溫20小時(shí)；然后終止右旋糖酐蔗糖酶的催化反應(yīng)，將反應(yīng)液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解； 所述右旋糖酐蔗糖酶的一個(gè)酶活I(lǐng)U是指，以pH5. 4的醋酸-醋酸鈣緩沖液配制終體積濃度為10%的蔗糖溶液為底物；所述緩沖液中含醋酸鈣0.05 g/L、冰醋酸0.02 mol/L ；25°C條件下，每毫升底物反應(yīng)液中每小時(shí)催化蔗糖產(chǎn)生0. I mg果糖所需要的酶量； (2)右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐 向步驟I)經(jīng)右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反應(yīng)液中加入右旋糖酐酶使其終濃度為0. 23U/mL，置于35°C條件下攪拌反應(yīng)160min-180 min，然后終止酶促反應(yīng)； 所述右旋糖酐酶的一個(gè)酶活U是指，以pH 5. 0的醋酸鹽緩沖液配制的終體積濃度為3%的重均分子量為70 kDa的右旋糖酐溶液為底物，在35°C條件下，每分鐘產(chǎn)生I y mol還原糖所需要的右旋糖酐酶量； (3)去除雜質(zhì) 將上述步驟2)經(jīng)右旋糖酐酶催化水解的反應(yīng)液置于80°C保溫3小時(shí)，隨后采用多層紗布過濾雜質(zhì)，重復(fù)過濾兩次，隨后采用中速定性濾紙過濾上清液；然后再將上述過濾后的上清液加熱煮沸15 min,待上清液冷卻后，再利用中速定性濾紙過濾去除雜質(zhì),清澈無色的濾液用于下一步乙醇分級(jí)醇沉； (4)乙醇分級(jí)醇沉及真空干燥 采用4級(jí)劃分，一級(jí)劃分乙醇體積濃度為39%，在攪拌裝置下，向步驟(3)所得濾液中緩慢加入體積濃度95%乙醇，定時(shí)測(cè)定濾液中乙醇體積濃度，當(dāng)乙醇體積濃度達(dá)到39%時(shí)停止醇沉，將濾液置于40度保溫22小時(shí)，然后倒出上清液，再向沉淀中加入適量乙醇取出大分子雜質(zhì)；二級(jí)劃分乙醇體積濃度為43%，向一級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)43%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的濾液置于34度保溫22小時(shí)，然后倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇獲得右旋糖酐70產(chǎn)品；三級(jí)劃分乙醇濃度為47%，向二級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)47%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的慮液置于40度保溫12小時(shí)，倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇獲得右旋糖酐40產(chǎn)品；四級(jí)劃分乙醇濃度為57%，向三級(jí)劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達(dá)57%時(shí)，停止醇沉，將醇沉好的慮液置于常溫，2小時(shí)后，再加入乙醇獲得右旋糖酐20產(chǎn)品； 將上述乙醇劃分所得到的產(chǎn)品分別置于80°C真空干燥箱中干燥4小時(shí)，去除產(chǎn)品中殘留的乙醇及水分，即得到相應(yīng)的右旋糖酐產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐，其產(chǎn)品種類包括右旋糖酐70，右旋糖酐40以及右旋糖酐20；其制備步驟分為兩大步，第一大步為高分子右旋糖酐的合成，首先是采用右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖制備高分子右旋糖酐，該新方法使蔗糖轉(zhuǎn)化為右旋糖酐的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上；第二大步為高分子右旋糖的可控性降解，采用高酶活性的右旋糖酐酶催化降解高分子右旋糖酐為藥用右旋糖酐，實(shí)現(xiàn)右旋糖酐的分子量可控降解；反應(yīng)結(jié)束后采用簡(jiǎn)單的過濾方法去除產(chǎn)品中的雜蛋白，采用乙醇分級(jí)醇沉獲得不同分子量右旋糖酐。該方法不僅綠色、環(huán)保、低成本、簡(jiǎn)便；而且能夠大幅度提高產(chǎn)品收率，獲得高品質(zhì)藥用右旋糖酐。
文檔編號(hào)C12P19/16GK102676615SQ20121018943
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月10日
發(fā)明者吳定濤, 張洪斌, 甘微葦, 胡雪芹 申請(qǐng)人:合肥工業(yè)大學(xué)