與大豆抗疫病基因RpsZS18共分離的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術工程和農(nóng)作物抗病遺傳育種領域，具體地說，涉及一種 與大見抗疫病基因RpsZS18共分尚的分子標記及其應用。
【背景技術】
[0002] 由大豆疫霉（PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann)引起的大豆疫病是大豆 生產(chǎn)中的一種毀滅性病害。該病已在我國黑龍江省、安徽、福建、吉林、新疆等省份發(fā)生。大 豆疫霉在大豆所有生育期均可以侵染大豆，引起根腐、莖腐、植株矮化、枯萎和死亡，一般田 塊減產(chǎn)10-30%，嚴重地塊可達60-90%，甚至造成絕產(chǎn)。目前全世界每年因大豆疫霉病造 成的經(jīng)濟損失大約為10億美元（Tyler，2007)。
[0003] 防治大豆疫病最為經(jīng)濟、有效且環(huán)境安全的方法是種植抗病品種。目前，國外 已經(jīng)在大豆基因組上的8個基因座上鑒定了 17個抗性基因。分別為RpsUBernardet al. , 1957) >Rps2(Kilenetal. , 1974) >Rps3(Muelleretal. , 1978) >Rps4(Athowet al.，1980)、Rps5(Buzzell和Anderson.，1981)、Rps6(Athow和Laviolette.，1982)、 Rps7(Anderson和Buzzell.，1992)、Rps8(Gordonetal.，2006;Sandhuetal.，2005)、 大豆品種Waseshiroge的Rpsgene(Sugimotoetal.，2011)、RpsUNl和RpsUN2(Lin etal.，2013)。在Rpsl位點上共有 5 個等位基因（Rpsla，lb，lc，ld，lk)(Bernardet al·，1957;Buzzell和Anderson, 1992;Muelleretal·，1978)，在Rps3 位點上共有 3 個 等位基因（Rps3a, 3b和 3c)(Muelleretal·，1978;Ploperetal·，1985)。Rpsl、Rps7、 Waseshiroge的Rpsgene和RpsUNl被定位在3號染色體上；Rps2和RpsUN2被定位在第16 號染色體上。Rps3和Rps8被定位在第13號染色體上；Rps4、Rps5和Rps6被定位在第18 號染色體上。
[0004] 迄今，我國已經(jīng)鑒定了 9個大豆抗疫病基因，即RpsYB30、RpsYD25、RpsZS18、 RpsSN10、Rps9、RpsSu、RpsYD29、Rpsl0 和RpsJS?？共』騌psYB30 被定位在了大豆第 19 號染色體（朱振東，2007)。RpsYD25被定位大豆第3號染色體（范愛穎等，2009) ;RpsZS18 被定位在了大豆第2號染色體上（姚海燕，2010) ;RpsSN10被定位于大豆第13號染色體上 (于安亮，2010) ;Rps9被定位在大豆第3號染色體上（Wuetal.，2011)。RpsSu被定位在 了大豆第10號染色體上（武曉玲等，2011)。RpsYD29被定位在第3號染色體（Zhanget al·，2013a)。RpslO被定位在大豆第17號染色體上（Zhangetal·，2013b)。最新發(fā)現(xiàn)的 RpsJS定位在18號染色體上（Sunetal·，2013)。
[0005] 大豆疫霉群體結構復雜，容易產(chǎn)生新的毒力型。一般認為大豆抗疫病基因的使用 壽命為10-15年，但是新的抗病基因被淘汰的速度正在加快。因此有必要大力挖掘和利用 新的抗性資源并不斷地進行抗病基因的累加，培育抗性持久的大豆品種。
[0006] 隨著分子標記開發(fā)技術不斷發(fā)展，不同類型的分子標記不斷被應用到基因的發(fā)掘 和作圖中，實現(xiàn)更精細的定位。SSR標記由于其數(shù)量大，多態(tài)性高，操作簡單等特點，為目前 應用范圍最為廣泛的一種分子標記。但隨著測序技術的發(fā)展，SNP和Indel等多態(tài)性更強 的分子標記被開發(fā)并且應用到基因的定位中。大豆全基因組測序的完成為大豆基因的精細 定位、克隆以及功能標記的開發(fā)提供了便利。通過大豆基因組的序列信息，設計和利用SSR 和SNP標記，已經(jīng)廣泛應用到大豆基因的定位、功能標記的開發(fā)。
[0007] 大豆品種早熟18是中國科學院遺傳研究所1982年用7902(克拉克63X誘變30) 為母本，7821 (耐陰黑豆X誘變31)為父本進行復合雜交選育而成；早熟18號高抗花葉病 毒病、灰斑病和紫斑病。抗倒伏，抗裂莢。朱振東等（2006)發(fā)現(xiàn)早熟18對大見疫霉具有廣 譜抗性。姚海燕等（2010)在早熟18中鑒定一個抗疫病基因RpsZS18,并將該基因定位在大 豆2號染色體（LGDlb)SSR標記Sat_069和Sat_183之間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一個與大豆抗疫病基因RpsZS18共分離的分子標記及其應 用。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一個與大豆抗疫病基因RpsZSIS共分離的分子 標記ZCindel246000,所述分子標記位于大豆2號染色體的SSR標記ZCSSR33(0. 7cM)和 ZCSSR46(2. 8cM)之間，用于特異性PCR擴增分子標記ZCindel246000的引物對為：
[0010] 上游引物F: 5 ' -CAGATAGAGTTTTCCTACACAGG-3 ' 和
[0011] 下游引物R: 5 ' -AGTAGAAGCAAAGAGGGACT-3 '。
[0012] 分子標記ZCindel266000與基因RpsZS18的遺傳距離為OcM。
[0013] PCR擴增使用的退火溫度為58. 4°C，擴增產(chǎn)物大小為279bp(序列1)。
[0014] 本發(fā)明還提供所述分子標記ZCindel266000在鑒定抗疫病大豆品種中的應用，包 括以下步驟：
[0015] 1)提取待測大?的基因組DNA;
[0016] 2)以待測大豆的基因組DNA為模板，利用上述引物F和R，進行PCR擴增反應；
[0017] 3)檢測PCR擴增產(chǎn)物，如果能夠擴增出279bp的產(chǎn)物，則判定待測大豆為抗疫病品 種。
[0018] 其中,PCR擴增反應使用的擴增體系以10μ1計為：大豆基因組DNA模板濃度2ng/ μ1，2XPCRMasterMix(Tiangen)4y1，引物F和R各 0.2ymol/L，用ddH20 補足至 10μ1。
[0019] PCR擴增反應使用的反應條件為：95°C3分鐘；94°C45秒，58. 4°C45秒，72°C45 秒，共35個循環(huán)；72°C10分鐘。
[0020] 本發(fā)明還提供用于PCR檢測抗疫病大豆的試劑盒，所述試劑盒中含有上述用于特 異性PCR擴增分子標記ZCindel246000的引物對。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液、標準陽性模板等中的一種或多種。
[0021] 本發(fā)明進一步提供所述分子標記ZCindel266000在大見抗疫病分子育種中的應 用。
[0022] 具體地，本發(fā)明的與大豆抗疫病基因RpsZS18共分離的分子標記通過如下方法獲 得：
[0023] 利用Wi11iams和早熟18雜交組合衍生的F3為作圖群體，根據(jù)抗疫病基因 RpsZSIS的初定位結果，在該定位區(qū)間內(nèi)設計開發(fā)新的SSR標記以及利用定位區(qū)間內(nèi)已經(jīng) 公布的SSR標記，篩選在親本和抗、感池上都具有多態(tài)性的分子標記，將具有多態(tài)性的SSR 標記進行群體驗證構建新的連鎖圖譜，實現(xiàn)精細定位。在新的定位區(qū)間內(nèi)預測候選基因，對 早熟18和Williams的候選基因位點進行測序，開發(fā)Indel標記，并進行群體驗證，獲得與 基因RpsZS18共分離的標記。從而為大豆抗疫病育種提供輔助選擇，提高育種效率，加速抗 疫病育種工作進程。 具體實施方案：
[0024] (1)早熟18的抗性遺傳分析
[0025] 以抗病品種早熟18為父本，感病品種Williams(rps)作為母本，雜交產(chǎn)生Fi代，F(xiàn)i 代自交產(chǎn)生F2代，F(xiàn)2代自交產(chǎn)生的75個F3家系的抗性遺傳分析、抗病基因鑒定及作圖群 體。采用下胚軸創(chuàng)傷接種方法，每個家系鑒定20-25個植株對大豆疫霉菌株PsUSAR2的反 應進行抗性遺傳分析。接種后在24°C，濕度為100%的條件下，保濕48小時，然后傳入溫室 培養(yǎng)，4天后進行病情調(diào)查。參照Gordon等（2006)方法評價標準，調(diào)查F3家系的抗病、分