專利名稱：高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外源蛋白的表達(dá)方法，尤其涉及一種高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)
方法，屬于三聚體蛋白的表達(dá)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
絕大多數(shù)分泌性蛋白質(zhì)的氨基端都有一段15 35個氨基酸的信號肽(signal p印tide)，其功能是引導(dǎo)新生的蛋白質(zhì)多肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)。信號肽在穿 越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜后即被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的信號肽酶水解切除，此時新生多肽鏈開始折疊及其他一系 列修飾過程，再通過囊泡系統(tǒng)進(jìn)入高爾基體完成進(jìn)一步修飾，最終形成成熟的分泌蛋白?？?見，對于分泌性蛋白而言，只有確保信號肽及時準(zhǔn)確地切除，才能在細(xì)胞內(nèi)生成足夠量的活 性蛋白，并最終獲得理想的分泌產(chǎn)量(Li， Y. ， et al. ， Viral liposomes released from insect cellsinfected with recombinant baculovirus expressing the matrix protein ofvesicular stomatitis virus. J Virol，1993.67 (7) :p. 4415-20. Kypr，J. and J. Mrazek， Unusual codon usage of HIV. Nature, 1987. 327 (6117) :p. 20.)。因此篩選具有相對實用 性廣和可高效率引導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌表達(dá)的信號肽序列是優(yōu)化蛋白質(zhì)外源表達(dá)的關(guān)鍵策略之 一?；谛盘栯目山閷?dǎo)蛋白質(zhì)分泌及可在不同蛋白質(zhì)間互通使用的特點，可以通過優(yōu)化信 號肽序列或引入外源高分泌性信號肽來提高目的蛋白的產(chǎn)量和分泌效率。
人組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)的信號肽(Met _Asp_Ala_Met_Lys_Arg_Gly_Leu_Cys_Cys_Val_Leu_Leu_Leu_Cys_Gly_Ala_Val_Phe_Val_ Ser-Pro-Ser)是目前應(yīng)用最廣泛的外源性信號肽之一。tPA信號肽具有強(qiáng)分泌信號肽的典 型特征1)信號肽N端有兩個正電荷氨基酸，介導(dǎo)信號肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜信號肽受體的識別；2) 序列中部主要由疏水氨基酸組成疏水核心，具有形成a螺旋的傾向，有利于信號肽與脂質(zhì) 雙層作用，引導(dǎo)新生肽穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；3)序列C末端靠近切割處主要由極性氨基酸組成，形 成P折疊，容易斷裂，符合信號肽酶的切割位點的特點。由于上述特征，tPA信號肽往往作 為外源性信號肽應(yīng)用于人體內(nèi)或體外人類細(xì)胞系中目的蛋白的分泌表達(dá)。
Ch即man等首次將tPA信號肽作為外源性分泌信號應(yīng)用于HIV_1包膜糖蛋 白(envelope glycoprotein, Env)的體外表達(dá)，其構(gòu)建策略是刪除目的蛋白的信號 肽序列，將tPA信號肽引入目的蛋白的氨基端。用tPA信號肽替換Env原有信號肽 后，Env蛋白分泌水平顯著上升(Chapman, B. S. ， et al. ， Effect of intron A from humancytomegalovirus(Towne)immediate-early gene on heterologousexpression in mammalian cells. Nucleic Acids Res， 1991. 19 (14) :p. 3979—86.)。隨后的石開究進(jìn)一步 表明，tPA引導(dǎo)的Env蛋白的免疫原性明顯強(qiáng)于野生株Env蛋白(Pfeiffer， T. ， et al.， Effects of signalp印tide exchange on HIV—l glycoprotein expression and viral infectivityin mammalian cells. FEBS Lett, 2006. 580 (15) :p. 3775-8.)。截止目前，tPA 信號肽也廣泛用于結(jié)核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌、輪狀病毒、日本腦炎病毒、痘苗病毒、流感 病毒、人乳頭瘤病毒等多種細(xì)菌、病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的分泌表達(dá)，均不同程度地提高了目的蛋
3白的表達(dá)量和免疫原性。 2003年，中國國家知識產(chǎn)權(quán)局公開了四個SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒 pVKKCN1449827) 、 pVPM(CN1449828) 、 pVPS (CN1449829) 、 pVPS2 (CN1449831)。其構(gòu)建策略 是將tPA信號序列插入SARS病毒M基因、HE基因、S基因或S蛋白抗原決定簇基因的N末 端，再將融合基因克隆至真核表達(dá)載體，作為SARS病毒的DNA疫苗候選。
上述關(guān)于tPA信號肽的應(yīng)用和專利主要利用了 tPA信號肽的高效分泌特性，其研 究對象是蛋白質(zhì)的一個亞基或一個亞單位，獲得的目的蛋白以分泌形式表達(dá)至細(xì)胞外。但 是，對于天然狀態(tài)下以三聚體形式存在的蛋白質(zhì)，如HIV-1 Env蛋白、SARS病毒S蛋白、流 感病毒血凝素蛋白(hemagglutinin, HA)等，除了需要實現(xiàn)蛋白的分泌表達(dá)之外，還必須考 慮如何模擬和維持蛋白質(zhì)的天然三聚體結(jié)構(gòu)，以便研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能、提高 蛋白質(zhì)的免疫原性。然而，截止目前，國內(nèi)尚無以tPA作為外源信號肽引導(dǎo)三聚體蛋白分泌 表達(dá)的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服三聚體蛋白質(zhì)在表達(dá)過程中所存在的分泌效 率不高、三聚體產(chǎn)物比例小，純度低等問題，提供一種可廣泛應(yīng)用的分泌性三聚體蛋白質(zhì)的 表達(dá)方法，該方法所表達(dá)的目的蛋白能高效分泌表達(dá)，同時還可模擬和維持蛋白的三聚體 構(gòu)象，三聚體產(chǎn)物比例大，純度高。 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
—種高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法，包括以下步驟 (1)將tPA信號肽基因序列、目的蛋白基因和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列連接在 一起，三者位于同一讀碼框內(nèi)，得到融合基因；其中，目的蛋白的N末端與tPA信號肽相連， 目的蛋白的C末端與蛋白質(zhì)三聚化模序N末端相連； (2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至真核表達(dá)載體，構(gòu)建得到融合蛋白真核 表達(dá)載體； (3)利用真核表達(dá)系統(tǒng)，體內(nèi)或體外表達(dá)融合蛋白，即得； 上述表達(dá)方法中，所述的蛋白質(zhì)三聚化模序的氨基酸序列為SEQID N0 :2所示，編 碼該氨基酸序列的基因序列可以為SEQ ID NO :1所示；該三聚化模序(MTQ)的三聚化趨勢 強(qiáng)，三聚化程度高，分子量小，對目的蛋白的結(jié)構(gòu)影響很小，可廣泛應(yīng)用于三聚化蛋白質(zhì)的 表達(dá)。 所述的tPA信號肽的氨基酸序列為SEQ ID NO :4所示；編碼該tPA信號肽的核苷 酸序列可以為SEQ ID NO :3所示. 當(dāng)然，含有tPA信號肽基因序列和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列的任何一種重組真 核表達(dá)載體都落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 本發(fā)明通過向目的蛋白的氨基端引入一個組織性纖溶酶原激活物tPA的信號肽 序列以及向目的蛋白的羧基端引入一個三聚化蛋白模序MTQ，形成一個新組合，實現(xiàn)目的蛋 白在真核細(xì)胞高水平分泌及三聚化表達(dá)。
本發(fā)明方法的主要優(yōu)點和應(yīng)用 1、本發(fā)明表達(dá)方法可廣泛用于天然構(gòu)象為三聚體的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究。
2、本發(fā)明所涉及的表達(dá)方法可用于天然以三聚體形式存在的蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而 篩選與三聚體靶蛋白相互作用的配體分子。 3、本發(fā)明表達(dá)方法可用于構(gòu)建和表達(dá)天然以三聚體形式存在的病毒表面抗原，產(chǎn) 物可作為DNA免疫原，用于體內(nèi)表達(dá)，構(gòu)建候選基因疫苗；表達(dá)產(chǎn)物可作為蛋白免疫原，構(gòu) 建候選亞單位疫苗，有潛在的遠(yuǎn)期社會和經(jīng)濟(jì)效益。 4、本發(fā)明表達(dá)方法可用于天然以三聚體形式存在的病毒表面蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn) 物可用于診斷試劑的開發(fā)并應(yīng)用于病毒性疾病的診斷，將產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是tPA信號肽和三聚化模序MTQ引入目的蛋白的模式圖。圖1A是將三聚化 模序MTQ引入目的蛋白的羧基末端獲得的融合蛋白；圖1B是用tPA信號肽序列替換目的蛋 白原有信號肽序列后將其引入目的蛋白的氨基末端，并將三聚化模序MTQ引入目的蛋白的 羧基末端，從而獲得的融合蛋白。 圖2是將融合蛋白基因引入表達(dá)載體的模式圖。其中插入基因是指圖1中的兩個 融合蛋白基因中的任意一種。 圖3是目的蛋白在293T細(xì)胞瞬時表達(dá)及鑒定的結(jié)果圖。圖3A是目的蛋白在細(xì)胞 裂解產(chǎn)物中的檢測結(jié)果(以GAPDH為內(nèi)參照)，圖3B是目的蛋白在培養(yǎng)上清中的檢測結(jié)果 (各泳道總蛋白上樣量均為250iig)。第一泳道是天然形式目的蛋白HA1(60KD);第二泳道 是tPA信號肽替換后的目的蛋白HAlE(60KD);第三泳道是陰性對照。圖3C是細(xì)胞裂解產(chǎn) 物中目的蛋白的相對化學(xué)發(fā)光(ECL)信號強(qiáng)度，以HGwt轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白的信號強(qiáng)度為 100% 。圖3D是細(xì)胞培養(yǎng)上清中目的蛋白的相對化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，以HGwt轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng) 上清中目的蛋白的信號強(qiáng)度為100%。 圖4是融合蛋白表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后三聚化融合蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)上清 中分泌表達(dá)及鑒定的結(jié)果圖。圖4A是非還原PAGE的檢測結(jié)果，第一泳道是HGwt轉(zhuǎn)染組培 養(yǎng)上清中檢測到的單體、二聚體和三聚體形式目的蛋白，第二泳道是HE轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清中 檢測到的單體、二聚體和三聚體形式目的蛋白，第三泳道是陰性對照，各泳道總蛋白上樣量 均為900 ii g。圖4B是圖4A中各個泳道目的蛋白的相對ECL信號強(qiáng)度，以HGwt轉(zhuǎn)染組檢測 到的各個聚合形式目的蛋白總量為100%信號強(qiáng)度，各條帶與其比較作為結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實施例1 本實施例所述的三聚化模序MTQ的氨基酸序列是Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ile-Lys_Glu_Glu_Ile_Ala_Lys_Ile_Lys_Glu_Glu_Gln_Ala_Lys_Ile_Lys_Glu_Lys_Ile_Ala_ Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Ala-Gly-Gly-Cys-Cys(SEQ IDNo :2)。
本實施例所述的tPA信號肽的氨基酸序列是Met-Asp-Ala-Met-Lys-Arg-Gly-Le u-Cys-Cys-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Gly-Ala-Val-Phe-Val-Ser-Pro-Ser(SEQ ID No :4)。
—、流感病毒血凝素蛋白HA1亞基與MTQ的融合重組體的構(gòu)建
1.獲取目的基因首先提取流感病毒A/Hong Kong/8/68 (購自美國ATCC)總RNA， 以獲得的總RNA為模板，進(jìn)行RT反應(yīng)產(chǎn)生cDNA ;再以cDNA為模板，利用引物HA1UP (TACAGGA
增保留天然信號肽的HA1基因，或利用引物HAIEUP(CGACGAATTCCAAAAACTTCCTGGAAATGAC) 和引物HA1D0WN PCR擴(kuò)增刪除信號肽序列的HA1E基因。反應(yīng)條件為98°C 15s，60°C 10s， 72°C 2min，共30個循環(huán)，DNA聚合酶為PrimeStar HS DNA Polymerase (購自日本TaKaRa)。
2.融合重組體的構(gòu)建將編碼MTQ蛋白的基因(GGGGGTTCTGGCGGAATCAAGGAAG
TCGAAAAGAGAATTGCTGGTGGATGTTGC) (SEQ ID No :1)合成于載體pcDNA3. 1 (+)(購自美國 Invitrogen)的多克隆位點EcoR I、 Xho I之間獲得載體pcMTQ，再將純化后的HA1基因克 隆至載體pcMTQ上獲得融合蛋白表達(dá)載體HGwt ;將tPA信號肽編碼基因(ATGGATGCAATGA
pcMTQ上獲得載體pcT-MTQ，再將純化后的HAIE基因克隆至pcT-MTQ上獲得融合蛋白表達(dá) 載體HE。其中HA1基因C末端與MTQ基因N末端相連，并位于同一讀碼框內(nèi)；tPA基因C末 端與HAIE基因的N末端相連，HA1E基因的C末端與MTQ的N末端相連，三者位于同一讀碼 框內(nèi)。 二、融合蛋白的表達(dá) 1.真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗將人胚腎293T細(xì)胞(購自美國ATCC)以5X 105個/孔的 密度鋪于6孔板內(nèi)，置于371:、5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞生長面積為孔板底面 積的85 % -90 %時，將4 ii gHAl重組質(zhì)粒HGwt或重組質(zhì)粒HE轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，所用的 轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen)，轉(zhuǎn)染操作參考試劑說明書。
2.表達(dá)產(chǎn)物的收獲轉(zhuǎn)染后72h，將1ml 293T細(xì)胞培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至2. Oml離心管 內(nèi)，3000Xg離心5min，棄去細(xì)胞碎片，將離心上清分裝于0. 5ml離心管中，于-40。C保存。 用PBS簡單洗滌細(xì)胞層，消化并收獲細(xì)胞沉淀。向細(xì)胞沉淀中加入100 ill IX lysisbuffer 裂解細(xì)胞，10000 Xg離心lOmin，將離心上清轉(zhuǎn)移至O. 5ml離心管中，于-4(TC保存。
三、利用特異性抗體通過western blotting方法檢測產(chǎn)物中的重組蛋白
1. SDS-PAGE電泳向100 收獲的細(xì)胞裂解產(chǎn)物或細(xì)胞上清中加入20 ii 1 6X loading buffer (0.35M Tris-HCl p朋.8， 30 %甘油，10 % SDS， 0. 012 %溴酚藍(lán)，6 % P -巰基乙醇)，充分混勻，100。C煮沸5min后，4。C 8000Xg，離心10min，取40ii1離心上清 加載至12% SDS-PAGE凝膠中，160V電泳lh。細(xì)胞裂解產(chǎn)物以GAPDH為內(nèi)參照調(diào)整樣品上 樣量，培養(yǎng)上清各泳道總蛋白上樣量為250 g。 2.非還原PAGE電泳向125iU收獲的細(xì)胞上清中加入25iil6Xnon-reduced loading buffer (0.35M Tris-HCl p朋.8， 30%甘油，10% SDS， 0. 012%溴酚藍(lán))，充分混勻， IO(TC煮沸2min后，4。C 8000Xg，離心10min，蛋白樣品加載至8% SDS-PAGE凝膠中，160V 電泳lh。各泳道總蛋白上樣量均為900 ii g。 3. Western blotting :電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉于37t:封閉2h。封閉后的PVDF膜與兔抗HA單克隆抗體(1 : 1000，購自美國CST)于4t:過 夜孵育，再與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG于37t:孵育lh。加入過氧化物酶 底物，顯示蛋白條帶。 轉(zhuǎn)染72h后，HE轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)量較HGwt轉(zhuǎn)染組提高45. 36% (圖3A，
3C)，分泌至上清中的目的蛋白較HGwt轉(zhuǎn)染組提高46. 02% (圖3B， 3D) 。 HGwt和HE轉(zhuǎn)染上
清中目的蛋白多以三聚體的形式存在分別為93. 00%和86. 10%，占有絕對優(yōu)勢，產(chǎn)物純度
較高(圖4)。其中HE轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清中三聚化目的蛋白產(chǎn)量較HGwt轉(zhuǎn)染組提高35. 19%。可見，tPA信號肽與三聚化模序MTQ組合后，不僅提高目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的表達(dá)
量，同時提高了三聚體蛋白的分泌水平，實現(xiàn)了目的蛋白的高效性三聚化分泌表達(dá)。 KLPI091012_2 序列表 〈110〉哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 〈120〉高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法 〈130>KLPI08056 〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 1
〈210>1
〈211〉 129
〈212>DNA 〈213>artifical sequences 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (1) (129) 〈223〉 〈400〉 1 gggggttctg gcgg朋tc朋ggaagagatt gcc朋朋tte 3ggagg朋c3 50 3gcte朋3te 3朋g3g朋g3 tegctga朋t cg3g朋朋g3 3ttgcag朋3 100 tcgaaaagag aattgctggt ggatgttgc 29 〈210>2 〈211>43 〈212>PRT 〈213〉A(chǔ)bies alba 〈400>2 Gly Gly Ser Gly Gly lie Lys Glu Glu lie Ala Lys lie Lys Glu Glu
15 10 15 Gin Ala Lys lie Lys Glu Lys lie Ala Glu lie Glu Lys Arg lie Ala
20 25 30 Glu lie Glu Lys Arg lie Ala Gly Gly Cys Cys
35 40
〈210>3 〈211〉69 〈212>DNA <213>homo sapiens 〈220〉 〈221>CDS 〈222〉 (1) (69) 〈223〉 〈400>3 atggatgcaa tgaag卿gg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc 50 agtcttcgtt tcgcccagc 69 <210>4 〈211>23 〈212〉PRT <213>homo sapiens 〈400>4 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 15 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser
20
權(quán)利要求
一種高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法，包括以下步驟(1)將tPA信號肽基因序列、目的蛋白基因序列和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列連接在一起，得到融合基因；其中，目的蛋白的N末端與tPA信號肽相連，目的蛋白的C末端與蛋白質(zhì)三聚化模序蛋白N末端相連；(2)將步驟(1)所得到的融合基因克隆至真核表達(dá)載體，構(gòu)建得到融合蛋白真核表達(dá)載體；(3)利用真核表達(dá)系統(tǒng)，體內(nèi)或體外表達(dá)融合蛋白，即得。
2. 按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)三聚化模序的基因序列所編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:2所示。
3. 按照權(quán)利要求2所述的表達(dá)方法，其特征在于，編碼蛋白質(zhì)三聚化模序的基因序列為SEQ ID NO :1所示。
4. 按照權(quán)利要求1所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述的tPA信號肽的氨基酸序列為SEQ ID NO :4所示。
5. 按照權(quán)利要求4所述的表達(dá)方法，其特征在于，編碼所述tPA信號肽基因序列為SEQID NO :3所示。
6. —種重組真核表達(dá)載體，其特征在于，包括tPA信號肽基因序列和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列。
7. 按照權(quán)利要求6所述的真核重組表達(dá)載體，其特征在于所述的蛋白質(zhì)三聚化模序的基因序列為SEQ ID NO :1所示。
8. 按照權(quán)利要求6所述的真核重組表達(dá)載體，其特征在于所述的tPA信號肽的基因序列為SEQ ID NO :3所示。
9. 權(quán)利要求6-8任何一項的重組真核表達(dá)載體在表達(dá)三聚體蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高分泌性三聚體蛋白的表達(dá)方法。該表達(dá)方法包括(1)將tPA信號肽基因序列、目的蛋白基因和蛋白質(zhì)三聚化模序基因序列連接在一起；其中，目的蛋白的N末端與tPA信號肽相連，其C末端與蛋白質(zhì)三聚化模序蛋白N末端相連；(2)將融合基因克隆至真核表達(dá)載體，得到融合蛋白真核表達(dá)載體；(3)體內(nèi)或體外表達(dá)融合蛋白，即得。本發(fā)明通過向目的蛋白的氨基端引入一個組織性纖溶酶原激活物tPA的信號肽序列以及向其羧基端引入一個三聚化蛋白模序MTQ，實現(xiàn)目的蛋白在真核細(xì)胞高水平分泌及三聚化表達(dá)，獲得功能性蛋白。本發(fā)明可廣泛用于天然以三聚體形式存在的病毒以及其他蛋白在真核細(xì)胞的分泌性高水平表達(dá)。
文檔編號C12N15/62GK101709305SQ200910223898
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者凌虹, 李妍, 楊丹, 王甲業(yè), 程德春, 陳文江 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)