本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及ZNF667蛋白的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：ZNF667是在大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)中發(fā)現(xiàn)的一種表達(dá)上調(diào)的基因，通過與基因庫的比對(duì)發(fā)現(xiàn)沒有與之對(duì)應(yīng)的序列，它是一個(gè)全新的基因，將其命名為ZNF667，Genbank登錄號(hào)為AY221750。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與之對(duì)應(yīng)的蛋白是一種KRAB型鋅指蛋白，含有14個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。ZNF667的ORF為1827bp，編碼608個(gè)氨基酸。目前對(duì)于ZNF667相關(guān)功能研究結(jié)果如下：(1)ZNF667是一種新發(fā)現(xiàn)的KRAB型鋅指蛋白，能抑制SRE和AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，具有轉(zhuǎn)錄抑制作用；(2)ZNF667定位在細(xì)胞核內(nèi)，主要在心臟和腦組織中表達(dá)，在肝、腎、骨骼肌、睪丸中表達(dá)次之，在其他組織表達(dá)則較少；(3)ZNF667基因在缺血、缺氧、炎癥、氧化應(yīng)激條件下表達(dá)增多，具有典型的應(yīng)激反應(yīng)性；(4)ZNF667在應(yīng)激狀態(tài)下促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；(5)ZNF667具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，H2O2處理H9C2心肌細(xì)胞再瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ZNF667后能明顯的抑制Fas等蛋白的表達(dá)，且這種抗凋亡作用與直接和Fas啟動(dòng)子結(jié)合而抑制其表達(dá)有關(guān)；ZNF667能抑制TNF-ɑ所致的細(xì)胞凋亡，且這種抗凋亡作用也與直接和Bid啟動(dòng)子結(jié)合而抑制其表達(dá)有關(guān)。(6)ZNF667過表達(dá)后可以通過抑制Bax和P53的表達(dá)。有關(guān)ZNF667的功能學(xué)研究表明：腦星形細(xì)胞瘤病理級(jí)別的升高，ZNF667mRNA及蛋白的含量呈上升趨勢(shì)，尤其是在惡性程度高的Ⅲ、Ⅳ級(jí)腦星形細(xì)胞瘤中，含量明顯升高。但是ZNF667在其他癌中的表達(dá)，運(yùn)用ZNF667短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒對(duì)癌癥進(jìn)行治療，尚沒有任何研究。本發(fā)明通過使用ZNF667發(fā)夾干擾RNA(shRNA)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞系,建立ZNF667穩(wěn)定削減的肝癌細(xì)胞系，通過研究發(fā)現(xiàn)，HepG2-ZNF667-shRNA細(xì)胞系表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減慢，克隆形成率減低，浸潤(rùn)與侵襲能力下降。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制HepG2細(xì)胞中ZNF667的表達(dá)，可以從在體水平抑制HepG2細(xì)胞成瘤。本發(fā)明從細(xì)胞功能學(xué)水平和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平證實(shí)了削減HepG2肝癌細(xì)胞中的ZNF667蛋白的表達(dá)，可以抑制HepG2細(xì)胞的惡性度，起到治療作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是通過構(gòu)建一種ZNF667蛋白的發(fā)夾短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒，探討削減ZNF667蛋白對(duì)HepG2細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，進(jìn)而將這種質(zhì)粒用于抑制肝癌的治療。一種ZNF667蛋白的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒，根據(jù)ZNF667的序列設(shè)計(jì)能夠產(chǎn)生干擾ZNF667蛋白表達(dá)的siRNA的DNA片段，插入到短發(fā)夾RNA干擾載體中構(gòu)建而成。上述質(zhì)粒以人ZNF667的mRNA序列為模板，以及載體啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)siRNA對(duì)序列的要求，設(shè)計(jì)合成能夠產(chǎn)生干擾ZNF667蛋白表達(dá)的siRNA的DNA片段。siRNA干擾的目標(biāo)基因ZNF667序列如下：siRNA-1：CGAATATCTCTCACACGACAT；siRNA-2：CGCCAATCATTTCTTATTGAA；siRNA-3：CAACCCTTATTCTGCATCTAA。優(yōu)選為siRNA-2：CGCCAATCATTTCTTATTGAA上述質(zhì)粒選用的原始質(zhì)粒表達(dá)載體優(yōu)選為pRNAT-U6.1/Neo。DNA片段插入到載體時(shí)的酶切位點(diǎn)為BamHI和HindIII。根據(jù)ZNF667的序列設(shè)計(jì)能夠產(chǎn)生干擾ZNF667蛋白表達(dá)的siRNA的DNA片段，具體序列如下：ZNF667-shRNA-1a鏈序列：5’-GATCCCCGAATATCTCTCACACGACATCTCGAGATGTCGTGTGAGAGATATTCGTTTTTGGAT-3’ZNF667-shRNA-1b鏈序列：5’-AGCTATCCAAAAACGAATATCTCTCACACGACATCTCGAGATGTCGTGTGAGAGATATTCGGG-3’ZNF667-shRNA-2a鏈序列：5’-GATCCCCGCCAATCATTTCTTATTGAACTCGAGTTCAATAAGAAATGATTGGCGTTTTTGGAT-3’ZNF667-shRNA-2b鏈序列：5’-AGCTATCCAAAAAGCCAATCATTTCTTATTGAACTCGAGTTCAATAAGAAATGATTGGCGGG-3’ZNF667-shRNA-3a鏈序列:5’-GATCCCCAACCCTTATTCTGCATCTAACTCGAGTTAGATGCAGAATAAGGGTTGTTTTTGGAT-3’ZNF667-shRNA-3b鏈序列:5’-AGCTATCCAAAAACAACCCTTATTCTGCATCTAACTCGAGTTAGATGCAGAATAAGGGTTGGG-3’。對(duì)照shRNAa鏈序列:5’-GATCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAT-3’對(duì)照shRNAb鏈序列:5’-AGCTATCCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAAGG-3’。構(gòu)建的三個(gè)ZNF667短發(fā)夾干擾質(zhì)粒載體的序列見SEQNO:17-19。優(yōu)選見SEQNO:18。所述的ZNF667蛋白的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒的應(yīng)用方法，用于制備抑制肝癌的制劑。本發(fā)明通過在線生物信息學(xué)軟件選擇設(shè)計(jì)ZNF667的干擾序列，按照RNA干擾的原則構(gòu)建ZNF667的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒。質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選含有ZNF667的siRNA序列的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒采用氨芐青霉素(ampicilin,Amp)抗性基因做為篩選標(biāo)志。采用新霉素(G418)篩選方法構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA和其空白對(duì)照質(zhì)粒的HEPG2細(xì)胞株。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒ZNF667-shRNA，轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒，空白細(xì)胞的三組HepG2細(xì)胞株的增殖，克隆形成實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)三組細(xì)胞株的克隆形成能力。劃痕試驗(yàn)檢測(cè)三組細(xì)胞的遷移能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其浸潤(rùn)能力。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)從在體層次檢驗(yàn)三組細(xì)胞的惡性程度，免疫印跡檢測(cè)靶點(diǎn)分子P53，Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果是本發(fā)明成功的構(gòu)建了ZNF667發(fā)夾干擾質(zhì)粒(ZNF667-shRNA)，并將其轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾質(zhì)粒ZNF667-shRNA的細(xì)胞株。MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染了ZNF667-shRNA的細(xì)胞株生長(zhǎng)較HepG2，HepG2-ZNF667E(轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒)細(xì)胞顯著減慢；細(xì)胞克隆形成能力較空白對(duì)照HepG2組和空白對(duì)照質(zhì)粒組HepG2-ZNF667E組減弱；劃痕實(shí)驗(yàn)表明：和HepG2空白細(xì)胞，HepG2-ZNF667E(即轉(zhuǎn)空白對(duì)照質(zhì)粒細(xì)胞株NC組)相比，轉(zhuǎn)染了ZNF667-shRNA的細(xì)胞株的遷移距離在24小時(shí)，48小時(shí)明顯降低；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染了ZNF667-shRNA的細(xì)胞株細(xì)胞侵襲能力較HepG2組和HepG2-ZNF667E組減弱。免疫印跡結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了ZNF667-shRNA的細(xì)胞中的P53的表達(dá)較HepG2，HepG2-ZNF667E組細(xì)胞株明顯升高,Bcl-2的表達(dá)較HepG2，HepG2-ZNF667E細(xì)胞株明顯降低。這為肝癌的治療提供了新的途徑和思路。附圖說明圖1為ZNF667-shRNA-1a鏈測(cè)序結(jié)果；圖2為ZNF667-shRNA-2a鏈測(cè)序結(jié)果；圖3為ZNF667-shRNA-3a鏈測(cè)序結(jié)果；圖4為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)、ZNF667-shRNA1(Sh1)、ZNF667-shRNA2(Sh2)、ZNF667-shRNA3(Sh3)質(zhì)粒后，以及空白細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè)條帶；圖5為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)、ZNF667-shRNA1(Sh1)、ZNF667-shRNA2(Sh2)、ZNF667-shRNA3(Sh3)質(zhì)粒后，以及空白細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè)削減效率；*和空白細(xì)胞相比，&和空白對(duì)照質(zhì)粒組相比；圖6為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA，NC(空白對(duì)照質(zhì)粒)和Con(空白細(xì)胞)的HepG2細(xì)胞中ZNF667蛋白進(jìn)行Westernblot檢測(cè)結(jié)果；圖7為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA，NC(空白對(duì)照質(zhì)粒)和Con(空白細(xì)胞)的HepG2細(xì)胞中ZNF667蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*和空白細(xì)胞相比，&和空白對(duì)照質(zhì)粒組相比；圖8為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)生長(zhǎng)曲線圖；*和Con(空白細(xì)胞)相比，#和NC(空白對(duì)照質(zhì)粒)組相比；圖9為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)細(xì)胞克隆形成圖；圖10為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)細(xì)胞克隆的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；圖11為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)的TransWell實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖12為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)TransWell實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果；*和Con(空白細(xì)胞)相比，&和NC(空白對(duì)照質(zhì)粒)組相比；圖13為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖14為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果；*和Con(空白細(xì)胞)相比，#和NC(空白對(duì)照質(zhì)粒)組相比；圖15為Westernblot檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)中P53和Bcl2、ZNF667蛋白表達(dá)；圖16為Westernblot檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)中Bcl2蛋白表達(dá)分析結(jié)果；*和Con(空白細(xì)胞)相比，#和NC(空白對(duì)照質(zhì)粒)組相比；圖17為Westernblot檢測(cè)HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和Con(空白細(xì)胞)中P53蛋白表達(dá)分析結(jié)果；*和Con(空白細(xì)胞)相比，#和NC(空白對(duì)照質(zhì)粒)組相比；圖18為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和HepG2(空白細(xì)胞)三組細(xì)胞裸鼠成瘤實(shí)物體積和生長(zhǎng)曲線圖；圖19為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和HepG2(空白細(xì)胞)三組細(xì)胞裸鼠成瘤瘤體體積及重量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；圖20為HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA質(zhì)粒、空白對(duì)照質(zhì)粒(NC)后和HepG2(空白細(xì)胞)三組細(xì)胞裸鼠成瘤，瘤體中ZNF667蛋白的含量檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。材料和方法：材料：人肝癌細(xì)胞株HepG2購自中南大學(xué)細(xì)胞分子中心，正常生長(zhǎng)培基為1640+10％FBS，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)。質(zhì)粒表達(dá)載體pRNAT-U6.1/Neo,全長(zhǎng)6380bp(見序列表中SEQNO.21),包含綠色熒光蛋白(Geenfluorescentprotein,GFP)做為檢識(shí)標(biāo)記,氨芐青霉素(ampicilin,Amp)抗性基因做為原核篩選標(biāo)志,用來篩選已經(jīng)成功把shRNA片段克隆入pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒，新霉素(neomycin,又被稱為G418)抗性基因做為真核篩選標(biāo)志,用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了ZNF667-shRNA質(zhì)粒的細(xì)胞。克隆酶切位點(diǎn)BamHI和HindIII。保證插入片段的方向正確,防止載體自體連接。此載體購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。方法：1.ZNF667干擾位點(diǎn)的選擇及寡脫氧核苷酸的設(shè)計(jì)在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找人ZNF667的mRNA完整序列,以此為模板,同時(shí)參考siRNA設(shè)計(jì)原則。根據(jù)干擾載體pRNAT-U6.1/Neo啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)siRNA對(duì)序列的要求,利用在線siRNATatgetfinder軟件(http://genomics.jp/sidirect/)設(shè)計(jì)合成3條針對(duì)人ZNF667序列的siRNA的DNA片段。在線輸入ZNF667mRNA1序列(NM_022103.3)分析獲得的序列,選擇GC含量在40％～55％之間的靶基因序列作為潛在優(yōu)選,并在GenBank表達(dá)序列標(biāo)簽(EsT)數(shù)據(jù)庫中用BLAsT檢索,將選定的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,排除和其他編碼序列同源的序列,以確定其為特異性序列。為了提高序列正確退火成為雙鏈DNA分子的效率,將包含能夠產(chǎn)生干擾目的基因表達(dá)的siRNA序列的DNA按照以下原則設(shè)計(jì)為a鏈和b鏈寡核苷酸序列,在a鏈和b鏈序列加入間隔序列CTCGAG,以避免形成終止信號(hào),使其能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),a鏈模板的5'端添加了GATCCC，b鏈模板的3’端添加了GG，與BamHI切后形成的粘性末端互補(bǔ)，a鏈3’端添加了TTTTTGGAT，b鏈模板的5'端添加了AGCTATCCAAAAA，與HindIII酶切后形成的粘性末端互補(bǔ)。針對(duì)ZNF667的3個(gè)siRNA的a鏈和b鏈由上海吉?jiǎng)P基因有限公司合成。作為ZNF667的短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒的空白對(duì)照質(zhì)粒的shRNA序列(shRNA-NC)的a鏈和b鏈由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。2.ZNF667siRNA干擾片段合成將合成的八條Oligo片段先稀釋成100μM，兩兩配對(duì)各吸5μL混在一管中，混勻后置于PCR儀中95℃,5min，室溫靜置20min，形成雙鏈Oligo片段。然后再將雙鏈OligoDNA片段稀釋成10μM，用于插入到pRNAT-U6.1/Neo雙酶切產(chǎn)生的載體酶切片段中。表1構(gòu)建的干擾質(zhì)粒序列3.shRNA載體的構(gòu)建使用BamHI和HindIII對(duì)pRNAT-U6.1/Neo載體進(jìn)行酶切消化，將消化后的產(chǎn)物置于37℃，4h，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離,膠回收試劑盒回收純化大片段備用。按Takara公司說明書，將載體與插入子按照一定的比例匹配，設(shè)置連接反應(yīng)，16℃反應(yīng)過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌DH5α菌種中,氨芐青霉素篩選,挑取陽性克隆,搖菌、小提質(zhì)粒，構(gòu)建的3個(gè)ZNF667shRNA真核載體分別命名為ZNF667-shRNA1,ZNF667-shRNA2,ZNF667-shRNA3，無意對(duì)照shRNA真核載體被命名NC。構(gòu)建的載體還需后繼進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)行驗(yàn)證。4.shRNA載體的鑒定抽提質(zhì)粒后送上海申工公司測(cè)序。5.干擾質(zhì)粒的削減效率的鑒定將1×105個(gè)HepG2細(xì)胞接種至已用0.1％明膠包被過的6孔板中，鋪板48小時(shí)后轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染共分成5組：空白細(xì)胞組，轉(zhuǎn)染三個(gè)shRNA組和空白對(duì)照shRNA組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照LipofectaminTM2000說明書操作，所有細(xì)胞均放在37℃，5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，48小時(shí)后收取總蛋白。通過檢測(cè)ZNF667蛋白的表達(dá)來確定3個(gè)發(fā)夾短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒的削減效率。最終定下2號(hào)質(zhì)粒ZNF667-shRNA2為最佳備選質(zhì)粒。6.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA2載體的HepG2細(xì)胞株的建立①細(xì)胞準(zhǔn)備培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至80～90％滿瓶，消化收集細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種2個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種2mL細(xì)胞懸液，每株細(xì)胞接種1孔，37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)至細(xì)胞80％滿孔時(shí)開始轉(zhuǎn)染。②質(zhì)粒轉(zhuǎn)染種板后次日，各取4μg質(zhì)粒(將空白載體編號(hào)為ZNF667-E、上述的2號(hào)質(zhì)粒編號(hào)為ZNF667-AS2)分別用0.25mL無血清培養(yǎng)基稀釋，充分混勻5min。取20μL(10μL×2)lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，用0.5mL(0.25mL×2)無血清培養(yǎng)基稀釋，充分混勻5min。6孔板細(xì)胞棄完全培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，同時(shí)補(bǔ)加0.5mL無血清培養(yǎng)基。分別取0.25mL兩種質(zhì)粒懸液加入轉(zhuǎn)染試劑的2個(gè)離心管中，混勻。室溫靜置20min，并在30min內(nèi)加入六孔板中。③細(xì)胞篩選HepG2細(xì)胞G418預(yù)篩選：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至80～90％滿瓶，消化收集細(xì)胞，以1×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種24孔板中，調(diào)整G418濃度為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000g/ml加入24孔中，觀察細(xì)胞。最終挑選600μg/mL，為G418篩選濃度。穩(wěn)株篩選：將上述已經(jīng)轉(zhuǎn)染ZNF667-E、ZNF667-AS2的HepG2細(xì)胞標(biāo)記為HepG2-ZNF667-E、HepG2-ZNF667-AS2。轉(zhuǎn)染48h后，加入600μg/mL的G418到六孔板中，觀察細(xì)胞，每?jī)商鞊Q液，7天后HepG2組細(xì)胞基本死亡，調(diào)整G418濃度為200μg/mL為維持濃度，繼續(xù)培養(yǎng)，擴(kuò)增細(xì)胞：10天培養(yǎng)后HepG2組細(xì)胞全部死亡，其他組(即轉(zhuǎn)染了ZNF667-E和ZNF667-AS2的HepG2細(xì)胞組)降低G418濃度至200μg/mL，維持200μg/mL的G418濃度擴(kuò)增細(xì)胞至滿瓶。7.細(xì)胞增殖能力檢測(cè)①M(fèi)TT法分別收集各組對(duì)數(shù)期HepG2穩(wěn)定株細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度；取3塊96孔板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，鋪板使待測(cè)細(xì)胞為2×103cell/孔(邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng))，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；5％CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于24h，48h，72h后取出一塊96孔板檢測(cè)：檢測(cè)時(shí)每孔加入10μLMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h,終止培養(yǎng)；每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔波長(zhǎng)490nm的吸光值。②克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組HepG2細(xì)胞(共3組)，用胰酶消化液消化并用1640完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，使單個(gè)細(xì)胞百分率在95％以上。細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用含10％FBS的1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/ml備用；接種35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，200cells/孔，每組細(xì)胞重復(fù)種3個(gè)孔，以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。補(bǔ)足3ml完全培養(yǎng)基，充分混勻后置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。固定與染色：棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。每孔加2mL4％多聚甲醛固定細(xì)胞15min。去固定液，加1mlGIMSA染色液染色20min，流水緩慢沖洗去除多余染色液，空氣干燥。計(jì)數(shù)克?。簩⑵桨宓怪貌B加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)量。結(jié)果計(jì)算采用如下公式：克隆形成率＝(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100％。8.浸潤(rùn)功能檢測(cè)(Transwell侵襲實(shí)驗(yàn))分別消化收集各組HepG2細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells/ml。吸掉已充分浸潤(rùn)基底層膜后的侵襲小室內(nèi)的培養(yǎng)基；加500μL的含有10％FBS的培養(yǎng)基至下室(侵襲小室外，24孔板孔內(nèi))；加200μL已調(diào)節(jié)好細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液至侵襲小室內(nèi)；37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h；用棉簽輕柔擦拭以去除侵襲小室內(nèi)未侵過基底層膜的細(xì)胞，以及基底層(ECMatrixgel)，小心操作以免刺穿底層聚碳酸酯膜；在新的24孔板孔中加500μL染色液，分別將侵襲小室浸入染色20min；將侵襲小室在有水的燒杯中浸沒幾次沖洗掉多余的染料，然后在空氣中干燥；通過顯微鏡隨機(jī)取不同視野拍照采集；然后用10％的乙酸溶解膜上的染料,500μL/孔,再轉(zhuǎn)至96孔板中(150μL/孔)，檢測(cè)570nm波長(zhǎng)下各孔OD值。9.遷移能力檢測(cè)(劃痕實(shí)驗(yàn))分別消化收集各組HepG2細(xì)胞，用含10％FBS的培養(yǎng)基將各組細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板；待細(xì)胞鋪滿孔底，用20μL的tip頭垂直板面劃痕，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，將脫落下來的細(xì)胞洗去；用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，24h后更換成含3％FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；以劃痕時(shí)間為起點(diǎn)，每隔24h拍攝各組細(xì)胞圖片。10.裸鼠移植瘤動(dòng)物模型制備①9只裸鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為3組:HepG2細(xì)胞,ZNF667-NC組，ZNF667-shRNA組；②將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期癌細(xì)胞培養(yǎng)液丟棄,用無菌中性PBS洗滌細(xì)胞2次,用0.25％的胰蛋白酶消化,從培養(yǎng)瓶洗脫下,吹打成單細(xì)胞懸液,1000轉(zhuǎn)/min離心smin,收集細(xì)胞,用0.9％的生理鹽水懸浮細(xì)胞,定容,并將細(xì)胞密度調(diào)至注射的細(xì)胞量為2×106個(gè)細(xì)胞/ml.③對(duì)超凈臺(tái)紫外燈照射30分鐘,75％酒精擦拭臺(tái)面；用75％酒精擦培養(yǎng)籠,其它用具均高壓滅菌處理。注射細(xì)胞懸液前用75％酒精局部皮膚消毒裸鼠接種處皮膚,每只裸鼠接種0.2ml細(xì)胞懸液,用無菌一次性注射器分別接種于裸鼠頸背部或腋下皮下。④接種后每3天密切觀察成瘤情況及腫瘤的生長(zhǎng)情況。裸鼠致瘤成功后每5天測(cè)量腫瘤體積并記錄,繪制各組種植瘤生長(zhǎng)曲線。第42日實(shí)驗(yàn)結(jié)束,以脫頸法處死所有裸鼠,解剖取出腫瘤組織,測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑和橫徑,稱取腫瘤質(zhì)量。用公式分別計(jì)算腫瘤體積。計(jì)算公式如下:腫瘤體積＝腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑2×0.5。結(jié)果：1.ZNF667-shRNA質(zhì)粒的鑒定挑選陽性菌落，抽提質(zhì)粒，以T7為測(cè)序引物，對(duì)構(gòu)建載體進(jìn)行序列通測(cè)，通過測(cè)序峰圖進(jìn)行核對(duì)分析，證實(shí)插入片段為FoxA1shRNADNA片段，且無堿基突變(圖1-圖3)，說明shRNA載體構(gòu)建成功，符合預(yù)期設(shè)計(jì),能夠表達(dá)siRNA，預(yù)期能對(duì)ZNF667蛋白的表達(dá)予以消減。2.ZNF667-shRNA對(duì)HepG2細(xì)胞中ZNF667蛋白表達(dá)的抑制作用Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染sh短發(fā)夾RNA干擾質(zhì)粒后HepG2細(xì)胞ZNF667蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在HepG2細(xì)胞中，收集空白質(zhì)粒對(duì)照組、ZNF667-con組(空白細(xì)胞組)和ZNF667-shRNA1(轉(zhuǎn)染1號(hào)質(zhì)粒)、ZNF667-shRNA2(轉(zhuǎn)染2號(hào)質(zhì)粒)、ZNF667-shRNA3(轉(zhuǎn)染3號(hào)質(zhì)粒)總共5組的標(biāo)化細(xì)胞總蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示ZNF667-shRNA1、ZNF667-shRNA2、ZNF667-shRNA3組蛋白表達(dá)條帶比空白細(xì)胞組(Con)和空白質(zhì)粒(NC)組條帶明顯減弱(圖4)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證實(shí)這三組質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞的干擾效果都具有顯著性差異(圖5)，ZNF667-shRNA2的干擾效率是最佳的，被確定為可用于后繼實(shí)驗(yàn)的干擾質(zhì)粒。3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA2質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞株的建立與鑒定按照前述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立的方法，篩選HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的最佳G418濃度為600ug/ml，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，維持培養(yǎng)濃度為200ug/ml。最終建立的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株被命名為ZNF667-shRNA(HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA2質(zhì)粒組),NC(空白對(duì)照質(zhì)粒組)。收集轉(zhuǎn)染了ZNF667-shRNA，NC和空白細(xì)胞蛋白，進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，將膠片進(jìn)行掃描，用圖像分析軟件IPP6.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析(圖6)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明(圖7)，ZNF667-shRNA2質(zhì)粒在穩(wěn)定轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞中后，能夠削減90％的蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染了ZNF667-shRNA，NC和空白細(xì)胞中ZNF667的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.ZNF667-shRNA細(xì)胞增殖能力減弱采用基于3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide(化學(xué)名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測(cè)三株細(xì)胞的增殖能力。使用酶標(biāo)儀在490mM波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。從而間接地反應(yīng)細(xì)胞的增殖。0小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)與72小時(shí)490mM波長(zhǎng)處的OD值見表1，曲線分析表明：HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒ZNF667-NC后，穩(wěn)定株細(xì)胞生長(zhǎng)較HepG2細(xì)胞稍有減慢；HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZNF667-shRNA2質(zhì)粒后，細(xì)胞株生長(zhǎng)較HepG2-NC和空白細(xì)胞顯著減慢(圖8)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1HepG2各組穩(wěn)定株細(xì)胞MTT不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)5.穩(wěn)轉(zhuǎn)ZNF667-shRNA(2號(hào)質(zhì)粒)的HepG2細(xì)胞株克隆形成能力降低克隆形成試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ZNF667-shRNA后，ZNF667-shRNA組細(xì)胞克隆形成能力較HepG2組減弱，較空白對(duì)照質(zhì)粒組NC減弱(圖9，表2)?？寺⌒纬傻牟町惥哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖10)。表2.HepG2各組克隆形成率數(shù)據(jù)6.穩(wěn)轉(zhuǎn)ZNF667-shRNA(2號(hào)質(zhì)粒)的HepG2細(xì)胞株浸潤(rùn)與遷移能力降低采用劃痕試驗(yàn)與transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)ZNF667的表達(dá)改變是否能夠影響HepG2細(xì)胞的侵襲能力。Transwell侵襲試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用醋酸洗脫液在酶標(biāo)儀上570nm的OD值來間接代表穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染了ZNF667-shRNA的細(xì)胞株侵襲能力下降，具體表現(xiàn)為570nm波長(zhǎng)時(shí)吸光值下降了25％(圖11，表3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ZNF667-shRNA組細(xì)胞侵襲能力較HepG2組減弱，較空白對(duì)照質(zhì)粒組NC組減弱，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖12)。表3HepG2三組細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果ConNCZNF667-shRNAOD1.233±0.0261.228±0.0280.814±0.029劃痕實(shí)驗(yàn)(Scratchingtest)是一種用于檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)方法，該實(shí)驗(yàn)可用于檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。在全部三組細(xì)胞細(xì)胞鋪滿孔底后，使用10ul槍頭垂直板面劃痕，以劃痕時(shí)間為起點(diǎn)，每隔24h拍攝各組細(xì)胞圖片，和HepG2細(xì)胞，NC組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株相比，HepG2-ZNF667-shRNA細(xì)胞株的遷移距離在24小時(shí)，48小時(shí)明顯降低(表4，圖13)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖14)。表4.HepG2三組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)遷移距離(mm)7HepG2三株細(xì)胞中的P53,Bcl-2蛋白的表達(dá)為了進(jìn)一步探討削減ZNF667蛋白表達(dá)是如何引起HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖，浸潤(rùn)及侵襲能力的改變的，選擇了Bcl2,P53兩個(gè)蛋白為靶點(diǎn)分子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，和HepG2細(xì)胞及NC細(xì)胞株相比，HepG2-ZNF667-shRNA細(xì)胞株中的P53和Bcl2兩個(gè)蛋白表達(dá)有明顯改變。Bcl2蛋白的表達(dá)明顯降低，p53蛋白的表達(dá)明顯升高(圖15)，圖16和17為Bcl2蛋白和P53蛋白表達(dá)分析結(jié)果；結(jié)果表明，削減HepG2三個(gè)細(xì)胞株中的ZNF667蛋白極有可能是通過降低Bcl2，升高p53的表達(dá)來達(dá)到改變HepG2細(xì)胞的生物學(xué)特性，從而從體外細(xì)胞水平表現(xiàn)出削減其惡性程度的。8.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)將HepG2細(xì)胞及HepG2-NC細(xì)胞株，HepG2-ZNF667-shRNA細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。第42天處死裸鼠，老鼠的成瘤體積以及生長(zhǎng)曲線見圖18.瘤體體積及重量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見圖19，三組細(xì)胞裸鼠成瘤，瘤體中ZNF667蛋白的含量檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見圖20。SEQUENCELISTING<110>中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院<120>一種ZNF667蛋白的RNA干擾質(zhì)粒及其應(yīng)用方法<130>無<160>21<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>siRNA-1<400>1cgaatatctctcacacgacat21<210>2<211>22<212>DNA<213>siRNA-2<400>2cgccaatcatttcttattgaac22<210>3<211>21<212>DNA<213>siRNA-3<400>3caacccttattctgcatctaa21<210>4<211>63<212>DNA<213>ZNF667-shRNA-1a鏈序列<400>4gatccccgaatatctctcacacgacatctcgagatgtcgtgtgagagatattcgtttttg60gat63<210>5<211>63<212>DNA<213>ZNF667-shRNA-1b鏈序列<400>5agctatccaaaaacgaatatctctcacacgacatctcgagatgtcgtgtgagagatattc60ggg63<210>6<211>64<212>DNA<213>ZNF667-shRNA-2a鏈序列<400>6gatccccgccaatcatttcttattgaactcgagttcaataagaaatgattggcgtttttg60gat63<210>7<211>62<212>DNA<213>ZNF667-shRNA-2b鏈序列<400>7agctatccaaaaagccaatcatttcttattgaactcgagttcaataagaaatgattggcg60gg62<210>8<211>63<212>DNA<213>ZNF667-shRNA-3a鏈序列<400>8gatccccaacccttattctgcatctaactcgagttagatgcagaataagggttgtttttg60gat63<210>9<211>63<212>DNA<213>ZNF667-shRNA-3b鏈序列<400>9agctatccaaaaacaacccttattctgcatctaactcgagttagatgcagaataagggtt60ggg63<210>10<211>59<212>DNA<213>對(duì)照shRNAa鏈序列<400>10gatcccttctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaatttttggat59<210>11<211>59<212>DNA<213>對(duì)照shRNAb鏈序列<400>11agctatccaaaaattctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaagg59<210>12<211>6<212>DNA<213>a鏈和b鏈序列加入間隔序列<400>12ctcgag6<210>13<211>6<212>DNA<213>a鏈模板的5'端添加的序列<400>13gatccc6<210>14<211>2<212>DNA<213>b鏈模板的3'端添加的序列<400>14gg2<210>15<211>9<212>DNA<213>a鏈3'端添加的序列<400>15tttttggat9<210>16<211>13<212>DNA<213>b鏈模板的5'端添加的序列<400>16agctatccaaaaa13<210>17<211>938<212>DNA<213>質(zhì)粒shRNA1<400>17tccggatctcctaagggaggagagcatgaattctcgagcggccgcccccttcaccgaggg60cctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataat120tggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagta180ataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgct240taccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaa300caccggcgaatatctctcacacgacatctcgagatgtcgtgtgagagatattcgttttta360attctcgacctcgagacaaatgcagtattcatccacaagcttaagtttaaaccgctgatc420agcctcgactgtgccttctaaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccata480tatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacga540cccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggacttt600ccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagt660gtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggca720ttatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagt780catcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtt840tgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggca900ccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaact938<210>18<211>1008<212>DNA<213>質(zhì)粒shRNA2<400>18tttccctcacttaaggggaggagaagcatgaattctcgagcggccgcccccttcaccgag60ggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagata120attggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaag180taataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatg240cttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacga300aacaccggcgccaatcatttcttattgaactcgagttcaataagaaatgattggcgtttt360taattctcgacctcgagacaaatggcagtattcatccacaagcttaagtttaaaccgctg420atcagcctcgactgtgccttctaaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagccc480atatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaa540cgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggac600tttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatca660agtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctg720gcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtatt780agtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcatgggcgtggatagcgg840tttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatggagtttgttttggc900accaaatcaccggactttccaaaatgtcgtacactccgccccattgacgcaaatgggcgg960tagccgtgtacggtgggagttctatataagtccgagctggttagtgac1008<210>19<211>1017<212>DNA<213>質(zhì)粒shRNA3<400>19tcccgtcactaagggaggagagcatgaattctcgagcggccgcccccttcaccgagggcc60tatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattg120gaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaat180aatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgctta240ccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaaca300ccggcaacccttattctgcatctaactcgagttagatgcagaataagggttgtttttaat360tctcgacctcgagacaaatggcagtattcatccacaagcttaagtttaaaccgctgatca420gcctcgactgtgccttctaaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatat480atggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgac540ccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttc600cattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtg660tatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcat720tatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtc780atcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggttt840gactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcac900caaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtacaactccgccccattgacgcaatggggcg960gtaggcggggtacggtgggaggtctaatataaggcagaagctggtttagtgaaccgt1017<210>20<211>1010<212>DNA<213>con-shRNA<400>20tacctcactaagggaggagaagcatgaattccccagtggaaagacgcgcaggcaaaacgc60accacgtgacggagcgtgaccgcgcgccgagcgcgcgccaaggtcgggcaggaagagggc120ctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataatt180agaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaa240taatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgctt300accgtaacttgaaagtatttcgatttcttgggtttatatatcttgtggaaaggacgcggg360atcccttctccgaacgtgtcacgtctcgagacgtgacacgttcggagaatttttggatag420cttaagtttaaaccgctgatcagcctcgactgtgccttctaaatagtaatcaattacggg480gtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggccc540gcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccat600agtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgc660ccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatga720cggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttg780gcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcgggttttggcagtaca840tcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacg900tcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtacaactc960cgccccattgacgcaaatggggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctat1010<210>21<211>6380<212>DNA<213>pRNAT-U6.1/neo載體<400>21aatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgggtttatatat60cttgtggaaaggacgcgggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaaccgctgatca120gcctcgactgtgccttctaaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatat180atggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgac240ccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttc300cattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtg360tatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcat420tatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtc480atcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggttt540gactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcac600caaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggc660ggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatc720cgctagcgctaccggtcgccaccatggccagcaagggcgaggagctgttcaccggcgtgg780tgcccatcctggtggagctggacggcgatgtgaatggccacaagttcagcgtgagcggcg840agggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggca900agctgcctgtgccctggcccaccctggtgaccaccctgagctacggcgtgcagtgcttct960cacgctaccccgatcacatgaagcagcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggct1020acatccaggagcgcaccatcttcttcgaggatgacggcaactacaagtcgcgcgccgagg1080tgaagttcgagggcgataccctggtgaatcgcatcgagctgaccggcaccgatttcaagg1140aggatggcaacatcctgggcaataagatggagtacaactacaacgcccacaatgtgtaca1200tcatgaccgacaaggccaagaatggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcg1260aggatggcagcgtgcagctggccgaccactaccagcagaatacccccatcggcgatggcc1320ctgtgctgctgcccgataaccactacctgtccacccagagcgccctgtccaaggacccca1380acgagaagcgcgatcacatgatcctgctggagttcgtgaccgccgccggcatcacccacg1440gcatggacgagctgtacaagtgaggactagataactgaacttgtttattgcagcttataa1500tggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgca1560ttctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtgggaagacaat1620agcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctgg1680ggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtg1740gttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttc1800ttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctc1860cctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggt1920gatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggag1980tccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcg2040gtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgag2100ctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtg2160gaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcag2220caaccagg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