專利名稱：深藍(lán)色熒光蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有改良的熒光特性的熒光蛋白質(zhì)、尤其是發(fā)出深藍(lán)色光的熒光蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
來源于發(fā)光水母的其中一種維多利亞多管發(fā)光水母(Aequorea victoria)的熒光 蛋白質(zhì)、即GFP(Green Fluorescence Protein)具有395nm的激發(fā)光譜峰和509nm的發(fā)光光 譜峰，是一種發(fā)出綠色光的蛋白質(zhì)(Chalfie等人、Science、1994年、第263卷、第802-805 頁)。該蛋白質(zhì)在高溫下穩(wěn)定(Tm = 780C )，在離液(chaotropic)試劑(例如8M尿素)中 穩(wěn)定，其具有以與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的形態(tài)較為穩(wěn)定地表達(dá)，通過其熒光發(fā)色可以 目測(cè)該融合蛋白質(zhì)的存在等優(yōu)點(diǎn)，可以使用無損傷的生物體或細(xì)胞，確認(rèn)或觀察生物體或 細(xì)胞內(nèi)特定物質(zhì)的局部存在性、進(jìn)而進(jìn)行特定基因表達(dá)的確認(rèn)，這給分子生物學(xué)中的研究 帶來大的變革?，F(xiàn)在廣泛進(jìn)行了進(jìn)一步提高這種熒光蛋白質(zhì)的有用性的研究，有許多關(guān)于將GFP 的特定氨基酸殘基取代為其它氨基酸的人工突變體的報(bào)告。GFP的人工突變體的構(gòu)建目的 大致分為熒光強(qiáng)度的增加和發(fā)光光譜的偏移。尤其是，通過使用多種發(fā)光光譜發(fā)生偏移的 熒光蛋白質(zhì)，可以同時(shí)確認(rèn)多種不同物質(zhì)的局部存在性或多個(gè)基因的表達(dá)，由此達(dá)到了關(guān) 于發(fā)出各種熒光色的突變體的報(bào)告?，F(xiàn)已報(bào)道的GFP的人工突變體的突變部位和特征，可以列舉例如下述的例子。而 且，GFP的人工突變體突變體的表述，例如野生型GFP的氨基酸序列的N末端起的第66位 的氨基酸殘基酪氨酸(Y，以下只要沒有特別事先說明，氨基酸用單字母表示)被取代為H的 突變體表示為Y66H，多個(gè)氨基酸殘基同時(shí)被取代的突變體的各個(gè)取代用連字符(-)連接。Y66H:是發(fā)出藍(lán)色的熒光蛋白質(zhì)，熒光強(qiáng)度低，發(fā)光急速消失(非專利文獻(xiàn)1)V163A 是發(fā)出藍(lán)色的熒光蛋白質(zhì)，而且V163A-S175G獲得耐熱性，具有增強(qiáng)的熒 光強(qiáng)度(專利文獻(xiàn)1)F64I、F64V、F64A、F64G、F64L 發(fā)光波長沒有變化，但熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的熒光蛋白質(zhì) (專利文獻(xiàn)2)F64L-S65T-Y66H-Y145F 發(fā)出藍(lán)色的，熒光強(qiáng)度低，發(fā)光急速消失的熒光蛋白質(zhì) (專利文獻(xiàn)3)F64L-Y66H-Y145F-L2 36R、F64L-Y66H-Y145F-V163A_S 1 75G-L236R、 Y66H-Y145F-V163A-S175G, F64L-Y66H-Y145F 具有光穩(wěn)定性的熒光蛋白質(zhì)(專利文獻(xiàn)4)F64L-Y66H-S175G 呈現(xiàn)穩(wěn)定的熒光特性，具有不同的激發(fā)光譜和/或發(fā)光光譜的 藍(lán)色熒光蛋白質(zhì)(專利文獻(xiàn)5)F64L-Y66H-V163A 具有增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度的藍(lán)色熒光蛋白質(zhì)(專利文獻(xiàn)6)。非專利文獻(xiàn)1 :Heim 等人、1994 年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第 91 卷、第 12501-12504 頁
專利文獻(xiàn)1 國際公開第96/27675號(hào)專利文獻(xiàn)2 美國專利第6172188號(hào)專利文獻(xiàn)3 美國專利第5777079號(hào)專利文獻(xiàn)4 美國專利第6194548號(hào)專利文獻(xiàn)5 特表 2005-511027專利文獻(xiàn)6 特表 2000-50998
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種具有迄今沒有報(bào)道過的新的最大發(fā)光波長峰 的新熒光蛋白質(zhì)。而且，由于含有野生型的GFP，以往的突變熒光蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度極大地 依賴于PH的變化，在酸性下幾乎喪失熒光，因此本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種迄今為 止沒有報(bào)道過的具有新的發(fā)光光譜且熒光強(qiáng)度不受PH的變化左右，具有pH非依賴性的熒 光強(qiáng)度的新的熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明人以制成具有迄今為止沒有報(bào)道過的新的發(fā)光波長峰，尤其是熒光強(qiáng)度在 大范圍PH下穩(wěn)定保持的GFP的人工突變體作為目的進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)GFP的特定氨基酸被取 代的突變體發(fā)揮這種特性，完成了下述各發(fā)明。(1)由序列號(hào)1中所示的氨基酸序列中，66位的氨基酸殘基和175位的氨基酸殘 基分別被取代，而且72位的氨基酸殘基或206位的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基被取 代的氨基酸序列構(gòu)成的，發(fā)光波長峰為424nm的熒光蛋白質(zhì)。(2) (1)所述的熒光蛋白質(zhì)，72位的氨基酸殘基和206位的氨基酸殘基全都被取 代。(3) (2)所述的熒光蛋白質(zhì)，66位的氨基酸殘基被取代為苯基丙氨酸、72位的氨基 酸殘基被取代為丙氨酸、175位的氨基酸殘基被取代為甘氨酸、和206位的氨基酸殘基被取 代為賴氨酸。(4) (1) (3)任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)，其65位的氨基酸殘基、145位的氨基酸 殘基或148位的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基也被取代。(5) (4)所述的熒光蛋白質(zhì)，其65位的氨基酸殘基、145位的氨基酸殘基和148位 的氨基酸殘基均被取代。(6) (5)所述的熒光蛋白質(zhì)，其65位的氨基酸殘基被取代為谷氨酰胺、145位的氨 基酸殘基被取代為甘氨酸、和148位的氨基酸殘基被取代為絲氨酸。(7) (4) (6)任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)，其46位的氨基酸殘基也被取代。(8) (7)所述的熒光蛋白質(zhì)，其46位的氨基酸殘基被取代為亮氨酸。(9) (1) (8)任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)，其203位的氨基酸殘基也被取代。(10) (9)所述的熒光蛋白質(zhì)，其203位的氨基酸殘基被取代為纈氨酸。(11) (10)所述的熒光蛋白質(zhì)，其66位的氨基酸殘基被取代為苯基丙氨酸、175位的氨基酸殘基被取代為甘氨酸、72位的氨基酸殘基被取代為丙氨酸、206位的氨基酸殘基 被取代為賴氨酸、65位的氨基酸殘基被取代為谷氨酰胺、145位的氨基酸殘基被取代為甘 氨酸、148位的氨基酸殘基被取代為絲氨酸、46位的氨基酸殘基被取代為亮氨酸、和203位 的氨基酸殘基被取代為纈氨酸。
(12) (1) (11)所述的熒光蛋白質(zhì)中，再缺失、取代或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成的，發(fā)光波長峰為424nm的熒光蛋白質(zhì)。(13) (1) (12)任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)和任意蛋白質(zhì)或多肽構(gòu)成的融合蛋白質(zhì)。(14)編碼(1) (13)任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)的核酸。(15)表達(dá)(14)所述的核酸編碼的熒光蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)的載體。(16)由(15)所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)，首先，發(fā)出迄今為止沒有的424nm這樣的發(fā)光波長峰的熒光，其作為深藍(lán)色可通過肉眼將其與其它熒光蛋白質(zhì)識(shí)別開。具有PH的變化不會(huì)影響熒光 強(qiáng)度的PH非依賴性的熒光強(qiáng)度的本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)使得在以往困難的酸性環(huán)境下，利 用熒光蛋白質(zhì)成為可能。


圖1表示GFP、GFP的已知的氨基酸取代突變體和本發(fā)明的UMFP-I的熒光的顯色。圖2表示本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)和已知的熒光蛋白質(zhì)的吸收光譜和發(fā)光光譜。圖左 為吸收光譜，圖右為發(fā)光光譜。圖3表示涉及本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)和已知的熒光蛋白質(zhì)突變體(GFP和BFP)的發(fā) 光強(qiáng)度的PH滴定曲線。圖4表示用355nm的激發(fā)光激發(fā)UMFP-3 (紅色)、EBFP (藍(lán)色)時(shí)的熒光褪色曲線。圖5 表示用 355nm 的激發(fā)光激發(fā) C Δ 11UMFP-LE-N Δ 4ECFP (藍(lán)色)、UMFP_3 (紅色)、 ECFP(藍(lán)綠色)時(shí)的熒光光譜。圖6UC-SCAT3產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)中caspase3活性化的監(jiān)控?？v軸越大，表示caspase3 被活性化。橫軸表示TNF α處理后的時(shí)間。圖7表示表達(dá)Sirius (淺藍(lán)色)或EGFP (綠色)的大腸桿菌通過吞噬作用被吸收 到細(xì)胞性粘菌(微分干涉像)中，逐步被消化的圖像。圖板上的數(shù)字表示從大腸桿菌被吸 收到細(xì)胞性粘菌開始的時(shí)間(秒)。圖8由SC-SCAT3和SapRC2產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)的caspase3活性化和Ca2+動(dòng)態(tài)的同時(shí) 圖像化。顏色越暖，表示caSpaSe3的活性越高，Ca2+的濃度越高。而且，圖板上部的數(shù)字 表示從TNF α添加起的時(shí)間。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一般被稱為GFP的熒光蛋白質(zhì)的突變體。本發(fā)明的突變體是來源于多 管水母屬(Aequorea屬)生物、例如維多利亞多管發(fā)光水母(Aequoreavictoria)的GFP的 特定的氨基酸殘基被取代，發(fā)光波長峰為424nm的熒光蛋白質(zhì)、而且其是由該熒光蛋白質(zhì) 中還缺失、取代或添加了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成，且發(fā)光波長峰為424nm的熒 光蛋白質(zhì)。該發(fā)光波長作為深藍(lán)色(Ultra Marine)，用肉眼識(shí)別，通過肉眼可以明確地與以 往已知的藍(lán)色熒光蛋白質(zhì)的發(fā)光色區(qū)分開來(圖1)。以下，將發(fā)出深藍(lán)色熒光的本發(fā)明的 蛋白質(zhì)表不為 UMFP (Ultra Marine Fluorescence Protein)。
本發(fā)明的UMFP是序列號(hào)1中所示的氨基酸序列中特定位置的氨基酸被取代的熒 光蛋白質(zhì)。該序列號(hào)1中所示的氨基酸序列，維多利亞多管發(fā)光水母來源的野生型GFP的 氨基酸序列中，64位的F被取代為L，65位的S被取代為T，66位的Y被取代為W，146位的 N被取代為I，153位的M被取代為Τ，163位的V被取代為Α，231位的H被取代為L的氨基 酸序列。因此，本發(fā)明為，在野生型GFP的氨基酸序列中前述7個(gè)位置具有取代突變的氨基 酸序列構(gòu)成的熒光蛋白質(zhì)，再取代特定部位的氨基酸而構(gòu)成的具有多重取代突變的熒光蛋 白質(zhì)。而且，序列號(hào)1中所示的氨基酸序列是以前從Clontech公司以pECFP Vector的名 稱(目錄號(hào)632309)購買的。
本發(fā)明的UMFP是含有序列號(hào)1中所示的氨基酸序列中66位(W)和175位⑶的 氨基酸殘基的取代，以及72位(S)或206位(A)的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基的取 代的蛋白質(zhì)。以下，將該UMFP表示為UMFP-I。UMFP-I優(yōu)選是包含序列號(hào)1中所示的氨基 酸序列中66位、175位、72位和206位的4個(gè)氨基酸殘基的取代的蛋白質(zhì)。而且，UMFP-I優(yōu) 選是66位的氨基酸殘基被取代為F、72位的氨基酸殘基被取代為A，175位的氨基酸殘基被 取代為G和206位的氨基酸殘基被取代為K的熒光蛋白質(zhì)。以下，在用取代位置和取代后 的氨基酸的種類表示本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)時(shí)，由于以序列號(hào)1中所示的氨基酸序列為基礎(chǔ) 表示，因此通過用連字符連接，在取代位置和取代后的氨基酸的前面添加ECFP來表示。例 如，上述 UMFP-I 的優(yōu)選例子表示為 ECFP-W66F-S72A-S175G-A206K。而且，本發(fā)明包括上述UMFP-I中，65位⑴、145位⑴或148位(H)中的任意氨 基酸殘基的任意，優(yōu)選這3個(gè)氨基酸殘基全部都同時(shí)被取代的熒光蛋白質(zhì)。以下，將含有進(jìn) 一步取代的UMFP表示為UMFP-2。UMFP-2優(yōu)選是在65位、145位和148位這3個(gè)氨基酸殘 基在被取代的熒光蛋白質(zhì)。尤其是，優(yōu)選UMFP-2是65位的氨基酸殘基被取代為Q，145位 的氨基酸殘基被取代為G，和148位的氨基酸殘基被取代為S的熒光蛋白質(zhì)。前述3個(gè)氨 基酸殘基分別被取代為合適的氨基酸殘基的本發(fā)明的UMFP-2的特別優(yōu)選的例子表示為EC FP-W66F-S72A-S175G-A206K-T65Q-Y145G-H148S。UMFP-2 除了發(fā)光波長峰為 424nm之外，還 具有比UMFP-I高的熒光強(qiáng)度。該熒光強(qiáng)度，由于還在46位(F)導(dǎo)入了優(yōu)選F46L這樣的取 代，因此可以進(jìn)一步提高熒光強(qiáng)度。含有該46位取代的UMFP、即ECFP-F46L-W66F-S72A-S1 75G-A206K-T65Q-Y145G-H148S 也是 UMFP-2 的一種。此外，本發(fā)明還包括，前述UMFP-I或UMFP-2中203位(T)也被取代的熒光蛋白質(zhì)。 以下將含有該進(jìn)一步的203位的取代的UMFP稱為UMFP-3。UMFP-3中優(yōu)選的取代是T203V。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的熒光波長，可以適當(dāng)通過光學(xué)手段、例如分光光度計(jì)、熒光計(jì) CCD撮像素子等來測(cè)定。光譜特性可以作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的發(fā)光的激發(fā)波長特性和 發(fā)光波長特性被測(cè)定，根據(jù)這些光譜特性，可以確認(rèn)形成激發(fā)波長和發(fā)光波長各個(gè)峰的波 長。如果沒有特別說明，例如本發(fā)明中“424nm”這樣的記載可以采用包括優(yōu)選424士3nm(更 優(yōu)選424 士 2nm)這樣的含義。通過上述的氨基酸取代，本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)與公知的熒光蛋白質(zhì)明確不同，在 約424nm以下具有發(fā)光波長的峰。例如、公知的熒光蛋白質(zhì)，發(fā)光波長峰有約450nm(例如、 BFP)、約 470nm(例如、CFP)、約 5IOnm (例如、eGFP)、約 530nm (例如、YFP)、約 600nm (例如、 DsRed)等的峰。與這些公知的波長峰明確不同的發(fā)光波長峰提高具有不同色彩的發(fā)光(例 如、本發(fā)明的深藍(lán)色)，由此可通過肉眼識(shí)別(圖1)。
本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)還具有與公知熒光蛋白質(zhì)明確不同的，在約355nm處的激發(fā) 波長峰。例如、公知的熒光蛋白質(zhì)的激發(fā)波長峰有約380nm(例如、BFP)、約430nm(例如、 CFP)、約 480nm(例如、eGFP)、約 510nm(例如、YFP)、約 550nm(例如、DsRed)等的峰。因此， 可以照射公知熒光蛋白質(zhì)幾乎不會(huì)反應(yīng)的波長的激發(fā)光。此外，本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)，例如UMFP-3，其具有發(fā)光波長的峰為424nm，此外其 熒光強(qiáng)度即使在酸性條件下也維持在高水平這種特點(diǎn)。wtGFP其它現(xiàn)有的GFP在酸性條件 下，例如pH5以下的熒光強(qiáng)度，顯著低于中性至弱堿性條件下、例如pH7 pH9下顯示的熒 光強(qiáng)度(通常降低70% 100% )，與之相對(duì)，例如本申請(qǐng)的UMFP-3的酸性條件下的熒光強(qiáng) 度維持在中性至弱堿性條件下的熒光強(qiáng)度的至少50%以上、優(yōu)選75%以上、更優(yōu)選90%以 上。而且，本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)在酸性條件下(優(yōu)選PH5以下、更優(yōu)選pH3 pH5)的熒光 強(qiáng)度也可以比堿性條件下(優(yōu)選PH7以上、更優(yōu)選pH7 pH9)的熒光強(qiáng)度強(qiáng)。即，本發(fā)明 的熒光蛋白質(zhì)中，相對(duì)于PH9下的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化的相對(duì)熒光強(qiáng)度，例如在pH3 9的范圍 內(nèi)，可以在優(yōu)選50%以內(nèi)、優(yōu)選25%以內(nèi)、更優(yōu)選10%以內(nèi)變化。上述這種相對(duì)于pH變化 在優(yōu)選50 %以內(nèi)、優(yōu)選25 %以內(nèi)、更優(yōu)選10 %以內(nèi)變化的熒光強(qiáng)度，本說明書中表示為pH 非依賴性熒光強(qiáng)度。本說明書中所謂“提高的熒光強(qiáng)度”是指，與以往的熒光蛋白質(zhì)相比，相對(duì)于具有 一定波長的一定光量的激發(fā)光，本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)的每摩爾的發(fā)光量高。作為由于在熒 光蛋白質(zhì)的氨基酸序列中導(dǎo)入突變而熒光強(qiáng)度上升的例子，可以列舉本發(fā)明的UMFP-1和 UMFP-3的比較，這個(gè)例子的情況顯示，給各個(gè)熒光蛋白質(zhì)照射355nm的激發(fā)光時(shí)，UMFP-3比 原來的UMFP-1上升至少20 %、優(yōu)選至少30 %、更優(yōu)選至少40 %。而且，本發(fā)明的熒光蛋白 質(zhì)，由于與公知的熒光蛋白質(zhì)相比，激發(fā)光位于低波長側(cè)，因此可以提供對(duì)于低波長激發(fā)光 的較高的熒光強(qiáng)度。例如，在UMFP-2 的一種 ECFP-F46L-W66F-S72A-S175G-A206K-T65Q-Y145G-H148S 中再導(dǎo)入 T203V 的取代的 UMFP-3、即 ECFP-F46L-W66F-S72A-S175G-A206K-T65Q-Y145V-H14 8S-T203V有以下這樣的特征，即具有424nm的發(fā)光波長峰，具有比UMFP-1高至少20%、優(yōu) 選至少30%、更優(yōu)選至少40%的熒光強(qiáng)度，且即使在酸性條件下，其熒光強(qiáng)度沒有大的變 化例如熒光強(qiáng)度的變化在50%以內(nèi)、優(yōu)選25%以內(nèi)、更優(yōu)選10%以內(nèi))。本發(fā)明還包括這樣的熒光蛋白質(zhì)，其顯示出UMFP的前述特征，例如、具有約424nm 的發(fā)光波長峰，優(yōu)選具有增高到約424nm的發(fā)光波長峰的熒光強(qiáng)度，更優(yōu)選具有424nm的發(fā) 光波長峰、和提高的熒光強(qiáng)度和PH非依賴性熒光強(qiáng)度的特征，且由在賦予本發(fā)明的UMFP特 征的突變部位、即46位、66位、72位、175位、206位、65位、145位、148位和203位以外的部 位，缺失、取代或添加了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成。本發(fā)明中氨基酸的取代、缺 失、和/或添加涉及的所謂“ 1或多個(gè)”，是指1 數(shù)十個(gè)氨基酸以內(nèi)、優(yōu)選1 70個(gè)、更優(yōu)選 1 50個(gè)、更優(yōu)選1 30個(gè)、尤為優(yōu)選1 15個(gè)、1 14個(gè)、1 13個(gè)、1 12個(gè)、1 11 個(gè)、1 10個(gè)、1 9個(gè)、1 8個(gè)、1 7個(gè)、1 6個(gè)、1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、1 2 個(gè)或1個(gè)的氨基酸殘基的變化。如果用氨基酸序列的同一性(％)來表示，可以表示為與序 列號(hào)1表示的氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選85%以上、更優(yōu)選90%以上、尤為優(yōu)選95% 以上的同一性的氨基酸序列。蛋白質(zhì)的氨基酸序列，就氨基酸殘基的 荷、大小、疏水性等物理化學(xué)的性質(zhì)而言，可以經(jīng)驗(yàn)性地確認(rèn)可以允許保守性高的突變。例如、氨基酸殘基的取代，可以列舉甘氨 酸(Gly)和脯氨酸(Pro)、Gly和丙氨酸(Ala)或纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和異亮氨酸 (lie)、谷氨酰胺酸(Glu)和谷氨酰胺(Gin)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸 (Cys)和蘇氨酸(Thr)、Thr和絲氨酸(Ser)或Ala、賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等。而 且，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可得出，即使在超出上述保守性的情況下，還能夠存在不喪失 該蛋白質(zhì)的本質(zhì)功能的突變。因此，即使是由在UMFP中作為取代部位的特定的46位、66 位、72位、175位、206位、65位、145位、148位和203位以外的部位，序列號(hào)1中記載的氨基 酸序列中取代、缺失、和/或添加了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)，也存在 具有作為UMFP的前述特征的情況，這些可被理解為是本發(fā)明的一個(gè)方式。例如，還包括由 在前述46位、66位、72位、175位、206位、65位、145位、148位和203位以外部位的氨基酸 以外，其余所有部位的氨基酸與wtGFP的氨基酸序列同一的氨基酸構(gòu)成的熒光蛋白質(zhì)。此 外，本發(fā)明還包括這樣的熒光蛋白質(zhì)，即在前述46位、66位、72位、175位、206位、65位、145 位、148位和203位以外的部位的氨基酸的取代不損傷本發(fā)明的UMFP的特征的上述功能，而 且還帶來酶的穩(wěn)定性提高或熒光強(qiáng)度的增加等有益的特性變化。而且，本發(fā)明的蛋白質(zhì)在經(jīng)時(shí)褪色上具有優(yōu)點(diǎn)。即，與公知的熒光蛋白質(zhì)相比，本 發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)的褪色被延緩。例如，如本說明書中的實(shí)施例6和圖4中所示，測(cè)定相對(duì) 于緊隨10秒的脈沖照射后的發(fā)光強(qiáng)度的1000秒后的發(fā)光強(qiáng)度，本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)維持 原有的約80%，而公知的EBFP只能維持約10%。此外，本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)的特征還在于 能夠提供在至少照射后1000秒的范圍內(nèi)的線形型的褪色。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以單獨(dú)制造，使用，也可以作為在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N末端和/ 或C末端上添加本發(fā)明的蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)或多肽的所謂融合蛋白質(zhì)來制造和使用。這 種包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的一種方式。尤其是，本發(fā)明的UMFP，在與 以往的GFP或其突變體相同使用目的中，可以與它們交換使用。例如，通過使某種蛋白質(zhì)與 本發(fā)明的UMFP的融合蛋白質(zhì)在生物體或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可以調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)在生物體或細(xì)胞 內(nèi)的局部存在性。而且，還以本發(fā)明的UMFP的表達(dá)作為目標(biāo)，調(diào)節(jié)生物體或細(xì)胞內(nèi)的基因 表達(dá)控制機(jī)制。尤其是，由于本發(fā)明的UMFP-3具有pH非依賴性熒光強(qiáng)度，因此可以用于確 認(rèn)內(nèi)涵體或溶酶體等以往已知無法利用或極難利用GFP或其突變體的酸性細(xì)胞器官中蛋 白質(zhì)的局部存在性，觀察細(xì)胞內(nèi)膜舉動(dòng)，以及其它目的。由于本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)的發(fā)光波長峰和激發(fā)波長峰都與公知的熒光蛋白質(zhì)具 有的各個(gè)峰不同，因此可以在同時(shí)使用多個(gè)熒光蛋白質(zhì)的用途中利用。例如，由于本發(fā)明的 熒光蛋白質(zhì)的發(fā)光波長峰與公知的熒光蛋白質(zhì)不同，因此通過肉眼可以識(shí)別本發(fā)明的熒光 蛋白質(zhì)(或其融合蛋白質(zhì))產(chǎn)生的發(fā)光和公知的熒光蛋白質(zhì)(或其融合蛋白質(zhì))產(chǎn)生的發(fā) 光(圖1)。而且，由于本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)的激發(fā)波長峰與公知的熒光蛋白質(zhì)不同，因此利 用公知的熒光蛋白質(zhì)無法激發(fā)的波長的測(cè)定系統(tǒng)也是可能的。而且，根據(jù)上述這些優(yōu)點(diǎn)，如 果同時(shí)利用本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)和公知的熒光蛋白質(zhì)，可以進(jìn)行比以往復(fù)雜，并且/或示 差性上更為優(yōu)異的同時(shí)的多重分析。此外，由于本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)與上述的公知的熒光蛋白質(zhì)的激發(fā)波長峰和發(fā)光 波長峰都不同，因此通過將本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其融合蛋白質(zhì)與公知的熒光蛋白質(zhì)或其融合 蛋白質(zhì)適當(dāng)組合，可以構(gòu)建利用在與以往不同的波長中熒光共振能量移動(dòng)(FluorescentResonance Energy Transfer :FRET)的系統(tǒng)。FRET和其利用例是本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的，例如記載于 Takemoto, K. ， Nagai, T. ，Miyawaki, A. &Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed byindicator that is insensitive to environmental effects. J. Cell. Biol. 160,235-243(2003) ；Mizuno, H. ， Sawano, A. ， Eli, P. ， Hama, H. Miyawaki, A. Redfluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescenceresonance resonance energy transfer. Biochemistry. 40, 2502-2510(2001).等。此外，含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，在添加了該功能性蛋白質(zhì)顯示的功能 這方面，與單獨(dú)制造或使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)相比，具有更高的有用性。作為這種功能性蛋 白質(zhì)的例子，可以列舉谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)、蛋白質(zhì)A、其它廣 泛用于融合蛋白質(zhì)制造的蛋白質(zhì)。而且，如果利用FLAG標(biāo)記、組氨酸標(biāo)記或幾丁質(zhì)結(jié)合序 列這種容易進(jìn)行重組蛋白質(zhì)制造、尤其是重組蛋白質(zhì)純化的功能性多肽，可以更有利地進(jìn) 行本發(fā)明的蛋白質(zhì)的制造。此外，可以在本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)上，根據(jù)需要 添加熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)等適當(dāng)?shù)臉?biāo)識(shí)化合物，或結(jié)合各種化學(xué)修飾物質(zhì)或聚乙二醇等 高分子，或使本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)與不溶性載體結(jié)合。以這樣形成的蛋白質(zhì)作為對(duì)象的 化學(xué)的修飾法是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的，只要不損傷本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能，可以進(jìn)行任 意修飾、利用。尤其是，在融合蛋白質(zhì)制造中的提取操作或純化操作等、或標(biāo)識(shí)化蛋白質(zhì)的制造 中的標(biāo)識(shí)化合物的添加反應(yīng)等中，蛋白質(zhì)可暴露在各種反應(yīng)條件下。由于本發(fā)明的熒光蛋 白質(zhì)能夠以PH非依賴性維持活性，因此其在各種反應(yīng)條件下的耐受性高于公知的熒光蛋 白質(zhì)，我們認(rèn)為由于這種特性，促進(jìn)了本發(fā)明的蛋白質(zhì)的利用。本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或包含本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的核酸。核酸 包括RNA或DNA，其形態(tài)，除了 mRNA、cDNA之外，還包括化學(xué)合成DNA等，但沒有特別限制。 本發(fā)明的優(yōu)選核酸是DNA。而且，本發(fā)明的核酸可以是單鏈，也可以和具有與其互補(bǔ)的序列 的核酸或RNA結(jié)合形成雙鏈、三鏈。此外，該核酸還可以用辣根過氧化物酶(HRP0)等酶或 放射性同位素、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等來標(biāo)識(shí)。本發(fā)明的核酸、優(yōu)選編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)UMFP的DNA，由在序列號(hào)2中所示的 編碼GFP的堿基序列中，給予前述UMFP1 3特征的取代部位、即46位、66位、72位、175 位、206位、65位、145位、148位和203位以外的密碼子被取代為對(duì)應(yīng)于各個(gè)氨基酸取代 的密碼子的堿基序列構(gòu)成。而且，和由與涉及的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸在 嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼本發(fā)明的UMFP的核酸也包括在本發(fā)明的核酸中。本發(fā)明中的所 謂嚴(yán)謹(jǐn)條件，是指在包括鹽濃度1. 5M的65°C的緩沖液中，與由和序列號(hào)2互補(bǔ)的堿基序 列構(gòu)成的核酸雜交，在50°C的2XSSC溶液(含有0.1% [w/v]SDS)下清洗DNA的條件 (1XSSC為0. 15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉)下維持雜交的條件。而且，如果用堿基序列的 同一性(％ )表示，可以是由與序列號(hào)2的堿基序列具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu) 選90%以上、更優(yōu)選95%以上同一性的堿基序列構(gòu)成的核酸。這些方法，可以利用例如 記載于 Molecular Cloning 3rdEd.、Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons 1987-1997 等中的方法。
本發(fā)明的核酸可以基于由編碼序列號(hào)1中所示的氨基酸序列的DNA、具體的是序 列號(hào)2中所示的堿基序列構(gòu)成的DNA，通過PCR、位點(diǎn)特異的突變法等其它一般的基因工程 方法來制備。含有序列號(hào)2中所示的堿基序列構(gòu)成的DNA的載體有各種市售產(chǎn)品，也可 以直接利用這種DNA。而且部位特異的突變等基因工程方法記載于例如Maniatis T.等 (MolecularCloning， aLaboratory Manual， Cold Spring harbor Laboratory, New York， 1982年)以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛利用的實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)中。而且，本發(fā)明的核酸還可 以基于序列號(hào)2中所示的堿基序列信息，通過亞磷酰胺(Phosphoramidite)法等化學(xué)合成 的手法，或使用市售的DNA測(cè)序儀等直接制造。作為編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的核酸的DNA，可以 整合到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，這種表達(dá)載體用于重組生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì) 的融合蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)生產(chǎn)用的重組載體也包括于本發(fā)明中。本發(fā)明的載體可以是環(huán) 狀、支鏈狀等任意形態(tài)，而且除了編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì) 的核酸，如有必要，還可以具有其它堿基序列。所謂其它堿基序列，是增強(qiáng)子序列、啟動(dòng)子序 列、核糖體結(jié)合序列、以拷貝數(shù)擴(kuò)增作為目的而使用的堿基序列、編碼信號(hào)肽的堿基序列、 編碼其它多肽的堿基序列、polyA添加序列、剪切序列、復(fù)制起始點(diǎn)、形成選擇標(biāo)記的基因的 堿基序列等。在基因重組時(shí)，可以使用適當(dāng)?shù)暮铣蒁NA銜接子(adapter)將翻譯起始密碼子或 翻譯終止密碼子添加在編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的核酸上， 或在堿基序列內(nèi)使適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖袛嘈蛄行庐a(chǎn)生或消失。這些都是在本領(lǐng)域技術(shù)人員通 常進(jìn)行作業(yè)的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì) 的融合蛋白質(zhì)的核酸，任意且容易地加工。而且?guī)в芯幋a本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的核酸的載體， 可以根據(jù)使用的宿主選擇適當(dāng)?shù)妮d體，并使用，除了質(zhì)粒，還可以使用噬菌體、桿狀病毒、逆 轉(zhuǎn)錄病毒、痘病毒等各種病毒。作為可以利用的市售的表達(dá)載體，可以列舉pcDM8 (FUNAK0SHI公司制)、 pcDNAI (FUNAK0SHI 公司制)、pcDNAI/AmP(Invitrogen 公司制)、EGFP-C1 (Clontech 公司 制)、pREP4 (Invitrogen公司制)、pGBT-9 (Clontech公司制)等。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含 有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的表達(dá)可以使編碼該蛋白質(zhì)的基因在固有的啟動(dòng)子序列的 控制下表達(dá)?；蛘?，在編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的堿基序列 的上游連結(jié)其它適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)啟動(dòng)子后再使用。這種表達(dá)啟動(dòng)子可以根據(jù)宿主和表達(dá)目的 適當(dāng)選擇，例如，在宿主為大腸桿菌時(shí)，可以列舉T7啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、入PL 啟動(dòng)子等，在宿主為酵母時(shí)，可以列舉PH05啟動(dòng)子、GAP啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子等，在宿主為 動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，可以列舉SV40來源啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、細(xì)胞巨化病毒(人CMV)的 IE (immediate early)基因的啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子、SRa啟動(dòng)子等。 將編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的核酸、優(yōu)選DNA與上述例示的 啟動(dòng)子連結(jié)、或整合到表達(dá)載體等的操作也可以基于前述Maniatis等人和其它實(shí)驗(yàn)操作 手冊(cè)的記載進(jìn)行。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)還可以使用例如Fmoc法(芴 甲氧羰基法)或tBoc法(t-叔丁氧羰基法)等有機(jī)化學(xué)的合成方法、或使用市售的適當(dāng)?shù)碾暮铣蓹C(jī)來制造，但優(yōu)選通過基因重組技術(shù)，將前述核酸、尤其是整合到表達(dá)載體的DNA導(dǎo) 入于使用從原核生物或真核生物中選擇的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞的合適的表達(dá)系統(tǒng)來制造。作為宿主細(xì)胞的例子，可以列舉埃希氏菌(Escherichia)屬細(xì)菌、棒桿菌 (Corynebacterium)屬細(xì)菌、短桿菌(Brevibacterium)屬細(xì)菌、芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì) 菌、沙雷氏菌(Serratia)屬細(xì)菌、假單胞菌(Pseudomonas)屬細(xì)菌、節(jié)桿菌(Arthrobacter) 屬細(xì)菌、歐文氏菌(Erwinia)屬細(xì)菌、甲基桿菌(Methylobacterium)屬細(xì)菌、紅細(xì)菌 (Rhodobacter)屬細(xì)菌、鏈霉菌(Str印tomyces)屬微生物、發(fā)酵單胞菌(Zymomonas)屬微生 物、酵母菌(Saccharomyces)屬酵母等微生物、蠶等昆蟲細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、MEF細(xì)胞、Vero 細(xì)胞、Hela細(xì)胞、CH0細(xì)胞、WI38細(xì)胞、BHK細(xì)胞、C0S-7細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、C127細(xì)胞、HKG細(xì) 胞、人腎細(xì)胞株等動(dòng)物細(xì)胞。作為在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入表達(dá)載體的方法，可以通過最初由前述Maniatis等人進(jìn) 行的記載于實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)中的方法、例如、電穿孔法、原生質(zhì)體法、堿金屬法、磷酸鈣沉淀 法、DEAE右旋糖苷法、顯微注射法、粒子槍法等進(jìn)行。對(duì)于Sf9或Sf21等昆蟲細(xì)胞的利用， 記載于桿狀病毒(桿狀病毒)表達(dá)載體(桿狀病毒expression vectors)、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、 ff. H. Freeman and Company、NewYork、1992 年)或 Bio/Technology、1988 年、第 6 卷、第 47 頁等中。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)可以通過使前述表達(dá)載體在 上述宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收并純化目的蛋白質(zhì)來獲得。作為純化蛋 白質(zhì)的方法，可以從蛋白質(zhì)純化中通常使用的方法中適當(dāng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▉磉M(jìn)行。即，從鹽 析法、超濾法、等電點(diǎn)沉淀法、凝膠過濾法、電泳法、離子交換層析、疏水性層析或抗體層析 等各種親合層析、色譜聚焦法、吸附層析和逆相層析等通?？墒褂玫姆椒ㄖ羞m當(dāng)選擇合適 的方法，可以根據(jù)需要使用HPLC系統(tǒng)等，按適當(dāng)?shù)捻樞蜻M(jìn)行純化。而且，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)與組氨酸標(biāo)記和FLAG標(biāo)記等作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，優(yōu) 選采用針對(duì)該標(biāo)記等的特征性的純化法。可以用適當(dāng)?shù)牡鞍酌?凝血酶、胰蛋白酶等)切 斷融合蛋白質(zhì)，回收本發(fā)明的蛋白質(zhì)。此外，利用重組DNA分子，通過無細(xì)胞系的合成方法 獲得的方法也是基因工程法生產(chǎn)的方法的1種。這種本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以以單獨(dú)形態(tài)，也可以以與其它種類的蛋白質(zhì)的融合蛋白 質(zhì)的形態(tài)來制備，但不僅限于此，還可以使本發(fā)明的蛋白質(zhì)再變換為各種形態(tài)。例如，可以 考慮對(duì)蛋白質(zhì)的各種化學(xué)修飾、與聚乙二醇等高分子的結(jié)合、與不溶性載體的結(jié)合、封入脂 質(zhì)體等通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種手法進(jìn)行的加工。此外，作為與本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體，可以列舉單克隆抗體、多克隆抗 體、嵌合抗體、單鏈抗體、人化抗體等免疫特異的抗體，但特別優(yōu)選單克隆抗體。這種抗體可 以通過使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為抗原，通過常規(guī)的操作，免疫非人動(dòng)物，回收血清，或誘導(dǎo) 產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞來制造。此外，按照常規(guī)方法，例如，可以用FITC(異硫氰基 熒光素)或四甲基羅丹明異氰酸酯等熒光物質(zhì)、放射性同位素、堿性磷酸酶或過氧化物酶 等酶蛋白質(zhì)來標(biāo)識(shí)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以在以往已知的利用GFP或其突變體作為標(biāo)記的各種分子生 物學(xué)方法中，作為代替該GFP或其突變體的標(biāo)記蛋白質(zhì)來使用。例如、本領(lǐng)域技術(shù)人員利用 如Invitrogen公司制的pRSET/EmGFP載體等這樣的能夠簡(jiǎn)單地使與GFP的融合蛋白質(zhì)表達(dá)的載體，或制備將市售的各種載體中編碼GFP的0RF替換為編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的0RF 的載體，可以簡(jiǎn)便地制造或利用任意蛋白質(zhì)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。通過使用這 種載體，還可以測(cè)定或確認(rèn)該任意蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、細(xì)胞和/或細(xì)胞外 局部存在性，測(cè)定方法。測(cè)定或確認(rèn)可以通過檢測(cè)或測(cè)定本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋 白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的熒光發(fā)光來進(jìn)行。此外，將編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的核酸連接在任 意功能性核酸的控制下，通過檢測(cè)或測(cè)定本發(fā)明的蛋白質(zhì)或含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的融合蛋白 質(zhì)的熒光發(fā)光，還可以研究該功能性核酸的控制機(jī)制，探索促進(jìn)或抑制該功能性核酸的功 能的物質(zhì)。實(shí)施例< 實(shí)施例 DUMFP-1 (ECFP-W66F-S72A-S175G-A206K)的制備用限制性酶BamHI和EcoRI切出Invitrogen公司制的pcDNA3中帶有的編碼 ECFP (由序列號(hào)1中所示的氨基酸序列構(gòu)成的突變熒光蛋白質(zhì))的DNA(ECFP基因)，將其重 組于用相同限制性酶開環(huán)的質(zhì)粒載體pRSETB (Invitrogen公司)中，制成pRSETB/ECFP。以 該質(zhì)粒載體作為模板，使用下述的引物DNA，按照Asano等人的方法(Nuc. Acid Res.，2000 年、第28卷、第16號(hào)、e78)，導(dǎo)入S72A、S175G和A206K這3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變。引物 1 CAGTGCTTCAGCCGCTACCCC (序列號(hào)3)引物 2 GAGGACGGCAGCGTGCAGCTC (序列號(hào)4)引物 3 ACCCAGTCCGCCCTGAGCAAA (序列號(hào)5)即，制備含有 500ng 的 pRSETB/ECFP、各 lOpmol 的引物 1 3、3. 75nmol 的 dNTPs、 1. 25U的Pfu DNA聚合酶、20U的Pfu DNA連接酶(STRATAGENE公司)的20 ii L反應(yīng)液，以 進(jìn)行65°C、5分鐘的預(yù)溫育，通過Pfu DNA連接酶修復(fù)模板DNA的缺口，然后，95°C、1分鐘 的DNA變性后，95 °C、10秒鐘的DNA變性、55 °C、30秒鐘的退火反應(yīng)和65 °C、10分鐘的伸 長 連結(jié)反應(yīng)作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)反應(yīng)。在20 y L熱循環(huán)反應(yīng)后的反 應(yīng)溶液中加入0. 4ii L(8U)的DpnI(New England BioLabs公司)，于37°C溫育1小時(shí)，再 進(jìn)行酚氯仿提取純化DNA后，通過氯化鈣法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)，獲得了具有編碼 ECFP-S72A-S175G-A206K(序列號(hào)15)的 DNA(序列號(hào)14)的質(zhì)粒載體 pRSETB/mSECFP。以該載體作為模板，使用下述引物進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。引物 4 :ACCCTGACCTTCGGCGTGCAG (序列號(hào)6)熱循環(huán)的反應(yīng)條件是，除了使用的引物，其余與先前所示的熱循環(huán)反應(yīng)相同的條 件。通過該反應(yīng)，制備出編碼添加了組氨酸標(biāo)記的ECFP-W66F-S72A-S175G-A206K(UMFP-1) 的載體pRSETB/UMFP-1。UMFP-1的核苷酸序列和氨基酸序列分別記載于序列號(hào)16和17。將使用該載體，通過氯化鈣法被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109 (DE3)在2mL含有100 u g/ mL的氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，于23°C培養(yǎng)4天，將獲得的細(xì)胞用法式細(xì)胞破碎 器(French Press)破碎。從通過離心分離除去破碎后的殘?jiān)纳锨逡褐校胣ickel chelating柱(Qiagen公司制)，用含有100mM咪唑和300mM NaCl的50mMTris鹽酸緩沖液 pH7. 4洗脫添加了組氨酸標(biāo)記的ECFP-W66F-S72A-S175G-A206K，進(jìn)行回收，再通過PD-10脫 鹽 緩沖液交換用柱(GE Healthcare Bio-Sciences公司)，將緩沖液交換成50mMHEPES 緩沖液 PH7. 4，獲得 了 添加 了 組氨酸標(biāo)記的 ECFP-W66F-S72A-S175G-A206K(UMFP-1)(約7. 5mg/mL)?！磳?shí)施例2>UMFP-2(ECFP-F46L-W66F-S72A-S175G-A206K-T65Q-Y145G-H148S)的 制備以實(shí)施例1中制備的pRSETB/UMFP-1作為模板，使用下述引物DNA進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。引物 5 ACCACCCTGCAATTCGGCGTG (序列號(hào)7)引物 6 GAGTACAACGGGATCAGCCAC (序列號(hào)8)引物 7 GGGATCAGCTCAAACGTCTAT (序列號(hào)9)即，制備含有 500ng 的 pRSETB/UMFP-1、各 lOpmol 的引物 5 7,3. 75nmol 的 dNTPs、1. 25U 的 Pfu DNA 聚合酶、20U 的 Pfu DNA 連接酶(STRATAGENE 公司)的 20 ii L 反應(yīng) 液，以進(jìn)行65°C、5分鐘的預(yù)溫育，通過Pfu DNA連接酶修復(fù)模板DNA的缺口，然后，95°C、1 分鐘的DNA變性后，95°C、10秒鐘的DNA變性、55°C、30秒鐘的退火反應(yīng)和65°C、10分鐘的 伸長 連結(jié)反應(yīng)作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)反應(yīng)。在20 yL熱循環(huán)反應(yīng)后的反 應(yīng)溶液中加入0. 4ii L(8U)的DpnI(New England BioLabs公司)，于37°C溫育1小時(shí)，再進(jìn) 行酚氯仿提取純化DNA后，通過氯化鈣法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)，獲得了具有編碼ECF P-W66F-S72A-S175G-A206K-T65Q-Y145V-H148S(序列號(hào)19)的 DNA(序列號(hào)18)的質(zhì)粒載 體PRSETB/ECFP-W66F-S72A-S175G-A206K-T65Q-Y145G-H148S。以該載體作為模板，使用下述引物進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，獲得了 pRSETB/UMFP-2。引物 8 :ACCCTGAAGCTCATCTGCACC(序列號(hào)10)熱循環(huán)的反應(yīng)條件是，除了使用的引物，其余與先前所示的熱循環(huán)反應(yīng)相同的 條件。使用PRSETB/UMFP-2，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，獲得了添加了組氨酸標(biāo)記的 UMFP-2(約9. 3mg/mL)。UMFP-2的核苷酸序列和氨基酸序列分別記載于序列號(hào)20和21。< 實(shí)施例 3>UMFP-3(ECFP-F46L-W66F-S72A-S175G-A206K-T65Q-Y145G-H148S-T20 3V)的制備以實(shí)施例2制備的pRSETB/UMFP-2作為模板，使用下述引物DNA進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)， 獲得了 pRSETB/UMFP-3。引物 9 :TACCTGAGCGTCCAGTCCGCC(序列號(hào)11)熱循環(huán)的反應(yīng)條件是，除了使用的引物，其余與先前所示的熱循環(huán)反應(yīng)相同的 條件。使用PRSETB/UMFP-3，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作，獲得了添加了組氨酸標(biāo)記的 UMFP-3(約9. 3mg/mL)。UMFP-3的核苷酸序列和氨基酸序列分別記載于序列號(hào)22和23。<實(shí)施例4>UMFP的激發(fā)波長峰和發(fā)光波長峰的測(cè)定用50mM的HEPES緩沖液(pH7. 4)將實(shí)施例1 3中制備的UMFP-1 3/50mM HEPES緩沖液pH7. 4的水溶液稀釋100倍，用熒光分光光度計(jì)(HITACHI F-2500)測(cè)定 激發(fā)光譜和熒光光譜。并且，同時(shí)，在與UMFP同一條件下測(cè)定wtGFP、已知的GFP的人 工突變體BFP(Heim等人、前述非專利文獻(xiàn)1)、CFP(Heim等人、Curr. Biol. ,1996年、第 6 卷、第 178-182 頁)、YFP (Ormoe 等人、1994 年、Science、第 273 卷、第 1392-1395)和 DsRed(Terskikh等人、2000年、Science、第290卷、第1585-1588頁)的激發(fā)光譜和熒光光 譜。將各熒光蛋白質(zhì)的最大亮度標(biāo)準(zhǔn)化成1的熒光光譜示于圖2。UMFP1 3的激發(fā)波長 的峰都是在約355nm，發(fā)光波長的峰都在約424nm。
<實(shí)施例5>UMFP_3的pH非依賴性熒光強(qiáng)度使用50mM Glycine-HCl 緩沖液(pH3. 0 3. 4)、50mM NaOAc (pH3. 8 5. 4)、 50mM MES (pH5. 8 6.2)、50mM MOPS (pH6. 6 7. 0)、50mM HEPES (pH7. 4 7.8)、50mM Glycine (pH8. 6 9. 0)，制備pH3. 0 9. 0范圍的緩沖液，測(cè)定2 y M的UMFP-3/各緩沖液 20mM的熒光，計(jì)算各pH下的熒光強(qiáng)度。而且，對(duì)GFP和BFP進(jìn)行同樣的測(cè)定。其結(jié)果示于 圖3。GFP和BFP，它們?cè)谒嵝原h(huán)境下的熒光強(qiáng)度都減少到1/2以下。另一方面，UMFP-3 的熒光強(qiáng)度在廣泛的PH范圍(pH3. 0 9. 0)下穩(wěn)定。<實(shí)施例6>UMFP-3的光穩(wěn)定性通過使UMFP-3和用于比較的EBFP在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行光穩(wěn)定性的測(cè) 定。用 Surperfect (Invitrogen)，將 pcDNA3/UMFP-3、pcDNA3/raFP 分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于 35mm 的 玻底培養(yǎng)皿的HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染1天后，確認(rèn)各個(gè)重組蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中正常表達(dá)，進(jìn)行光穩(wěn) 定性的測(cè)定。顯微鏡采用NikonTE-2000E倒置顯微鏡，物鏡采用Flour、40倍、開口數(shù)1. 30 的油浸物鏡。UMFP-3、EBFP的熒光，在340-380nm的波長域激發(fā)，用435-485nm的波長域的 帶通濾波器檢測(cè)。圖4表示對(duì)在表達(dá)UMFP-3、EBFP各個(gè)熒光蛋白質(zhì)的HeLa細(xì)胞中遇到10 秒鐘激發(fā)光時(shí)，進(jìn)行反復(fù)攝影的操作獲得的熒光強(qiáng)度的褪色曲線。如圖4中所示，如果測(cè)定 相對(duì)于測(cè)定10秒的脈沖照射后不久的發(fā)光強(qiáng)度的1000秒后的發(fā)光強(qiáng)度，本發(fā)明的熒光蛋 白質(zhì)維持其的約80%，但公知的EBFP的情況是只能維持約10%。而且，該圖還顯示，本發(fā) 明的熒光蛋白質(zhì)還能夠提供在至少照射后1000秒的范圍內(nèi)線形型的褪色。<實(shí)施例7>以UMFP-3作為供體，以ECFP作為受體的FRET傳能對(duì)的制作和FRET 效率的研究在測(cè)定UMFP-3和ECFP的熒光光譜和FRET效率時(shí)，制作用限制性酶Xho I的識(shí) 別序列亮氨酸、谷氨酰胺酸這2個(gè)連接子氨基酸連結(jié)刪除了 C末端11氨基酸的UMFP-3 和刪除N末端4個(gè)氨基酸的mSECFP的嵌合蛋白質(zhì)(以下C A 11UMFP-LE-N A 4ECFP 核苷 酸序列和氨基酸序列分別記載于序列號(hào)24和25)。通過使用含有限制性酶BamHI的識(shí) 別序列的正義引物和含有限制性酶Xhol的識(shí)別序列的反義引物進(jìn)行PCR使CA11UMFP 的cDNA擴(kuò)增。而且，通過使用含有限制性酶Xhol的識(shí)別序列的正義引物和含有限 制性酶EcoRI的識(shí)別序列的反義引物，進(jìn)行PCR使N A 4ECFP的cDNA。將進(jìn)行了限制 性酶處理的產(chǎn)物導(dǎo)入于pRSETB (Invitrogen)，制作出大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的pRSETB/ C A 11UMFP-LE-N A 4ECFP。將 pRSETB/C A 11UMFP-LE-N A 4ECFP、pRSETB/UMFP-3、pRSETB/ ECFP導(dǎo)入大腸桿菌JM109 (DE3)，在室溫下使各個(gè)重組蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)行采用多組氨酸標(biāo) 記的純化。純化的試樣的熒光光譜的測(cè)定使用F-2500熒光分光光度計(jì)(HITACHI)。測(cè) 定使用將濃度為2iiM的試樣溶解于50mM HEPES(pH7. 4)的產(chǎn)物。圖5表示用355nm的 激發(fā)光激發(fā)C A 11UMFP-LE-N A 4ECFP (藍(lán)色)、UMFP-3 (紅色)、ECFP (藍(lán)綠色)時(shí)的熒 光光譜。通過該實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出CA 11UMFP-LE-NA4ECFP的FRET效率為約66%。就FRET 效率而言，例如，采用由于FRET效率的優(yōu)越性而一般使用的CFP-YFP的FRET傳能對(duì)的 cAMP 指齊(文獻(xiàn):Ponsioen, B. et al. Detecting cAMP—induced Epac activation by fluorescence resonanceenergy transfer :Epac as a novel cAMP indicator. EMB0 R印.5，1176-1180 (2004).)，有記載指出，根據(jù)熒光光譜進(jìn)行判斷，其FRET效率為幾個(gè)％左右。因此，本熒光蛋白質(zhì)傳能對(duì)與以往相比，用低波長的激發(fā)光，就可以以極高的效率發(fā)生 FRET。<實(shí)施例8>采用UMFP-3和mSECFP的FRET傳能對(duì)的SCAT type指示劑產(chǎn)生的 Caspase-3活性化的實(shí)時(shí)成像制成使用由UMFP-3向mSECFP的FRET的半胱氨酸蛋白酶caspase3的活性化指 示劑UC-SCAT3(核苷酸序列和氨基酸序列分別記載于序列號(hào)26和27)。表達(dá)本指示劑 基因的質(zhì)粒UC-SCAT3-pcDNA3. 1(_)通過以下方式制作，即用限制性酶Kpnl和HindHI 切斷由竹本等人開發(fā)的利用ECFP和Venus作為FRET傳能對(duì)的caSpaSe3活性化指示 劑 SCAT3(Takemoto K, Nagai T, Miyawaki A, et al. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicatorthat is insensitive to environmental effects. J. Cell Biol. 160 =235-243, 2003.)的 Venus 基因，在其中導(dǎo)入 UMFP-3，再用限制性 酶 BamHI 和 Kpnl 切斷 ECFP 基因，在其中導(dǎo)入 mSECFP。用 Surperfect (Invitrogen)將 UC-SCAT3-pcDNA3. 1 (-)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于35mm的玻底培養(yǎng)皿的HeLa細(xì)胞，使之在細(xì)胞質(zhì)中表 達(dá)。轉(zhuǎn)染1天后進(jìn)行成像。而且，為了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在進(jìn)行成像的90分鐘前，用50ng/ml TNFa和10iig/ml的環(huán)己酰亞胺處理細(xì)胞。觀察使用NikonTE-2000E倒置顯微鏡，物鏡使 用Apo-VC、60倍、開口數(shù)1. 35的油浸物鏡。在352-388nm波長域激發(fā)在HeLa細(xì)胞的細(xì)胞 質(zhì)中表達(dá)的UC-SCAT3。熒光的檢測(cè)，對(duì)于UMFP-3，使用415-455nm的波長域的帶通濾波器 檢測(cè)，對(duì)于ECFP，使用459-499nm的波長域的帶通濾波器檢測(cè)。圖6的左圖表示右圖的各 圓框內(nèi)(R0I :Region Of Interst)中UMFP-3/mSECFP伴隨Caspase-3的活性化的比率的變 化。橫軸表示自觀察開始時(shí)起的經(jīng)過時(shí)間。由該圖，清楚了伴隨UMFP-3/mSECFP熒光強(qiáng)度 比的變化，可以檢測(cè)Caspase-3的活性化。< 實(shí)施例 9>UMFP-4(ECFP-F46L-T65Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S-S175G-A206 K-T203V)的制備以實(shí)施例 3 中制備的編碼 UMFP-3 (ECFP-F46L-T65Q-W66F-S72A-Y145G-H148S-S17 5G-A206K-T203V)的質(zhì)粒載體pRSETB/UMFP-3作為模板，使用下述的引物DNA，進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。引物 10 :5，-TTCGGGGTGCTGTGCTTCGCC-3，(序列號(hào)12)即，制備含有 50ng 的 pRSETB/UMFP-3、lOpmol 的引物 10,3. 75nmol 的 dNTPs、l. 25U 的Pfu DNA聚合酶、20U的Pfu DNA連接酶(STRATAGENE公司)的20 y L反應(yīng)液，以進(jìn)行 65 °C、5分鐘的預(yù)溫育，通過Pfu DNA連接酶修復(fù)模板DNA的缺口，然后，95 °C、1分鐘的DNA 變性后，95°C、10秒鐘的DNA變性、55°C、30秒鐘的退火反應(yīng)和65°C、10分鐘的伸長 連結(jié)反 應(yīng)作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)反應(yīng)。在20 yL熱循環(huán)反應(yīng)后的反應(yīng)溶液中加入 0. 4 uL(8U)的Dpnl (New England BioLabs公司)，于37°C溫育1小時(shí)，再進(jìn)行酚氯仿提取 純化DNA后，通過氯化鈣法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)，獲得了具有編碼ECFP-F46L-T65Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S-S175G-A206K-T203V (UMFP-4)的質(zhì)粒載體 pRSETB/UMFP-4。 UMFP-4的核苷酸序列和氨基酸序列分別記載于序列號(hào)28和29。將用該載體pRSETB/UMFP-4，通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109 (DE3)在200mL 含有100 u g/mL的氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，于23°C培養(yǎng)4天，用法式細(xì)胞破碎器 (French Press)破碎所得細(xì)胞。從通過離心分離除去了破碎后的殘?jiān)纳锨逡褐?，用nickel chelating 柱(Qiagen 公司制)，用含有 100mM 咪唑和 300mM NaCl 的 50mMTris 鹽 酸緩沖液 pH7. 4 回收添加了組氨酸標(biāo)記的 ECFP-F46L-T65Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S -S175G-A206K-T203V。再通過 PD-10 脫鹽 緩沖液交換用柱(GEHealthcare Bio-Sciences 公司)，將緩沖液交換成50mM HEPES緩沖液pH7. 4，獲得了約500 u g/mL添加了組氨酸標(biāo)記 的 ECFP-F46L-T65Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S-S175G-A206K-T203V(UMFP-4)。< 實(shí)施例 10>Sirius(ECFP-F46L-T65Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S-S175G-A20 6K-T203V-F223S)的制備以 < 實(shí)施例 9> 中制備的編碼 ECFP-F46L-T65Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S-S1 75G-A206K-T203V的質(zhì)粒載體pRSETB/UMFP-4作為模板，使用下述的引物DNA，進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。引物 11 :5，-TTCGGGGTGCTGTGCTTCGCC-3，(序列號(hào)13)即，制備含有 50ng 的 pRSETB/UMFP-4、lOpmol 的引物 11,3. 75nmol 的 dNTPs、l. 25U 的Pfu DNA聚合酶、20U的Pfu DNA連接酶(STRATAGENE公司)的20 y L反應(yīng)液，以進(jìn)行 65 °C、5分鐘的預(yù)溫育，通過Pfu DNA連接酶修復(fù)模板DNA的缺口，然后，95 °C、1分鐘的DNA 變性后，95°C、10秒鐘的DNA變性、55°C、30秒鐘的退火反應(yīng)和65°C、10分鐘的伸長 連結(jié) 反應(yīng)作為1個(gè)循環(huán)，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)反應(yīng)。在20 yL熱循環(huán)反應(yīng)后的反應(yīng)溶液中加 A0. 4 uL(8U)的Dpnl (New England BioLabs公司)，于37°C溫育1小時(shí)，再進(jìn)行酚氯仿提 取純化DNA后，通過氯化鈣法，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)，獲得了具有編碼ECFP-F46L-T65 Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S-S175G-A206K-T203V-F223S(Sirius)的 DNA 的質(zhì)粒載體 pRSETB/Sirius。Sirius的核苷酸序列和氨基酸序列分別記載于序列號(hào)30和31。將用該載體pRSETB/Sirius，通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109 (DE3)在200mL 含有100 u g/mL的氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，于23°C培養(yǎng)4天，用法式細(xì)胞破碎器 (French Press)破碎所得細(xì)胞。從通過離心分離除去了破碎后的殘?jiān)纳锨逡褐?，?nickel chelating 柱(Qiagen 公司制)，用含有 100mM 咪唑和 300mM NaCl 的 50mMTris 鹽 酸緩沖液 pH7. 4 回收添加了組氨酸標(biāo)記的 ECFP-F46L-T65Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S -S175G-A206K-T203V-F223S (Sirius)。再通過PD-10 脫鹽 緩沖液交換用柱(GEHealthcare Bio-Sciences公司)，將緩沖液交換成50mM HEPES緩沖液pH7. 4，獲得了約500 u g/mL ECF P-F46L-T65Q-W66F-Q69L-S72A-Y145G-H148S-S175G-A206K-T203V-F223S(Sirius)?！磳?shí)施例11>采用雙光子激發(fā)顯微鏡觀察由細(xì)胞性粘菌盤基網(wǎng)柄菌 (Dictyostelium discoideum)產(chǎn)生的對(duì)表達(dá)Sirius的大腸桿菌E. Coli的吞噬作用預(yù)先于23. 3°C、10mL的HL5培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞性粘菌AX2，用 < 實(shí)施例10>制備的 質(zhì)粒載體pRSETB/Sirius通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)后，于2mL含有100 u g/ mL的氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、培養(yǎng)12小時(shí)。通過離心使細(xì)胞性粘菌AX2沉淀后， 再次懸浮于BSS緩沖液，通過離心使表達(dá)Sirius的大腸桿菌JM109 (DE3)沉淀后，再次懸浮 于PBS緩沖液中。在35mmPetri Dish上的1 %瓊脂糖凝膠上，將懸浮于緩沖液的細(xì)胞性粘菌 AX2和表達(dá)Sirius的大腸桿菌JM109(DE3)混合。然后在室溫下溫育1小時(shí)，將35mmPetri Dish上的瓊脂糖凝膠翻過來，用顯微鏡觀察混合的細(xì)胞性粘菌AX2和表達(dá)Sirius的大 腸桿菌JM109(DE3)。顯微鏡使用多光子激發(fā)顯微鏡Olympus Fluoview FV300，物鏡使用 UPlan FLN、40 倍、開口數(shù) 1. 30 (Olympus)的油浸物鏡。激光使用 Ti sapphire (MAITAI，SpectraPhysics公司)，用780nm的激發(fā)光對(duì)Sirius激發(fā)雙光子，進(jìn)行熒 光觀察。圖7表 示表達(dá)Sirius的大腸桿菌由于吞噬作用而進(jìn)入到細(xì)胞性粘菌，并逐漸被消化的情形。該圖 顯示，熒光強(qiáng)度為PH非依賴性的Sirius，相比于熒光強(qiáng)度依賴于pH的EGFP，可以明確確認(rèn) 進(jìn)入到處于酸性條件下的粘菌的吞噬體中的大腸桿菌的樣子。<實(shí)施例12>同時(shí)使用以Sirius作為供體，以mSECFP作為受體的FRET傳能對(duì)和 以Sapphire作為供體，以DsRed作為受體的FRET傳能對(duì)的1個(gè)波長激發(fā)測(cè)4個(gè)波長的熒 光的Dual FRET觀察最初，制備使用由Sirius向mSECFP的FRET的半胱氨酸蛋白酶caspase3的活性 化指示劑SC-SCAT3(核苷酸序列和氨基酸序列分別記載于序列號(hào)32和33。)。表達(dá)本指 示劑基因的質(zhì)粒SC-SCAT3-pcDNA3. 1㈠通過用限制性酶Kpnl和Hindlll切斷 < 實(shí)施例8> 中制備的UC-SCAT3的UMFP-3基因，在其中導(dǎo)入Sirius制成。使該 caspase3 指示劑 SC-SCAT3 和鈣離子指示劑 SapRC2 (Mizuno H, Sawano A, Miyawaki A, et al. :Red Fluorescent Protein from Discosoma as aFusion Tag and a Partner for Fluorescence Resonance Energy Transfer. Biochemistry. 40 2502-2510,2001.)這兩組的FRET傳能對(duì)在HeLa細(xì)胞內(nèi)中表達(dá)。即，通過使用4 yl的 Surperfect (Invitrogen)，將 1 ii g/dish 的 pcDNA3. 1 (-) /SC-SCAT3 和 pcDNA3/SapRC2 導(dǎo)入 于培養(yǎng)在35mm玻底培養(yǎng)皿上的HeLa細(xì)胞中，使之共表達(dá)來進(jìn)行。觀察在導(dǎo)入質(zhì)粒載體2天后進(jìn)行。而且，為了在HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在即 將進(jìn)行成像前，用50ng/ml TNFa和10 y g/ml環(huán)己酰亞胺處理細(xì)胞。Wide-field熒光觀 察用TE-2000E倒置顯微鏡(Nikon)進(jìn)行，物鏡使用ApO_VC、60倍、開口數(shù)1. 35的油浸物鏡 (Nikon)。而且，干涉濾鏡都使用Semrock公司的產(chǎn)品。SC-SCAT3、SapRC2的發(fā)光觀察，都是以水銀弧光燈作為光源，通過FF01-370/36的 激發(fā)濾片和CFW-DiOi-Clin的二色鏡激發(fā)。Sirius、mSEECFP、Sapphire、DsRed的熒光檢測(cè) 分別通過 FF01-435/40、FF01/479/40、FF01-525/39、FF01-585/40 的濾片進(jìn)行。圖 8 表示 同時(shí)經(jīng)時(shí)觀察細(xì)胞凋亡過程的HeLa細(xì)胞內(nèi)caspasd的活性化和Ca2+的動(dòng)態(tài)圖像。由該 圖清楚了，可以同時(shí)觀察伴隨由于使caSpaSe3指示劑SC-SCAT3和鈣離子指示劑SapRC2在 細(xì)胞中共表達(dá)而誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的caSpaSe3的活性化和鈣離子濃度的時(shí)間變化。工業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)第一次發(fā)出從未有過的424nm這樣的發(fā)光波長峰的熒光，作 為深藍(lán)色，可以通過肉眼與其它熒光蛋白質(zhì)識(shí)別開來。而且，熒光強(qiáng)度不受pH的變化影響 的具有PH非依賴性的熒光強(qiáng)度的本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)可以使原本難以在酸性環(huán)境下利用 熒光蛋白質(zhì)成為可能。因此，本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)能夠提供用于使用無損傷的生物體或細(xì) 胞，通過目視觀察或確認(rèn)生物體或細(xì)胞內(nèi)的特定物質(zhì)的局部存在性，以及進(jìn)行特定基因表 達(dá)的確認(rèn)等的，可適于更多種條件的熒光蛋白質(zhì)，能夠?qū)Ψ肿由飳W(xué)中的研究等有大的貢 獻(xiàn)。
權(quán)利要求
一種熒光蛋白質(zhì)，由在序列號(hào)1所示的氨基酸序列中，66位的氨基酸殘基和175位的氨基酸殘基分別被取代，而且72位的氨基酸殘基或206位的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基也被取代的氨基酸序列構(gòu)成，發(fā)光波長峰為424nm。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光蛋白質(zhì)，其72位的氨基酸殘基和206位的氨基酸殘基全都 被取代。
3.如權(quán)利要求2所述的熒光蛋白質(zhì)，其66位的氨基酸殘基被取代為苯基丙氨酸，72位 的氨基酸殘基被取代為丙氨酸，175位的氨基酸殘基被取代為甘氨酸，和206位的氨基酸殘 基被取代為賴氨酸。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)，其65位的氨基酸殘基、145位的氨 基酸殘基或148位的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基也被取代。
5.如權(quán)利要求4所述的熒光蛋白質(zhì)，其65位的氨基酸殘基、145位的氨基酸殘基和148 位的氨基酸殘基均被取代。
6.如權(quán)利要求5所述的熒光蛋白質(zhì)，其65位的氨基酸殘基被取代為谷氨酰胺，145位 的氨基酸殘基被取代為甘氨酸，和148位的氨基酸殘基被取代為絲氨酸。
7.如權(quán)利要求4 6中任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)，其46位的氨基酸殘基也被取代。
8.如權(quán)利要求7所述的熒光蛋白質(zhì)，其46位的氨基酸殘基被取代為亮氨酸。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)，其203位的氨基酸殘基也被取代。
10.如權(quán)利要求9所述的熒光蛋白質(zhì)，其203位的氨基酸殘基被取代為纈氨酸。
11.如權(quán)利要求10所述的熒光蛋白質(zhì)，其66位的氨基酸殘基被取代為苯基丙氨酸，175 位的氨基酸殘基被取代為甘氨酸，72位的氨基酸殘基被取代為丙氨酸，206位的氨基酸殘 基被取代為賴氨酸，65位的氨基酸殘基被取代為谷氨酰胺，145位的氨基酸殘基被取代為 甘氨酸，148位的氨基酸殘基被取代為絲氨酸，46位的氨基酸殘基被取代為亮氨酸，和203 位的氨基酸殘基被取代為纈氨酸。
12. 一種熒光蛋白質(zhì)，由權(quán)利要求1 11所述的熒光蛋白質(zhì)中，再缺失、取代或添加了 一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成，發(fā)光波長峰為424nm。
13. 一種融合蛋白質(zhì)，由權(quán)利要求1 12中任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)和任意的蛋白質(zhì) 或多肽構(gòu)成。
14. 一種核酸，編碼權(quán)利要求1 13中任一項(xiàng)所述的熒光蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)。
15. 一種載體，表達(dá)由權(quán)利要求14所述的核酸所編碼的熒光蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)。
16. 一種宿主細(xì)胞，由權(quán)利要求15所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有新的發(fā)光波長峰的GFP的人工突變體。由在序列號(hào)1所示的氨基酸序列中，66位的氨基酸殘基和175位的氨基酸殘基分別被取代，而且72位的氨基酸殘基或206位的氨基酸殘基的至少一個(gè)氨基酸殘基被取代的氨基酸序列構(gòu)成的，發(fā)光波長峰為424nm的熒光蛋白質(zhì)；或65位、145位、148位、46位、和/或203位的各氨基酸殘基還被取代的，發(fā)光波長峰為424nm的，具有pH非依賴性熒光強(qiáng)度的熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的熒光蛋白質(zhì)發(fā)出424nm這樣的發(fā)光波長峰的熒光，其作為深藍(lán)色可通過肉眼將其與其它熒光蛋白質(zhì)識(shí)別開。而且，具有pH的變化不會(huì)影響熒光強(qiáng)度的pH非依賴性的熒光強(qiáng)度。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101809152SQ20088010177
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月3日
發(fā)明者友杉亙, 松田知己, 永井健治 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人北海道大學(xué)