專(zhuān)利名稱(chēng)：一種超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化肽的方法。
背景技術(shù)：
目前使用的食品抗氧化劑大多是化學(xué)合成物如BHA、BHT等，雖然抗氧化效果良好，但對(duì)人體肝、脾、肺等有害，具有蓄積性致癌作用。近年來(lái)，人們逐漸把目光轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn)蘊(yùn)藏于蛋白質(zhì)多肽鏈中的肽類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并且其抗氧化活性往往強(qiáng)于母體蛋白質(zhì)和氨基酸。與人工合成的食品抗氧化劑相比，抗氧化肽更加安全可靠，制備天然抗氧化肽替代合成抗氧化劑已成為當(dāng)前抗氧化劑研究熱點(diǎn)之一。此外有 報(bào)道證實(shí)抗氧化肽還具有抗癌、抗誘導(dǎo)及抗衰老等其他生物活性，因此抗氧化肽不僅在食品工業(yè)，而且在醫(yī)藥、化妝品和整形外科等領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用。一般蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酸、堿水解或酶解等反應(yīng)均可得到抗氧化活性肽。因酶解反應(yīng)具有條件溫和、專(zhuān)一性強(qiáng)、安全性高、副產(chǎn)物少、價(jià)格低廉且可得到特定的活性肽等優(yōu)點(diǎn)，已成為制備活性肽的主流方法。但是酶解反應(yīng)在常規(guī)水浴中進(jìn)行時(shí)，需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；在酸、堿及有機(jī)溶劑等介質(zhì)中進(jìn)行時(shí)，易使酶蛋白變性失活，酶解效率降低。而利用微波或者超聲波等物理手段輔助酶解蛋白質(zhì)制備多肽，不但可以大大縮短酶解時(shí)間，提高酶解效率，而且可以獲得含量豐富的多肽和氨基酸。采用微波輔助處理蛋白質(zhì)，可使其結(jié)構(gòu)變得更松散，暴露出更多的作用位點(diǎn)與酶結(jié)合，使水解反應(yīng)更快更有效地進(jìn)行，水解度得以提高。超聲波對(duì)酶解反應(yīng)的影響主要是其超聲效應(yīng)，包括熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)等。超聲波可在液體介質(zhì)中形成微泡，其破裂伴隨能量的釋放，可以提高許多化學(xué)反應(yīng)的速度。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN102273543A公開(kāi)了一種超聲波輔助酶解制備花生抗氧化肽的方法，利用超聲波輔助酶解，可提高酶解過(guò)程中肽的釋放量，并使所得花生抗氧化肽的抗氧化活性增強(qiáng)。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN101962596A公開(kāi)了同步制備核桃油和核桃蛋白肽的方法，在加入蛋白酶或符合蛋白酶水解的同時(shí)進(jìn)行微波處理輔助酶解。然而，同時(shí)利用超聲波-微波輔助酶解蛋白制備抗氧化肽尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化肽的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化肽的方法，包括以下步驟
(1)酶解底物制備用去離子水配制鮭魚(yú)蛋白溶液做為酶解底物；
(2)酶解調(diào)節(jié)酶解底物的pH值，然后加入堿性蛋白酶，放入水浴中先酶解；
(3)超聲波-微波輔助酶解打開(kāi)電腦微波-超聲波組合催化合成儀對(duì)酶解物進(jìn)行超聲波-微波輔助酶解，其中超聲波的探頭插入深度固定不變，微波處理后，繼續(xù)酶解，滅酶；
(4)滅酶后將反應(yīng)液離心分離，取上清液，冷凍干燥后得抗氧化肽粉劑。所述的步驟(3)中微波功率500W、超聲功率100W、超聲-微波處理溫度為41°C條件下處理9. 7分鐘。所述的步驟(I)中鮭魚(yú)蛋白溶液的濃度為5 mg/mL。所述的步驟(2)中每50mL酶解底物加入O. 002g堿性蛋白酶。所述的步驟(2)中堿性蛋白酶的主要酶成分為地衣芽孢桿菌蛋白酶，酶活范圍為20 萬(wàn) u/go所述的步驟(4)中冷凍干燥的條件為-80°C，_2Pa。所述的超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化肽的方法包括以下步驟
(O酶解底物制備用去離子水配制濃度為5mg/mL的鮭魚(yú)蛋白溶液50mL做為酶解底
物；
(2)超聲波-微波輔助酶解調(diào)節(jié)酶解底物的pH值8.2，然后加入堿性蛋白酶O. 002g,放入41°C的水浴中先酶解5min ；
(3)打開(kāi)電腦微波-超聲波組合催化合成儀對(duì)酶解物進(jìn)行超聲波-微波輔助酶解，其中超聲波的探頭插入深度固定不變，微波功率500W、超聲功率100W、超聲-微波處理溫度為41°C條件下處理9. 7分鐘后，繼續(xù)酶解，在總酶解反應(yīng)時(shí)間達(dá)2h時(shí)100°C滅酶；
(4)滅酶后將反應(yīng)液離心分離，取上清液，冷凍干燥后得抗氧化肽粉劑。所述的步驟(2)中堿性蛋白酶的酶活范圍為20萬(wàn)u/g。所述的步驟(4)中冷凍干燥的條件為-80°C，_2Pa。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在干
1、本發(fā)明將超聲波技術(shù)、微波技術(shù)與酶學(xué)生物技術(shù)三者相結(jié)合；
2、與常規(guī)法制備的肽相比，無(wú)化學(xué)反應(yīng)，減少了生物活性物質(zhì)的改變，減少了有機(jī)溶劑的利用，利用超聲波-微波輔助酶解后縮短酶解時(shí)間，而且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯著提高了鮭魚(yú)肽的抗氧化能力；
3、本發(fā)明エ藝簡(jiǎn)單，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有較高的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。


圖I.鄰苯三酚反應(yīng)體系的吸收光譜。圖2.超聲-微波處理時(shí)間對(duì)清除率的影響。圖3.超聲功率對(duì)清除率的影響。圖4.超聲-微波處理溫度對(duì)清除率的影響。圖5.超聲波功率(X1)與超聲波-微波處理時(shí)間(X2)的等高線(a)及響應(yīng)面(b)(X3=40)。圖6.超聲波-微波處理時(shí)間(X2)與超聲-微波處理溫度(X3)的等高線(C)及響應(yīng)面(d) (X1=ISO)0圖7.超聲-微波處理溫度(X3)與超聲功率(X1)的等高線(e)及響應(yīng)面(f)(X2=8)。 圖8.微波功率對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化肽 I.材料與設(shè)備
I.I原料與試劑
鮭魚(yú)膠原蛋白(Salmon collagen, SC),武漢天天好生物制品有限公司；Tris_HCl鹽購(gòu)買(mǎi)于Sigma ;堿性蛋白酶購(gòu)買(mǎi)于龐博生物技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所用的堿性蛋白酶是由細(xì)菌原生質(zhì)體誘變選育出的地衣芽孢桿菌2709，經(jīng)深層發(fā)酵、提取及精制而成的一種蛋白水解酶，其主要酶成分為地衣芽孢桿菌蛋白酶。酶活范圍為20萬(wàn)u/g，購(gòu)買(mǎi)于龐博生物技術(shù)有限公司。
I. 2實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV-2450 ;精密pH計(jì)，PHS-3C ；電腦微波超聲波組合催化合成/萃取儀，XH-300A ;真空冷凍干燥機(jī)，F(xiàn)D-80。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所使用的電腦微波超聲波組合催化合成/萃取儀(XH-300A)購(gòu)買(mǎi)于北京祥鵠科技發(fā)展有限公司。使用的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2450)購(gòu)買(mǎi)與島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司。2.實(shí)驗(yàn)方法
2.1超聲波-微波輔助酶解制備抗氧化肽
用去離子水配制濃度為5 mg/mL的鮭魚(yú)膠原蛋白溶液,并調(diào)節(jié)到酶的最適pH值8. 2,然后加入堿性蛋白酶，放入40°C的水浴中先酶解5min，然后用電腦微波超聲波組合催化合成儀對(duì)其進(jìn)行超聲波-微波處理?？偯附夥磻?yīng)時(shí)間達(dá)2h時(shí)100°C滅酶，離心分離，取上清液為抗氧化肽粗品，檢測(cè)其超氧陰離子自由基清除率。以抗氧化肽清除超氧陰離子自由基的能力為指標(biāo)，將微波功率固定，先研究超聲功率、超聲波-微波處理時(shí)間、超聲-微波處理溫度3個(gè)單因素的影響，確定各自的取值范圍。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定3因素3水平的范圍，用響應(yīng)面法進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析以及顯著性檢驗(yàn)，然后研究微波功率對(duì)抗氧化肽清除超氧陰離子自由基的影響，確定了超聲-微波輔助酶解制備抗氧化肽的最優(yōu)條件。2.2鄰苯三酚反應(yīng)體系測(cè)定波長(zhǎng)確定
取0. 5mol/Ltris-Hcl緩沖液(pH 8. 2) 5mL,置于25°C水浴中預(yù)熱20 min,分別加入ImL配好的樣品蛋白溶液5mg/mL再加3. 7mL去離子和0.3 mL ,3 mmol/L鄰苯三酹溶液,混勻后于25°C水浴中，以HCl為空白，在200-500 nm近紫外光區(qū)用UV-2450紫外分光光度計(jì)分別在反應(yīng)時(shí)間為3、6、8、I Imin進(jìn)行快速掃描測(cè)定其吸收波長(zhǎng)。2. 3超氧陰離子自由基清除率的檢測(cè)
取0. 5mol/L Tris-Hcl緩沖液(pH 8. 2) 5mL，置于25°C水浴中預(yù)熱20 min，分別加入I mL配好的樣品蛋白溶液5mg/mL再加3. 7mL去離子水和0.3 mL ,3 mmol/L鄰苯三酹溶液，混勻后于25°C水浴中，以HCl為空白，測(cè)定其吸光度。清除率=(A0-Ai)/A。X 100%
(A0為空白的吸光度值，Ai為樣品的吸光度值)。3.結(jié)果與分析3. I鄰苯三酚反應(yīng)體系的吸收光譜與測(cè)定波長(zhǎng)確定
鄰苯三酚自氧化過(guò)程為鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在堿性條件下能夠迅速自氧化，產(chǎn)生穩(wěn)定濃度的超氧陰離子自由基(O2 ·_ )與中間物，中間物又與超氧陰離子自由基反應(yīng)，得到一種帶有顔色的中間產(chǎn)物，此物在紫外區(qū)有吸收。鄰苯三酚自氧化被廣泛應(yīng)用于抗氧化劑初步篩選及各種抗氧化物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的抗氧化能力的評(píng)價(jià)，該法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)、檢測(cè)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響顯著。以HCl為空白，在200-500 nm近紫外光區(qū)用UV-2450紫外分光光度計(jì)分別在反應(yīng)時(shí)間為3、6、8、llmin進(jìn)行快速掃描測(cè)定其吸光度，結(jié)果如圖I所示。從圖I可以看出在3 8分鐘之內(nèi)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系最大吸收波長(zhǎng)為327nm，反應(yīng)體系最大吸收波長(zhǎng)隨反應(yīng)時(shí)間的變化不顯著，可以用327nm作為鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系的檢測(cè)波長(zhǎng)。在3 8分鐘之內(nèi)反應(yīng)體系的吸光值也不隨反應(yīng)時(shí)間而變化，說(shuō)明在此時(shí)間內(nèi)有色中間產(chǎn)物的積累是穩(wěn)定的，確定反應(yīng)時(shí)間在8分鐘之內(nèi)。3. 2單因素實(shí)驗(yàn)
3. 2. I超聲-微波處理時(shí)間對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響固定微波功率500W，超聲波功率250W，超聲-微波溫度為50°C，條件下，考察超聲-微波處理時(shí)間對(duì)抗氧化肽清除超氧陰離子自由基能力的影響。如圖2所見(jiàn)，隨著超聲-微波處理時(shí)間的增加，抗氧化肽清除超氧陰離子自由基能力逐漸増大，在Smin時(shí)達(dá)到最大。超過(guò)8min，清除率降低。這主要是由于在Smin前，超聲波-微波處理后，使得蛋白質(zhì)_酶體系更加均勻，促進(jìn)了底物與酶的結(jié)合。同時(shí)使某些具有抗氧化性的氨基酸暴露使其超氧陰離子自由基清除能力增強(qiáng)。8min后清除率降低，可能是由于隨著超聲-微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)酶-蛋白體系已經(jīng)飽和，繼續(xù)超聲-微波處理，由于空化作用、機(jī)械作用使得已經(jīng)結(jié)合的但還未及時(shí)酶解的酶-蛋白體系破壞，從而使得超氧陰離子自由基清除率下降。3. 2. 2超聲功率對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響
固定微波功率500W，超聲波-微波處理溫度50°C，超聲-微波作用時(shí)間8min條件下，考察超聲功率對(duì)抗氧化肽清除超氧陰離子自由基能力的影響。如圖3所示，在較低功率的超聲波-微波處理后，可以提高超氧陰離子清除率，但是當(dāng)超聲功率増加到150W后其清除率反而降低。這可能是由于超聲功率増加后超聲波的熱效應(yīng)及瞬態(tài)空化作用増加，使酶的活性受到影響甚至結(jié)構(gòu)破壞，從而抑制了酶解，造成清除率降低。3. 2. 3超聲-微波處理溫度對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響
固定微波功率500W，超聲波功率150W，超聲-微波作用時(shí)間8min條件下，考察超聲-微波處理溫度對(duì)抗氧化肽清除超氧陰離子自由基能力的影響。如圖4所示，在40°C以內(nèi)隨著超聲-微波處理溫度的升高，熱效應(yīng)不斷増加，酶解速度加快，從而使超氧陰離子自由基清除率増大，40°C時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)升高處理溫度，清除率明顯下降。這可能是由于隨著溫度的持續(xù)升高瞬時(shí)壓カ差増大，使空化泡破裂導(dǎo)致空化效應(yīng)降低，從而使得清除率降低。這與Yasuo Iida所報(bào)到的超聲場(chǎng)中溫度變化對(duì)蛋白釋放的影響相一致。3. 3超聲波-微波輔助酶解制備抗氧化肽響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)
3.3. I模型建立
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),取超聲功率、超聲-微波處理時(shí)間及處理溫度作為3因素水平(結(jié)果見(jiàn)表I )，借助MINITAB軟件中設(shè)計(jì)三因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)(結(jié)果見(jiàn)表2)，最后用響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析。
表I . Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平編碼值
權(quán)利要求
1.一種超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化肽的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)酶解底物制備用去離子水配制鮭魚(yú)蛋白溶液做為酶解底物；(2)酶解調(diào)節(jié)酶解底物的pH值，然后加入堿性蛋白酶，放入水浴中先酶解；(3)超聲波-微波輔助酶解打開(kāi)電腦微波_超聲波組合催化合成儀對(duì)酶解物進(jìn)行超 聲波-微波輔助酶解，其中超聲波的探頭插入深度固定不變，微波處理后，繼續(xù)酶解，滅酶；(4)滅酶后將反應(yīng)液離心分離，取上清液，冷凍干燥后得抗氧化肽粉劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(3)中微波功率500W、超聲功 率100W、超聲-微波處理溫度為41°C條件下處理9. 7分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)中鮭魚(yú)蛋白溶液的濃度為 5 mg/mL0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中每50mL酶解底物加入 0. 002g堿性蛋白酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中堿性蛋白酶的主要酶成 分為地衣芽孢桿菌蛋白酶，酶活范圍為20萬(wàn)u/g。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中冷凍干燥的條件 為-8(TC，_2Pa。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化 肽的方法包括以下步驟(1)酶解底物制備用去離子水配制濃度為5mg/mL的鮭魚(yú)蛋白溶液50mL做為酶解底物；(2)超聲波-微波輔助酶解調(diào)節(jié)酶解底物的pH值8.2，然后加入堿性蛋白酶0. 002g, 放入41°C的水浴中先酶解5min ；(3)打開(kāi)電腦微波-超聲波組合催化合成儀對(duì)酶解物進(jìn)行超聲波_微波輔助酶解，其 中超聲波的探頭插入深度固定不變，微波功率500W、超聲功率100W、超聲-微波處理溫度為 41°C條件下處理9. 7分鐘后，繼續(xù)酶解，在總酶解反應(yīng)時(shí)間達(dá)2h時(shí)100°C滅酶；(4)滅酶后將反應(yīng)液離心分離，取上清液，冷凍干燥后得抗氧化肽粉劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步驟(2)中堿性蛋白酶的酶活范圍 為20萬(wàn)u/g。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步驟(4)中冷凍干燥的條件 為-8(TC，_2Pa。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種超聲波-微波協(xié)同酶解制備抗氧化肽的方法，包括以下步驟(1)酶解底物制備；(2)加入堿性蛋白酶酶解；(3)超聲波-微波輔助酶解；(4)滅酶后將反應(yīng)液離心分離，取上清液，冷凍干燥后得抗氧化肽粉劑。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于將超聲波技術(shù)、微波技術(shù)與酶學(xué)生物技術(shù)三者相結(jié)合。與常規(guī)法制備的肽相比，無(wú)化學(xué)反應(yīng)，減少了生物活性物質(zhì)的改變，減少了有機(jī)溶劑的利用，利用超聲波-微波輔助酶解后縮短酶解時(shí)間，而且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯著提高了鮭魚(yú)肽的抗氧化能力。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有較高的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102649974SQ20121014741
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者史華進(jìn), 康俊霞, 康永鋒, 李艷, 王磊 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)