專利名稱：獲取生物源樣本的圖像的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對諸如細(xì)胞、細(xì)菌和其他生物樣本的生物源樣本(或標(biāo) 本)發(fā)出的微光成像的方法和裝置，更具體的說，本發(fā)明涉及通過對生物發(fā) 光現(xiàn)象產(chǎn)生的弱光成像而對這種樣本進(jìn)行觀察和各種測量的方法和裝置。
背景技術(shù)：
近年來，在生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中越來越多的使用對生物源的樣本成
像的技術(shù)，該生物源樣本如細(xì)胞，具有熒光蛋白質(zhì)例如GFP，和/或發(fā)光蛋 白質(zhì)，例如熒光素酶、發(fā)光蛋白質(zhì)通過轉(zhuǎn)基因而在任意細(xì)胞中表達(dá)?？梢?表達(dá)熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)，同時與細(xì)胞內(nèi)另外任意的某種蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)標(biāo)記) 混合，并且，如果將熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)編碼基因插入或替換特定遺傳調(diào)節(jié) 區(qū)域的下游側(cè)，將僅基于特定遺傳調(diào)節(jié)區(qū)域的激活而表達(dá)該熒光或發(fā)光蛋 白質(zhì)。因此，至今為止，在細(xì)胞內(nèi)和/或外發(fā)生的各種生物現(xiàn)象中，想要使 得與蛋白質(zhì)表示或遺傳區(qū)域的激活一起表達(dá)的熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)被觀察 到，以及在使用光學(xué)顯微鏡檢測和/或探測所觀察的蛋白質(zhì)或遺傳區(qū)域何時 以及如何表示，和/或得到的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)和外將如何表現(xiàn)，就使用這種 熒光或發(fā)光蛋白質(zhì)作為報告分子或探針分子。
熒光蛋白質(zhì)，諸如GFP在細(xì)胞內(nèi)相對穩(wěn)定，且從中發(fā)出的熒光明亮， 因此廣泛使用這些蛋白質(zhì)來穩(wěn)定和簡便地執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的成像(例如，參 見Mason(1999年)Fluorescent and luminescent probes for biological activity,
第二版)。另一方面，諸如熒光素酶的發(fā)光蛋白質(zhì)通過化學(xué)發(fā)光和/或生物發(fā) 光現(xiàn)象發(fā)光而沒有激勵熒光染料的激發(fā)光(激發(fā)光通常對于細(xì)胞或其他生 物樣本有害)。因此，對于在光學(xué)顯微鏡下觀察期間，期待發(fā)光蛋白質(zhì)作為
一種探頭對生物樣本成像而不對其形成傷害，并且也報道了 一些使用這種 發(fā)光蛋白質(zhì)的成像技術(shù)的例子。例如，Rutter等人通過使用光子計數(shù)攝像機 在單個活細(xì)胞中對熒光素酶的基因表達(dá)成像，觀測到在胰島素發(fā)出的信號
中包括MAP致活酶(Rutter, White, Tavare (1995年)"Involvement of MAP kinase in insulin signalling revealed by non-invasive imaging of luciferase gene expression in single living cells" Current Biology Vol. 5 890-899.)。 Sternberg 等人也報道了使用光子計數(shù)攝像機和冷卻CCD攝像機探測生物發(fā)光 (Sternberg, Eberl， Kongsbak, Molin (1997年),"Detection of bioluminescence from individual bacterial cells: a comparison of two different low-light imaging system" J. Bioluminescence and Chemiluminescence Vol. 12: 7-13.)。此夕卜， Takasuka等人也報告通過使用光子計數(shù)攝像機在單個活細(xì)胞中對熒光素酶 的基因表達(dá)成像觀察到泌乳刺激素促進(jìn)劑活性的動態(tài)變化(Takasuka, White: Wood, Robertson, Davis (1998年)，"Dynamic changes in prolactin promoter activation in individual living lactotrophic cells" Endocrinology Vol, 139: 1361-1368.)。
如上所述，在對上述細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的熒光和/或發(fā)光蛋白質(zhì)成像時， 該熒光蛋白質(zhì)的熒光相對較亮，因此通過成像系統(tǒng)中配備的常規(guī)光學(xué)顯微 鏡可以獲得它們熒光的相對清楚的顯微鏡圖像。然而，來自細(xì)胞或其他生 物樣本(此后稱作"細(xì)胞等")的發(fā)光蛋白質(zhì)的光強通常非常弱或細(xì)微，因此很 難使用用于正常顯微鏡圖像的攝像機和成像系統(tǒng)獲得發(fā)光的顯微鏡圖像 (實際上，通常通過人眼不能觀察到發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光)。因此，在對發(fā)光蛋 白質(zhì)成像的常規(guī)系統(tǒng)中，專用于探測微光的攝像機或圖像采集設(shè)備，諸如 超高靈敏度攝像機或光子計數(shù)攝像機被安裝到光學(xué)顯微鏡上(但是，即使具 有超高靈敏度攝像機，還是需要在攝像機的光接收面上對來自樣本的光積 分至少數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘以產(chǎn)生一幅圖像)。
以此方式，在光學(xué)顯微鏡的熒光或發(fā)光觀察中，顯微鏡圖像中的光原 理上僅是蛋白質(zhì)發(fā)出的光。因此，在樣本中沒有蛋白質(zhì)存在的區(qū)域中的條 件或形態(tài)是不能觀察到的。在觀察熒光蛋白質(zhì)的情況下，然而，可以觀察 到細(xì)胞的形態(tài)和條件等，因為它們具有相對較亮的熒光，并且由于應(yīng)用了 激發(fā)光而來自細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白質(zhì)之外材料的自熒光發(fā)射等。另一方面，在 發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光觀察的情況下，來自樣本的光，諸如來自發(fā)光蛋白質(zhì)的 光非常微弱，以至于不能產(chǎn)生圖像，除非將其積分若干至數(shù)十分鐘，并且， 在發(fā)光蛋白質(zhì)之外沒有材料發(fā)射光的情況下，就很難獲得在樣本中細(xì)胞等
位置、形態(tài)以及這些改變(在沒有光的區(qū)域不能知道是否有細(xì)胞存在)。然而， 在觀察期間，尤其是長時間觀察活細(xì)胞樣本等時，光強會變化，和/或細(xì)胞 會移動或變形，并且因此很難確定哪個細(xì)胞或細(xì)胞的哪個部分發(fā)光。例如， 很難分析細(xì)胞質(zhì)中發(fā)光改變現(xiàn)象以及某些神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)突起。
在一些現(xiàn)有技術(shù)中，為了觀察細(xì)胞等的位置和形態(tài)，與發(fā)光蛋白質(zhì)的 發(fā)光觀察一起執(zhí)行透射光觀察。在此情況下，然而，透射光觀察和發(fā)光觀 察中攝像機光接收面上的光量非常不同。因此，對于透射光觀察和發(fā)光觀 察，使用不同攝像機(使用不同的物鏡)，并且由此不同的攝像機分別產(chǎn)生發(fā) 光圖像(來自發(fā)光蛋白質(zhì)的光的圖像)和照明圖像(透射光的圖像)。因此，顯 微鏡圖像示出細(xì)胞的形態(tài)等，且在不同的圖像上創(chuàng)建出示出發(fā)光蛋白質(zhì)的 分布的顯微鏡圖像，這就使得很難精確確定樣本中發(fā)光蛋白質(zhì)的實際分布 或位置(通常，攝像機對于透射光觀察和發(fā)光觀察的視場的尺寸和/或位置會 偏移，并且在這種情況下，在樣本中確定發(fā)光蛋白質(zhì)的實際分布和位置就 變得更困難)。此外，在一次觀察很多細(xì)胞的時候，不容易找到與照明圖像 中細(xì)胞對應(yīng)的、發(fā)光圖像中對應(yīng)的發(fā)光細(xì)胞。
在上述使用發(fā)光蛋白質(zhì)的"發(fā)光成像"中，如果可以探測或限定樣本中 發(fā)光蛋白質(zhì)的分布，同時獲得同一樣本中細(xì)胞的形態(tài)和/或條件等，就可以 加寬"發(fā)光成像"的應(yīng)用范圍，并且將在對于各種生物過程中涉及的反應(yīng)等 的分析中變得有用。如上所述，然而，在現(xiàn)有技術(shù)中，由于發(fā)光蛋白質(zhì)的 光很微弱且在樣本中不包括發(fā)光蛋白質(zhì)的區(qū)域沒有光，就很難關(guān)于某些細(xì) 胞中什么位置和/或樣本中哪個細(xì)胞表現(xiàn)出發(fā)光蛋白質(zhì)的信息，盡管可以探 測樣本中發(fā)光蛋白質(zhì)表示的存在或不存在。實際上，通過超高靈敏度圖像 探測元件，可以執(zhí)行弱光探測，但是在此情況下，可以獲得的圖像僅僅是 鑲嵌圖像，并且因此很難執(zhí)行詳細(xì)分析，同時限定其中要測量發(fā)光量的區(qū) 域。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種裝置和方法，用于對上述生物 發(fā)光現(xiàn)象產(chǎn)生弱光的細(xì)胞和/或其他生物樣本成像，其中以這樣的方式獲得 細(xì)胞等的發(fā)光圖像，其中可以確定發(fā)光細(xì)胞和/或細(xì)胞中的發(fā)光位置。 本發(fā)明的另一個目的是提供這樣一種方法和裝置，其可以從特定區(qū)域 獲取數(shù)據(jù)，并且在細(xì)胞中用于分析各種現(xiàn)象。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，通過光學(xué)成像裝置獲得生物源的樣本圖像的 裝置的特征在于該裝置包括照明部分，用于照射樣本；照明圖像獲取部 分，用于獲得樣本的照明圖像；發(fā)光圖像獲取部分，其獲取樣本中細(xì)胞的 發(fā)光圖像；以及圖像處理部分，用于疊加照明圖像和發(fā)光圖像，以產(chǎn)生疊 加圖像，并確定或指定疊加圖像中所分析區(qū)域。在此結(jié)構(gòu)中，通常光學(xué)成 像設(shè)備可以是光學(xué)顯微鏡。在此情況下，照明圖像是在光學(xué)顯微鏡下使用 來自照明部分的照明光通過執(zhí)行透射光觀察獲得的透射光顯微鏡圖像，且 發(fā)光圖像是通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象獲得的發(fā)光顯微鏡圖像。 該照明圖像獲取部分和發(fā)光圖像獲取部分優(yōu)選包括共用的顯微鏡圖像采集 設(shè)備，通過該設(shè)備采集透射光顯微鏡圖像和發(fā)光顯微鏡圖像。
根據(jù)上述結(jié)構(gòu)，通過觀察樣本細(xì)胞中的發(fā)光現(xiàn)象獲得的發(fā)光圖像與通 過照明樣本獲得的照明圖像相疊加，因此其中細(xì)胞的形態(tài)和/或條件等可以 被觀察到，并且因此，可以比以往更加精確的在樣本和/或細(xì)胞中定位發(fā)光 圖像中細(xì)胞的發(fā)光位置。尤其是，通過通用顯微鏡圖像采集設(shè)備獲得照明 圖像(透射光顯微鏡圖像)和發(fā)光圖像(發(fā)光顯微鏡圖像)時，疊加圖像就變得 非常容易。甚至在觀察區(qū)域中具有類似形態(tài)的很多細(xì)胞的時候，其中通過 觀看將發(fā)光圖像與照明圖像疊加得到的、示出樣本中細(xì)胞形態(tài)的圖像，可 以立即確定發(fā)光的細(xì)胞，并且因此，在圖像中要觀看的區(qū)域，即分析發(fā)光 現(xiàn)象中要監(jiān)視的區(qū)域等(分析區(qū)域)就很容易被找到。此外，可以在發(fā)光圖像 中獲得樣本的條件，因此，甚至在細(xì)胞移動和/或變形的時候，可以容易地 判斷哪個細(xì)胞、在何處或如何移動和/或變形，并且相應(yīng)的，可以容易地發(fā) 現(xiàn)發(fā)光如何變化。此外，依照本發(fā)明的結(jié)構(gòu)，盡管僅通過在發(fā)光圖像中觀 察，在樣本的細(xì)胞密度中很難區(qū)別隨機發(fā)生的多個細(xì)胞的重疊，但是可以 指定具有適當(dāng)細(xì)胞密度的區(qū)域并隨后判斷是否存在重疊細(xì)胞，由此使得可 以更精確的分析發(fā)光量。
在本發(fā)明的裝置中，如上所述，要彼此疊加的透射光顯微鏡圖像和發(fā) 光顯微鏡圖像優(yōu)選通過共用顯微鏡圖像采集設(shè)備采集。此時，依照本申請 發(fā)明人的研究，已經(jīng)知道，在顯微鏡圖像采集設(shè)備的光接收面上形成樣本
圖像的物鏡和光學(xué)顯微鏡的透鏡組件設(shè)計為使得物鏡的數(shù)值孔徑(NA)與投 射在光接收面上的樣本圖像的放大率((3)之間比率(NA/p)的平方值為0.01或 更大，使用諸如CCD攝像機的圖像采集設(shè)備僅從單個細(xì)胞發(fā)出的光可產(chǎn)生 圖像(參見日本專利申請No.2005-267531)。此外，令人驚訝的，此成像條件 可以用于所有源于生物樣本的成像，而其在過去很難成像，并且已經(jīng)知道 即使是在光學(xué)顯微鏡下眼睛很難直接看到的微弱的發(fā)光分量，諸如生物發(fā) 光，細(xì)胞的圖像等可以在較短時間段內(nèi)獲得(例如20分鐘)。此外，依照發(fā) 明人研究的光學(xué)條件，已經(jīng)知道在圖像采集設(shè)備物鏡的數(shù)值孔徑(NA)/投影 圖像的放大率(P)的平方值表示的光學(xué)條件是0.071或更高的時候，可以在1 到5分鐘的短時間內(nèi)進(jìn)行成像，使得可以獲得甚至在圖像分析中可用的細(xì) 胞等的圖像。因此，在本發(fā)明裝置的一個實施例中，通過設(shè)置顯微鏡圖像 采集設(shè)備的光接收面和物鏡以及透鏡組件，以將其NA/p的平方值設(shè)置為 0.01或更高，更優(yōu)選的為0.071或更高，就可以創(chuàng)建透射光顯微鏡圖像和發(fā) 光顯微鏡圖像的更好的疊加圖像。
此外，在本發(fā)明的裝置中，還可以提供獲取細(xì)胞熒光圖像的熒光圖像 獲取部分。在光學(xué)成像設(shè)備是光學(xué)顯微鏡的時候，熒光圖像是用光學(xué)顯微 鏡執(zhí)行樣本熒光觀察獲得的熒光顯微鏡圖像。同樣在此情況下，熒光顯微 鏡圖像和發(fā)光顯微鏡圖像可以通過共用顯微鏡圖像采集設(shè)備獲得。本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的，在熒光觀察中，通過使用對環(huán)境條件諸如pH、 Ca濃度 或膜電位等敏感的各種熒光染料，可以探測各種細(xì)胞間的反應(yīng)。因此，應(yīng) 該理解，將這種熒光觀察獲得的熒光圖像和發(fā)光圖像結(jié)合可以揭示細(xì)胞中 發(fā)光位置與各種細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)象間的關(guān)系。需要說明，樣本中細(xì)胞形態(tài)等與發(fā) 光位置間的空間關(guān)系可以通過疊加發(fā)光圖像和照明圖像而容易地獲得，并 且，依照此特征，還可以進(jìn)一步增加結(jié)合發(fā)光圖像和熒光圖像的用處。
在本發(fā)明裝置的一個實施例中，可以提供顯示疊加圖像的顯示部分， 以給用戶容易地在顯示部分上觀看樣本中或細(xì)胞中的發(fā)光位置。此外，在 本發(fā)明的裝置中，可以提供記錄部分來記錄疊加圖像，用于圖像的分析和 顯示。
另外，如上所述，在觀察細(xì)胞發(fā)光中，尤其對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的諸如熒光 素酶、發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光成像的過程中，將發(fā)光蛋白質(zhì)基因
引入細(xì)胞，使得表達(dá)相應(yīng)的發(fā)光蛋白質(zhì)，同時與任意的蛋白質(zhì)(觀察對象) 混在一起，或者，該基因可以被替換、或插入遺傳調(diào)控區(qū)的下游側(cè)，并因 此將得到的表達(dá)的發(fā)光蛋白質(zhì)用作報告分子，用于探測何時何地表達(dá)測量 中的任意目標(biāo)蛋白質(zhì)。這樣，在細(xì)胞接收各種激勵之一的時候，在細(xì)胞中 經(jīng)常通過發(fā)光蛋白質(zhì)表達(dá)要報告的蛋白質(zhì)。因此，在本發(fā)明裝置的一個實 施例中，可以提供用于給細(xì)胞提供任意激勵的細(xì)胞激勵供給部分。例如， 該細(xì)胞激勵供給部分可以包括至少一個從具有以下部分的組中選出的部 分試劑供給部分，給細(xì)胞提供試劑；溫度調(diào)節(jié)部分，用于調(diào)節(jié)樣本的溫 度；以及氣體供給部分，用于給細(xì)胞提供氣體。
此外，在一個實施例中，本發(fā)明的上述裝置可以是獲取生物源的樣本 的圖像的裝置，包括光學(xué)顯微鏡；顯微鏡圖像采集設(shè)備，用于采集光學(xué)顯 微鏡觀察的顯微鏡圖像；以及圖像處理設(shè)備，用于獲得顯微鏡圖像作為圖 像數(shù)據(jù)并執(zhí)行圖像處理，其特征在于該圖像處理設(shè)備包括圖像疊加部分， 用于通過疊加透射光圖像和發(fā)光圖像產(chǎn)生疊加圖像，其中在光學(xué)顯微鏡下 用顯微鏡圖像采集設(shè)備在樣本的透射光觀察中采集樣本圖像獲得透射光圖 像，以及通過用顯微鏡圖像采集設(shè)備對樣本中細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光進(jìn) 行采集獲得發(fā)光圖像；還包括圖像區(qū)域指定部分，用于指定疊加圖像中的 分析區(qū)域。在此裝置中，^t選的，該顯微鏡圖像采集設(shè)備具有光接收面， 且該光學(xué)顯微鏡包括物鏡和透鏡組件，其在顯微鏡圖像采集設(shè)備的光接收 面上形成樣本的圖像，其中將光學(xué)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)構(gòu)建為使得物鏡的數(shù) 值孔徑與在光接收面上投影樣本圖像的放大率之間的比率的平方值為0.01 或更高。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種利用光學(xué)成像設(shè)備獲取生物源的 樣本的圖像的方法，包括下面的步驟照射樣本并獲取其照明圖像；不照 明樣本獲得樣本細(xì)胞中發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光的發(fā)光圖像；疊加照明圖像和發(fā) 光圖像以產(chǎn)生疊加圖像；確定疊加圖像中的分析區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的方法， 如上裝置所述的，可以產(chǎn)生照明圖像和發(fā)光圖像的疊加圖像，并且由此執(zhí) 行發(fā)光現(xiàn)象的分析，其中在照明圖像中出現(xiàn)的樣本或細(xì)胞中獲得找到發(fā)光 的區(qū)域。這樣，可以用上述裝置執(zhí)行本發(fā)明的方法，但是也可以用其他任 意的設(shè)備進(jìn)行。此外，在本發(fā)明的方法中，可以執(zhí)行在樣本細(xì)胞中獲取熒
光圖像以及發(fā)光圖像和照明圖像的步驟，并且因此可以將發(fā)光現(xiàn)象與從熒 光獲得的信息關(guān)聯(lián)起來，同時獲得在細(xì)胞或樣本中哪里發(fā)生發(fā)光現(xiàn)象。
在上述方法中，以及在上述裝置中，光學(xué)成像設(shè)備可以是光學(xué)顯微鏡。 此時，照明圖像是使用光學(xué)顯微鏡執(zhí)行透射光觀察獲得的透射光顯微鏡圖 像，且發(fā)光圖像是用光學(xué)顯微鏡觀察樣本細(xì)胞中發(fā)光現(xiàn)象獲得的發(fā)光顯微 鏡圖像，其中優(yōu)選的是，通過通用顯微鏡圖像采集設(shè)備采集透射光顯微鏡 圖像和發(fā)光顯微鏡圖像。此外，在光學(xué)顯微鏡中，優(yōu)選將在顯微鏡圖像采 集設(shè)備的光接收面上形成樣本圖像的物鏡和透鏡組件設(shè)計為使物鏡的數(shù) 值孔徑與在光接收面上投影樣本圖像的放大率之間的比率的平方值為0.01 或更高。
在一個實施例中，例如在長時間對發(fā)光現(xiàn)象成像時，照射樣本并獲取 照明圖像的步驟執(zhí)行多次，因此可以任意檢査樣本中細(xì)胞等形態(tài)的改變和/ 或位置的移動等。此外，在其細(xì)胞內(nèi)基因中要觀察的細(xì)胞結(jié)合了給細(xì)胞提 供某特定激勵如試劑激勵、電激勵、氣體激勵或熱激勵而表達(dá)的發(fā)光蛋白 質(zhì)基因時，有選擇的給細(xì)胞提供上述至少一種激勵的步驟可以在獲得照明 圖像和發(fā)光圖像(或還可以獲得熒光圖像)的步驟之前進(jìn)行。此時，為了在提 供激勵前檢査條件，優(yōu)選將獲得細(xì)胞照明圖像和發(fā)光圖像的步驟在提供細(xì) 胞激勵之前進(jìn)行。
此外，獲得一系列上述各種圖像以及疊加照明圖像和發(fā)光圖像的步驟 之后，可以執(zhí)行顯示和/或記錄照明圖像和發(fā)光圖像的疊加圖像的步驟，以 允許用戶檢査圖像和/或隨后執(zhí)行任意處理。
此外，可選的，在指定分析區(qū)域之后，為了詳細(xì)檢查或觀察分析區(qū)域 的條件，可以執(zhí)行顯示對應(yīng)于分析區(qū)域的照明圖像區(qū)域，對應(yīng)于分析區(qū)域 的發(fā)光圖像區(qū)域以及對應(yīng)于分析區(qū)域的熒光圖像區(qū)域中至少兩個(在也需 要熒光圖像時)的步驟。在發(fā)光現(xiàn)象的分析中，可以執(zhí)行測量發(fā)光圖像中與 分析區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域的光強的步驟和顯示該光強改變的步驟。
從上面的描述可以知道，在發(fā)光圖像中，通常樣本中沒有發(fā)光蛋白質(zhì) 的區(qū)域條件是本質(zhì)上不能觀察的，且圖像采集設(shè)備或攝像機中觀察的光很 微弱，因此，即使可以探測發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光現(xiàn)象，也很難正確獲得樣本 中何處出現(xiàn)發(fā)光現(xiàn)象。依照本發(fā)明的裝置和方法，產(chǎn)生通過疊加照明圖像
和發(fā)光圖像獲得的圖像，因此可以分析發(fā)光現(xiàn)象同時獲得樣本中出現(xiàn)發(fā)光 的位置。根據(jù)本發(fā)明的特征，由于發(fā)光細(xì)胞和非發(fā)光細(xì)胞分別可以從照明 圖像和發(fā)光圖像的疊加圖像中立即確定，就可以對觀察到發(fā)光的細(xì)胞數(shù)量 以及沒有觀察到發(fā)光的細(xì)胞的數(shù)量執(zhí)行任意統(tǒng)計分析。此外，與現(xiàn)有技術(shù) 相比，可以容易地執(zhí)行僅監(jiān)視發(fā)光細(xì)胞的發(fā)光強度的隨時間的觀察。例如， 在測量過程中樣本內(nèi)細(xì)胞移動時，就可以跟蹤照明圖像和發(fā)光圖像的疊加 圖像中的發(fā)光細(xì)胞。過去，在增加顯微鏡物鏡的放大率的時候，由于增加 了物鏡的放大率，來自發(fā)光位置的信號相對減少，因此可能錯過發(fā)光位置。 然而，根據(jù)本發(fā)明，由于可以在發(fā)光圖像和照明圖像的疊加圖像上確定樣 本的發(fā)光位置，就減少了失敗，例如錯過發(fā)光位置。
可以說，上述的本發(fā)明增加了在細(xì)胞和/或其他生物樣本成像中發(fā)光蛋 白質(zhì)的用處。根據(jù)本發(fā)明，過去僅對報告分子使用發(fā)光蛋白質(zhì)以光譜執(zhí)行 的、對細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)的各種試驗、測量和分析，可通過成像來 進(jìn)行，其中標(biāo)識了各個細(xì)胞。
本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點通過下面的說明將變得顯而易見。


圖1A是示意圖，示出微光測量裝置第一實施例的結(jié)構(gòu)的概況，其包括 依照本發(fā)明的反轉(zhuǎn)的光學(xué)顯微鏡，且圖1B是圖1A的樣本容器附近的結(jié)構(gòu) 的詳細(xì)的示意圖，包括給樣本中的細(xì)胞提供激勵的設(shè)備；
圖2A以功能框圖的形式示出微光測量裝置的計算機80的結(jié)構(gòu)(圖像處 理設(shè)備)，且圖2B示出與計算機80連接的控制面板的示意圖3以流程圖的形式示出本發(fā)明獲得生物源樣本圖像的方法的步驟， 其通過本發(fā)明的微光測量裝置進(jìn)行；
圖4示意示出在NIH3T3細(xì)胞中觀察的發(fā)光強度的周期性變化，其中 通過將熒光素酶基因連接到具有時鐘基因結(jié)合其中的表達(dá)載體，來表現(xiàn)出 質(zhì)體。在24小時的周期中當(dāng)發(fā)光變得很微弱的時候(a)，就不能獲得發(fā)光的 圖像；
圖5示出本發(fā)明微光測量裝置的第二實施例的結(jié)構(gòu)(光學(xué)系統(tǒng))的示意 圖，其同時執(zhí)行熒光和生物發(fā)光測量；
圖6是本發(fā)明微光測量裝置的第三實施例的結(jié)構(gòu)(光學(xué)系統(tǒng))的示意圖， 其同時執(zhí)行熒光和生物發(fā)光測量，以及分別進(jìn)行數(shù)字變焦和光學(xué)變焦的圖 像擴展；
圖7是說明將要引入用作例子1的樣本Hda細(xì)胞中的質(zhì)體中預(yù)計的分 子條件的圖，質(zhì)體中將熒光素酶基因連接到具有四環(huán)素操縱子(Tet02)的表 達(dá)載體。如圖7A所示，將TetR同型二聚體與Tet02區(qū)域結(jié)合時，不表達(dá) 連接到Tet02的熒光素酶基因。另一方面，在給細(xì)胞四環(huán)素時，TetR同型 二聚體結(jié)構(gòu)改變并且與Tet02區(qū)域分開，如圖7B所示，導(dǎo)致表達(dá)熒光素酶；
圖8是示出例子1中添加四環(huán)素和曝光照明圖像和發(fā)光圖像的時間；
圖9A、 9B和9C的每個示出例子l中獲得的照明圖像、發(fā)光圖像以及 疊加圖9A中照明圖像和圖9 B中發(fā)光圖像得到的圖像(圖9A的框內(nèi)的擴展 圖像)。在圖9C中，表示為ROI-l和ROI-2的方框指定為分析區(qū)域；
圖10示出圖9C中指定的分析區(qū)域中(Hela細(xì)胞)發(fā)光強度隨時間變化 的圖IIA、 11B和11C的每個示出例子2中獲得的照明圖像、發(fā)光圖像 以及疊加圖IIA中照明圖像和圖11B中發(fā)光圖像得到的圖像。發(fā)光位置在 實際的裝置中通過偽彩色顯示，但是，圖11C中以白色顯示；
圖12為示出圖11中PP-1區(qū)域中發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強度隨時間變化的圖13A、 13B和13C的每個示出例子3中獲得的照明圖像、發(fā)光圖像 以及疊加圖13A中照明圖像和圖13B中發(fā)光圖像得到的圖像；
圖14是示出例子3中隨時間進(jìn)展的發(fā)光細(xì)菌移動的疊加圖像(左)和照 明圖像(右)；
圖15是例子3中發(fā)光細(xì)菌(V.t.)的發(fā)光強度隨時間變化的圖。 最佳實施方式
下面，對參照附圖的若干優(yōu)選實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，其中相同參考 標(biāo)記表示相同的部件。
本發(fā)明裝置的第一實施例 裝置的結(jié)構(gòu)
圖1A是本發(fā)明第一實施例優(yōu)選裝置的示意圖，其獲取生物源樣本的圖
像，以測量生物發(fā)光現(xiàn)象產(chǎn)生的微光，并執(zhí)行細(xì)胞和/或其他生物樣本的成 像。(此后稱作"微光測量裝置")。
參照附圖，本發(fā)明的微光測量裝置包括反轉(zhuǎn)的顯微鏡，包括光源2、照 明光學(xué)系統(tǒng)l，使得光源2發(fā)出的光成為平行束并引導(dǎo)得到的束到樣本4、 觀察光學(xué)系統(tǒng)5，用于形成樣本4的圖像、以及目鏡6，用于擴展樣本4的 圖像進(jìn)行眼睛觀察；CCD攝像機8(圖像獲取部分或顯微鏡圖像采集設(shè)備)， 具有圖像傳感器7，用于采集樣本4的顯微鏡圖像；以及計算機80(圖像處 理部分或圖像處理設(shè)備)，具有TV監(jiān)視器，CCD攝像機8通過信號線81 連接到計算機。
光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)
上述光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)可以是正常的反轉(zhuǎn)顯微鏡，其中從光源2開始 以所描述的順序，照明光學(xué)系統(tǒng)1構(gòu)建有會聚透鏡10、偏轉(zhuǎn)鏡12，用于偏 轉(zhuǎn)照明光的光軸ll、以及會聚透鏡14。光源2可以是相干光源，具有可見 范圍內(nèi)的波長，諸如鹵素?zé)?、LED光源、鎢燈、水銀燈等。此夕卜，來自相 干光源的光諸如激光，并通過漫射片等轉(zhuǎn)換成非相干光，還可以用作光源2。 盡管光源的波長通常在可見光范圍內(nèi)，也可以使用紅外光。
觀察光學(xué)系統(tǒng)5構(gòu)建為具有物鏡15，用于形成樣本4的圖像、第一中 繼透鏡16、偏轉(zhuǎn)鏡17，用于偏轉(zhuǎn)來自物鏡15的光以及第二中繼透鏡18， 與第一中繼透鏡16結(jié)合用于將來自物鏡15的圖像(樣本4的圖像)形成到成 像面上。在第二中繼透鏡18和成像面19之間，轉(zhuǎn)換(change over)鏡20可 以安裝為使得任意改變樣本4的圖像在眼睛通過目鏡6觀察和通過CCD攝 像機8觀察之間的觀察路徑。此時，對于轉(zhuǎn)換鏡20，不必使用機械轉(zhuǎn)換的 類型，可以使用半反半透鏡將光路分成兩個。
在上述結(jié)構(gòu)的樣本透射光觀察中，以Koehler照明源照射樣本4，如正 常光學(xué)顯微鏡觀察透射光的情形一樣。因此，來自光源2的光首先通過會 聚透鏡IO變?yōu)槠叫泄馐?，并?dǎo)致照射樣本4，同時在聚光透鏡14的光瞳位 置形成光源2的圖像。隨后，照射樣本4的光通過樣本4進(jìn)入物鏡15以在 成像面19上通過第一中繼透鏡16和第二中繼透鏡18形成樣本圖像，且在 成像面19上得到的樣本4的圖像通過目鏡6被觀察者觀察到。此外，在 CCD攝像機8采集樣本4的圖像時，通過第二中繼透鏡18的光被轉(zhuǎn)換鏡
20反射，并由此樣本4的圖像形成在CCD攝像機8的圖像傳感器7上。 此時，物鏡的放大率可以例如為20倍。
如圖所示，樣本4設(shè)置在樣本臺3上，其中優(yōu)選如圖1B詳細(xì)所示，樣 本4可以和培養(yǎng)基一起放置到樣本容器21中，該容器諸如具有蓋子26的 試驗盤。樣本容器21的底部由具有與用于顯微鏡的0.17mm厚度的光學(xué)透 明蓋玻璃一樣的特性，因此樣本容器21的底部的樣本可以使用正常物鏡觀 察到(此時，樣本容器21不限于這種試驗室盤，以及可以使用載片、微片 等)。此外，為了保持樣本容器21中的潮濕，樣本容器21可以置于水浴22 中，其中通過管嘴23提供純凈水，并且與水浴22—起通過有蓋的關(guān)閉容 器30保持。隨后，如圖1B詳細(xì)所示，通過供氣管24以及來自測量設(shè)備之 外的氣缸25的Co2管嘴84將Co2氣體供給水浴22的上表面。氣缸25中 的氣體例如5%0)2和95%02混合氣體。供應(yīng)Q)2氣體到蓋上的關(guān)閉容器30 的流速是約50mL/min。此外，加熱片27可以設(shè)在樣本容器21下面。該加 熱片27通常以溫度控制器(未示出)通過0.5°C的步幅調(diào)整樣本容器內(nèi)的溫 度。
此外，如隨后所述，為了通過激勵細(xì)胞執(zhí)行產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象的試驗(使得 表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì))，可以設(shè)置自動分配設(shè)備100，作為給細(xì)胞激勵的裝置。 在自動分配設(shè)備100中，泵102從試劑容器101獲得試劑溶液并使用管嘴 103將預(yù)定量的試劑溶液釋放到樣本容器21中。如圖所示，在將樣本容器 21放到蓋上的關(guān)閉容器30中時，優(yōu)選的，在從管嘴103釋放試劑溶液前， 關(guān)閉容器30的蓋31和樣本容器的蓋26通過馬達(dá)(未示出)打開，與自動分 配設(shè)備100協(xié)調(diào)操作，在釋放溶液后，蓋131和樣本容器蓋26通過馬達(dá)關(guān) 閉。此時，在下述的計算機控制下，自動分配設(shè)備100可以在獲取顯微鏡 圖像前后和/或在其間的任意時間操作。
此外，在樣本臺3上，優(yōu)選的，為了任意水平移動樣本臺3(X方向和 Y方向)，兩個步進(jìn)馬達(dá)沐示出)分別安裝為彼此方向分開90。。兩個步進(jìn)馬 達(dá)可以基于計算機90的指令通過樣本臺控制器(未示出)而驅(qū)動，使得自動 控制樣本臺3的定位。
此外，優(yōu)選的，在樣本臺3下的物鏡15周圍，可以安裝物鏡加熱器28 與物鏡15接觸，因此可以在溫度調(diào)節(jié)設(shè)備(未示出)的控制下通過步進(jìn)間隔
0.5°C以物鏡加熱器28調(diào)整物鏡15的溫度，因此物鏡15外部將保持在任 意溫度。同樣，在物鏡加熱器28周圍，配有"Z軸物鏡驅(qū)動機構(gòu)9"，用于 自動沿Z軸(光軸方向)運動物鏡15。 Z軸物鏡驅(qū)動機構(gòu)9通過齒輪齒條機 構(gòu)(未示出)上下移動物鏡15。通過計算機控制的步進(jìn)馬達(dá)(未示出)執(zhí)行齒輪 齒條機構(gòu)旋鈕的旋轉(zhuǎn)操作。或者，Z軸物鏡驅(qū)動機構(gòu)9可以是摩擦輥機構(gòu)。
顯微鏡圖像采集設(shè)備的結(jié)構(gòu)
CCD(電荷耦合器件)攝像機8用于接收樣本4的圖像，其中的圖像傳感 器7可以具有例如1360x1024個像素。在本發(fā)明的設(shè)備中，如下所示，CCD 攝像機8采集通過樣本4的透射光觀察獲得的透射光顯微鏡圖像，和通過 樣本4的發(fā)光觀察獲得的發(fā)光顯微鏡圖像，即觀察由于樣本4中細(xì)胞發(fā)光 現(xiàn)象發(fā)射的微光。因此，CCD攝像機8作為光探測器采集發(fā)光觀察中的微 光，優(yōu)選選擇具有盡可能高靈敏度的探測器。因此，對于CCD攝像機8優(yōu) 選使用致冷CCD，在其底部配備有具有Peltier器件的冷卻系統(tǒng)29，其可以 將攝像機的溫度降低到+5。C到-70。C的范圍內(nèi)，以抑制來自CCD攝像機8 的暗電流。此外，優(yōu)選在CCD攝像機8的光接收面上安裝紅外截濾波器 13，以截止作為背景光的紅外照射。CCD攝像機8采集的圖像通過信號線 81傳送到計算機80并在與其連接的TV監(jiān)視器37上顯示。此夕卜，CCD攝 像機8可以是3板型彩色攝像機，以釆集彩色照明圖像。對于顯微鏡圖像 的圖像采集設(shè)備，例如，可以使用CMOS圖像傳感器、SIT攝像機等。
圖像處理設(shè)備的結(jié)構(gòu)
計算機80可以構(gòu)建為具有CPU的計算機，并可以進(jìn)行任意類型的本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種圖像處理。計算機80控制本發(fā)明的微光測量裝置 的各個部分的操作，以獲取顯微鏡圖像作為圖像數(shù)據(jù)，并且還執(zhí)行從透射 光觀察獲得的照明圖像和從發(fā)光觀察獲得的發(fā)光圖像產(chǎn)生疊加圖像，以及 使用該圖像數(shù)據(jù)的各種處理，諸如使用疊加圖像確定分析區(qū)域。
圖2A表示功能塊形式的計算機80。參照附圖，計算機80包括CPU 35、 存儲器41，用于存儲控制CPU35操作的控制程序、信號處理電路33以及 數(shù)字變焦電路34，用于轉(zhuǎn)換CCD攝像機8采集的圖像為圖像數(shù)據(jù)、顯示
控制電路36和TV監(jiān)視器37，用于顯示CCD攝像機8采集的圖像、記錄 和再現(xiàn)控制電路38以及記錄介質(zhì)39的驅(qū)動器，用于記錄和/或在TV監(jiān)視 器37上顯示CCD攝像機8采集的圖像和/或通過圖像處理獲得的圖像、以 及控制面板40，用于輸入用戶的命令。在控制面板40上，如圖2B所示， 提供各種類型的按鈕，諸如再現(xiàn)按鈕43、記錄按鈕47、快門按鈕44、變焦 放大按鈕42、變焦縮小按鈕143、十字光標(biāo)按鈕45、以及模式開關(guān)48，以 及由此通過與CPU 35連接的控制面板40，將用戶的命令輸入計算機80。
在上述結(jié)構(gòu)中，形成在CCD攝像機8的圖像傳感器7上的樣本4的顯 微鏡圖像通過圖像傳感器轉(zhuǎn)換成模擬電信號，即模擬圖像信號。得到的信 號隨后在CPU 35的控制下傳送到信號處理電路33，其中對于圖像信號執(zhí) 行放大處理、濾波處理和/或如邊緣增強的任何圖像處理。隨后，處理的圖 像信號發(fā)送到數(shù)字變焦電路34(數(shù)字信號處理部分)。數(shù)字變焦電路34對來 自信號處理電路33的模擬圖像信號執(zhí)行A/D轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生數(shù)字圖像信號，并 且在任何數(shù)字處理之后按照需要執(zhí)行諸如gamma校正，得到的數(shù)字圖像信 號傳送到顯示控制電路36，用于在TV監(jiān)視器37上顯示圖像，以及傳送到 記錄和再現(xiàn)控制電路38，用于記錄圖像數(shù)據(jù)到存儲槽(未示出)中的可拆卸 的記錄介質(zhì)39上(例如，存儲卡、硬盤、磁盤、磁光盤等)。此時，本發(fā)明 裝置的數(shù)字變焦電路34設(shè)計為可以剪切整個CCD攝像機8的釆集像素區(qū) 域內(nèi)的任何區(qū)域，并傳送剪切的圖像區(qū)域到顯示控制電路36或記錄和再現(xiàn) 控制電路38，同時以任意放大率將其放大。因此，可以在TV監(jiān)視器37上 僅顯示CCD攝像機8采集的部分被放大的顯微鏡圖像，和/或僅記錄該部 分圖像。
此外，在上述結(jié)構(gòu)中，記錄和再現(xiàn)控制電路38可以設(shè)計為響應(yīng)于來自 CPU 35的再現(xiàn)控制信號讀取當(dāng)前記錄到記錄介質(zhì)39中的數(shù)字圖像信號， 且該讀出數(shù)字圖像信號可以通過顯示控制電路36輸入TV監(jiān)視器37中， 因此可以在TV監(jiān)視器37的屏幕上顯示樣本4的記錄圖像。
操作上述圖像處理設(shè)備時，在用戶打開控制面板上的記錄按鈕47時， 本發(fā)明的裝置執(zhí)行記錄模式，其中CPU 35提供記錄控制信號給記錄和再現(xiàn) 控制電路38。隨后記錄和再現(xiàn)控制電路38響應(yīng)于記錄控制信號記錄從數(shù)字 變焦電路34提供的圖像信號到記錄介質(zhì)中。另一方面，打開再現(xiàn)按鈕43
時，本發(fā)明的裝置開始再現(xiàn)模式，其中CPU35提供再現(xiàn)控制信號給記錄和 再現(xiàn)控制單元38，其在TV監(jiān)視器37上顯示上述記錄的圖像數(shù)據(jù)。此夕卜， 在模式開關(guān)48設(shè)置為圖像采集模式時，來自CPU 35的控制信號就響應(yīng)于 推動快門按鈕44輸出到數(shù)字變焦電路34，且此時來自CCD攝像機8的一 幀圖像就經(jīng)受數(shù)字信號處理并結(jié)合到存儲器41中。隨后，結(jié)合到存儲器41 中的圖像數(shù)據(jù)通過任意壓縮電路進(jìn)行壓縮，并通過卡讀取器/寫入設(shè)備記錄 在存儲卡上。
在數(shù)字變焦電路34上執(zhí)行的CCD攝像機8獲得的整個像素區(qū)域內(nèi)任 意區(qū)域的剪切設(shè)置通過使用變焦放大按鈕42、變焦縮小按鈕143和十字光 標(biāo)按鈕45來執(zhí)行。在圖像區(qū)域的剪切設(shè)置中，在TV監(jiān)視器37上顯示表 示數(shù)字變焦電路34要剪切的圖像區(qū)域的中心的"變焦中心位置"以及圖像區(qū) 域的框。允許用戶操作十字光標(biāo)按鈕45來設(shè)置變焦中心位置在任意位置， 同時觀看TV監(jiān)視器37，并且還允許通過變焦放大按鈕42和變焦縮小按鈕 143來確定要剪切的圖像區(qū)域的尺寸。從剪切過程獲得的圖像的放大率可以 在M= l.OO(CCD攝像機采集的整個區(qū)域)到4.00(CCD攝像機采集的整個區(qū) 域的l/4)的范圍內(nèi)任意設(shè)置。
此時，上述圖像的放大可以通過調(diào)整顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)來進(jìn)行(光學(xué)變 焦)，而不使用數(shù)字變焦電路34。例如，通過步進(jìn)馬達(dá)的馬達(dá)驅(qū)動，沿著光 軸偏移CCD攝像機8和第二中繼透鏡18間的焦距進(jìn)行這種光學(xué)變焦。此 外，在執(zhí)行光學(xué)變焦的透鏡結(jié)構(gòu)中(變焦透鏡)，使用三個可變放大率的透鏡 組、執(zhí)行像差補償?shù)难a償透鏡組等、以及執(zhí)行對焦調(diào)整的會聚透鏡(未示出)， 透鏡的焦距可以分10步手動或自動變化?？梢詧?zhí)行驅(qū)動變焦透鏡，使得安 裝在變焦透鏡周圍的變焦馬達(dá)(超聲波馬達(dá))基于CPU 35輸出的控制信號而 操作，以沿著光軸移動變焦透鏡。
此外，為了控制自動分配設(shè)備100和照射設(shè)備82(包括光源2)的操作， 計算機80可以連接到這些設(shè)備從而獲得CCD攝像機8采集的圖像信號可 以與通過自動分配設(shè)備100的分配操作的執(zhí)行同步進(jìn)行。
通過第一實施例的裝置對樣本的觀察和測量
如上所述，在發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光現(xiàn)象測量中，其發(fā)光強度很弱，因此
很難用CCD攝像機探測光信號，且通常不能觀察到細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此， 不可以像顯微鏡正常的觀察中一樣，調(diào)整物鏡的焦點同時檢查樣本中觀察 的細(xì)胞。因此，發(fā)光觀察中物鏡的焦點位置基于用顯微鏡透射光觀察中獲 得的樣本照明圖像而確定，其中用來自諸如鹵素?zé)舻墓庠吹墓馔ㄟ^照明光
學(xué)系統(tǒng)照射樣本。例如，通過設(shè)置物鏡的焦點位置為在增加生物發(fā)光蛋 白質(zhì)發(fā)光強度的時候，物鏡在透射光觀察中獲得高對比度圖像的位置和在
CCD攝像機上獲得匯聚的清楚的發(fā)光圖像的位置之間的光軸上的近似中間 位置。此后，將說明使用上述本發(fā)明的裝置對發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光進(jìn)行成像 的成像方法。
圖3以流程圖示出本發(fā)明發(fā)光成像的方法中的處理過程。參照附圖， 首先，樣本4(細(xì)胞等)和培養(yǎng)溶液放入試驗盤中(樣本容器21)，其隨后設(shè)置 在裝置中(步驟l)，且打開照明光(步驟2)。隨后，在CCD攝像機8的圖像 傳感器7的光接收面上形成通過物鏡15的樣本4的顯微鏡圖像，且用來自 圖像傳感器7的信號獲得樣本的照明圖像(步驟3)。下面，在獲得的照明圖 像上指定所需區(qū)域，即具有適當(dāng)細(xì)胞密度的區(qū)域(步驟4)。此后，臺移動以 偏移具有適當(dāng)細(xì)胞密度的指定區(qū)域到視場的中心(步驟5)。隨后，照明圖像 的數(shù)據(jù)存儲到存儲設(shè)備中(步驟6)，且關(guān)閉照明(步驟7)，并且隨后完成第 一照明圖像的獲取。
下面，為了在樣本的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)，以激勵細(xì)胞的裝置來激 勵細(xì)胞。激勵細(xì)胞的試劑可以通過自動分配設(shè)備提供(步驟8)。此時，在臺 上，在步驟8之后完成照射步驟，且得到的照明圖像數(shù)據(jù)可以保存到存儲 器件中(步驟9)。隨后，不通過照射，獲得發(fā)光信號(步驟IO)并保存到存儲 器件中(步驟11)，且由此完成第一發(fā)光圖像的獲取。隨后，對于獲取發(fā)光 圖像重復(fù)步驟10和步驟11直到預(yù)定時間、預(yù)定發(fā)光強度或完成了預(yù)定次 數(shù)上述過程的執(zhí)行。此時，可以以這樣的方式執(zhí)行這些處理，其中照明圖 像獲取和發(fā)光圖像獲取成對，或者，每執(zhí)行預(yù)定次數(shù)的發(fā)光圖像獲取，執(zhí) 行一次照明圖像獲取。對于細(xì)胞的活性、測量的條件等以適當(dāng)?shù)姆绞綀?zhí)行 這些圖像獲取。
在完成照明圖像和發(fā)光圖像獲取之后，產(chǎn)生照明圖像和發(fā)光圖像的疊 加圖像并在圖像處理設(shè)備(計算機80)中顯示(步驟12)。通過參照得到的照
明圖像和發(fā)光圖像的顯示的疊加圖像可以確定發(fā)光細(xì)胞，并且因此，即使 在測量期間移動了也可以容易地指定某些細(xì)胞。
下面，判斷在疊加圖像內(nèi)是否可以分辨細(xì)胞內(nèi)發(fā)光位置，以及如果可 以分辨發(fā)光位置(步驟13:是)，指定測量區(qū)域(步驟15)。測量區(qū)域可以通 過任意裝置在監(jiān)視器上指定，諸如鼠標(biāo)、光標(biāo)或指針等，其可以通過手動 操作或通過執(zhí)行其中閾值進(jìn)行各種改變的圖像處理來限定屏幕上的區(qū)域。 例如， 一個細(xì)胞可以指定為一個測量區(qū)域，且細(xì)胞的一部分也可以指定為 一個測量區(qū)域。
另一方面，在很難分辨細(xì)胞中發(fā)光位置的時候(步驟13:否)，就在以
偽彩色顯示CCD攝像機的輸出之后指定測量區(qū)域(步驟14)，因此將發(fā)光繪 制為容易可見(步驟15)。此時，例如， 一個細(xì)胞可以指定為一個測量區(qū)域， 并且細(xì)胞內(nèi)的部分還可以指定為一個測量區(qū)域。此時，不僅可以在激勵如 細(xì)胞的分析對象之前指定區(qū)域，還可以在之后進(jìn)行，并且，基于激勵之后 獲得的發(fā)光圖像或照明圖像，要測量的區(qū)域可以偏移到存在可以進(jìn)行適當(dāng) 測量的對象的區(qū)域。如果一區(qū)域在選擇激勵的時候沒有很微弱或很小的發(fā) 光，要測量的區(qū)域就可以改變到其中可以探測到適當(dāng)發(fā)光的區(qū)域?；蛘?， 在激勵的時候具有微弱或沒有發(fā)光的所分析細(xì)胞中，響應(yīng)于激勵增加發(fā)光 量的細(xì)胞可以被指定為要分析的對象，并且隨后，可以選擇性地跟蹤探測 的對象用于數(shù)據(jù)獲取和分析。
此外，隨時間變化的發(fā)光強度可以以動畫形式顯示，或數(shù)字化并以圖 表形式顯示(步驟16)。這樣，最后執(zhí)行分析(步驟17)。詳細(xì)的說，使用得 到的數(shù)據(jù)，執(zhí)行比較每個細(xì)胞的發(fā)光強度、比較一個相同的細(xì)胞內(nèi)各個位 置的發(fā)光強度、確定細(xì)胞的發(fā)光模式、比較發(fā)光模式隨時間的變化等。從 這些結(jié)果，可以分析細(xì)胞對于試劑、電、氣體和熱激勵的反應(yīng)。此外，還 可以在不執(zhí)行激勵的時候分析細(xì)胞的活動。
根據(jù)本發(fā)明的使用，例如，如圖4所示，在觀察發(fā)光強度周期性變化 的樣本時，即使發(fā)光消失也可以觀察所需細(xì)胞發(fā)光強度的變化，而不錯過 在發(fā)光消失前和后所關(guān)心的細(xì)胞，因此，可以指定某些細(xì)胞并連續(xù)追蹤其 發(fā)光強度。
本發(fā)明裝置的第二實施例
圖5示意性地示出本發(fā)明裝置的第二實施例，其中將執(zhí)行熒光觀察的 結(jié)構(gòu)進(jìn)一步添加到本發(fā)明第一實施例的圖1所示的微光測量裝置中。
參照附圖，在本發(fā)明第二實施例的裝置中，其中與第一實施例的裝置 類似，數(shù)字變焦和/或光學(xué)變焦同時執(zhí)行，用于激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)49被添 加到其中，并且將觀察光學(xué)系統(tǒng)5修改為使得來自樣本4的熒光被引導(dǎo)到 CCD攝像機中。
用于激發(fā)的光學(xué)系統(tǒng)49構(gòu)建有激發(fā)光源50、準(zhǔn)直透鏡51、偏轉(zhuǎn)鏡52 以及可切換二向色鏡53。激發(fā)光源50通常是氬激光器，具有10mW的輸 出功率和488nm的波長。此時，激發(fā)光源50可以是可見范圍內(nèi)的氣體激 光器，諸如氦氖激光器。激光通過準(zhǔn)直透鏡51轉(zhuǎn)換成圓形平行束，具有特 定束寬，在偏轉(zhuǎn)鏡52上反射，并進(jìn)入安裝在觀察光學(xué)系統(tǒng)5中的可切換二 向色鏡58。
可切換二向色鏡58具有反射激發(fā)光源50的激光波長的光并透過樣本4 的熒光和發(fā)光信號的譜的譜特征。因此，進(jìn)入觀察光學(xué)系統(tǒng)5的激光在可 切換二向色鏡53上反射，并隨后從其底部進(jìn)入物鏡15，朝向樣本容器21 中的樣本4匯聚并激發(fā)樣本4中的熒光分子。此時，可切換二向色鏡58安 置在保持器中(未示出)，并且根據(jù)激發(fā)激光的波長波動而可交換地安裝。此 外，如果不需要改變激發(fā)光源50的波長，可以安裝常規(guī)的二向色鏡替換使 用可切換的二向色鏡58。
對于物鏡15，可以使用具有高NA(數(shù)值孔徑)，例如0.9或1.0或更高 的浸液型物鏡。在從樣本4發(fā)出并且進(jìn)入物鏡15的熒光信號和發(fā)光信號穿 過裝置的觀察光學(xué)系統(tǒng)5時，這些信號穿過可切換二向色鏡58，前進(jìn)到第 一中繼透鏡16和第二中繼透鏡18，并在切換鏡20上反射，并最終在CCD 攝像機8的圖像傳感器7的光接收面上形成各圖像。隨后，在第一實施例 的裝置中，來自CCD攝像機8的光信號被發(fā)送到計算機80，其中顯示并 分析該發(fā)光圖像，執(zhí)行發(fā)光強度隨時間的測量和信號分析等，且得到的分 析結(jié)果在計算機80的TV監(jiān)視器37的屏幕上顯示。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方式進(jìn)行熒光觀察。例如熒光觀察中使 用的熒光染料可以是羅達(dá)明綠(RhG); TMR(四甲基異硫氰酸羅達(dá)明)和
5-Tamra(5-羧基四甲基異硫氰酸羅達(dá)明)。為了激發(fā)TMR和5-Tamra等，波 長514.5nm的氬激光器和波長543.5nm的氦氖激光器等可以用來分別激發(fā) 激光源。此外，F(xiàn)ITC(熒光素異硫氰酸酯)，TOTOl，吖啶橙、得克薩斯紅 等可以用作熒光染料。
本發(fā)明裝置的第三實施例
圖6示出本發(fā)明的微光測量裝置的另一個實施例的示意圖，其可以進(jìn) 行數(shù)字變焦或光學(xué)變焦，以及如圖5裝置一樣同時進(jìn)行測量熒光和生物發(fā) 光。
參照附圖，在實施例中，測量設(shè)備本身即光學(xué)顯微鏡封閉在隔光盒54 中，其中隔光盒54的底部通過障礙物56固定在底盤55上，且由此該盒設(shè) 計為防止外部光進(jìn)入觀察光學(xué)系統(tǒng)5。在隔光盒54的上表面，安裝分離的 阻光蓋57，且阻光蓋57的一端通過鉸鏈58連接到隔光盒54的主體上，使 得可以旋轉(zhuǎn)開關(guān)該阻光蓋57。
為了獲取照明圖像，例如來自如鹵素?zé)簟⒔饘冫u化物燈等的光源2的 用于照明的光通過光纖60被引入以照明樣本臺3上樣本容器21的上表面， 并照射整個樣本4。此外，為了獲取熒光圖像，將激光(激發(fā))光源50安裝 在裝置主體外的光源盒62上，且從激光光源50激發(fā)出的激光通過外框架 上的激光入射開口 64進(jìn)入該裝置的主體。激光例如可以是具有10mW輸出 和488nm波長的氬激光。通過激光入射開口 64進(jìn)入裝置體的激光首先進(jìn) 入觀察光學(xué)系統(tǒng)，在可切換二向色鏡53上反射，從其底部進(jìn)入物鏡15，并 向樣本4匯聚以將其照明?？汕袚Q二向色鏡53安裝在保持器上且根據(jù)激發(fā) 激光的波長振蕩而可交換地安裝。
用緊固銷將樣本容器21固定在XY樣本臺3上。XY樣本臺3設(shè)計為 使得其在XY平面上的位置可以通過齒輪-齒條機構(gòu)在XY平面上任意移動。 安裝在樣本容器21之下的物鏡15裝有在Z軸上驅(qū)動物鏡的機構(gòu)9，以使 其可以沿著光軸(Z軸)移動。通過引線，Z軸物鏡驅(qū)動機構(gòu)9與微光測量裝 置之外安裝的焦點探測部分77通信并受其控制。
在觀察光學(xué)系統(tǒng)5中，物鏡15收集的信號光穿過可切換二向色鏡53， 并隨后不受偏轉(zhuǎn)，如上述第一和第二實施例所示，信號光通過安裝在鏡桶66下部的透鏡67并匯聚到CCD攝像機8的光接收面上。透鏡67位于用 緊固銷安裝在底盤55的基座75上的鏡桶66的下部，且在基座75上，CCD 攝像機8設(shè)置為使得透鏡67的Z軸的焦點位置與光接收面的近似中心一 致。攜帶樣本臺3且物鏡15安裝其上的主體座76通過固定在底盤55上的 柱73安裝，相對于鏡桶的上下部分72和66上下移動。此時，可選的，可 以提供物鏡焦點探測部分70，其連接到位置探測部分71，因此來自位置探 測部分71的輸出信號可以輸出到TV監(jiān)視器37。
對于CCD攝像機8，由于來自樣本的光微弱，優(yōu)選使用具有盡可能高 靈敏度的攝像機，如第一和第二實施例中一樣。CCD攝像機8的像素數(shù)量 可以是例如1360xl024。為了抑制來自CCD攝像機8的暗電流，包括Peltier 器件的致冷系統(tǒng)29配備在CCD攝像機的底部以降低并保持CCD攝像機8 的溫度在0。C附近。CCD攝像機8的光接收面上，設(shè)置紅外截濾波器13， 以截止可以是背景光的紅外光。然而，將紅外光作為信號光的時候，在測 量之前從鏡桶66的下部去除紅外截濾波器13。 CCD攝像機8的輸出部分 連接到信號線69，并且由此將來自CCD攝像機的樣本圖像通過信號處理 部分74傳送到計算機80，并在TV監(jiān)視器37上顯示。3片型彩色攝像機 可以用作CCD攝像機8，因此可以獲得彩色的照明圖像。
操作中，首先基于光源2照射的樣本4的照明圖像，物鏡的焦點調(diào)節(jié) 到樣本上。為此，通過Z軸物鏡驅(qū)動機構(gòu)將物鏡15沿著光軸移動足夠量， 并且在其每個移動步驟中，通過信號處理部分74分析來自CCD攝像機8 的光學(xué)輸出信號，用于探測物鏡15在光軸上的位置，其中獲得高對比度的 圖像。隨后，找到提供高對比度圖像的物鏡15在光軸上的上側(cè)和下側(cè)的兩 個位置，并且通過信號處理部分74的計算，將上下位置間的近似中間位置 確定為發(fā)光觀察的焦點位置。此后，通過操作Z軸物鏡驅(qū)動機構(gòu)9，移動 物鏡15并固定到得到的焦點位置，并且此后，樣本4射出的熒光信號和發(fā) 光信號用CCD攝像機8接收。
在Z軸物鏡驅(qū)動機構(gòu)9中，可交換地安裝多個物鏡15。在具有大放大 率的物鏡15用于觀察細(xì)胞等時，移動樣本4中的培養(yǎng)基，由于較小的視野， 在一些情況下就可以使得細(xì)胞等的樣本4移到視野之外。因此，優(yōu)選的， 樣本4首先用具有低放大率的物鏡15觀察，諸如xl0和x20，且在確認(rèn)并
利用鼠標(biāo)和鍵盤指定樣本4的所需位置之后，通過本發(fā)明裝置中的放大功 能擴大圖像。此時，計算機可以用作信號處理部分74。
為了研究本發(fā)明的用途，進(jìn)行下面的試驗。此時，應(yīng)該理解下面的例 子用于說明本發(fā)明的用處且不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。
例子l
在例子1中，使用微光測量裝置，其中圖1中的該測量裝置提供有自 動分配設(shè)備100，在引入熒光素酶基因的多個Hela細(xì)胞中的某些細(xì)胞中， 臨時觀察到試劑激勵導(dǎo)致的發(fā)光。
對于樣本來說，使用其中載體"pcDNA6/TR(從In vitro gene co.獲得)" 持續(xù)表達(dá)四環(huán)素阻遏物(TetR)的Hela細(xì)胞，以及包括與具有已經(jīng)被轉(zhuǎn)基因 的四環(huán)素操縱子(Tet02)的表達(dá)載體"pcDNA4/TO(從In vitro gene co.獲得)" 相連的熒光素酶基因的質(zhì)體。在引入這兩種基因的細(xì)胞中，如圖7A示意所 示，TetRs首先以載體(pcDNA6/TR)表達(dá)為TetR，且TetRs形成同型二聚體， 其與Tet02基因區(qū)結(jié)合，由此抑制與Tet02區(qū)連接的熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。 然而，如圖7B所示，將四環(huán)素給與細(xì)胞時(試劑激勵)，導(dǎo)致TetR同型二 聚體的構(gòu)造改變，導(dǎo)致TetR同型二聚體從Tet02區(qū)分開，因此將導(dǎo)致熒光 素酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)熒光素酶蛋白質(zhì)。因此，在此試驗例子中，導(dǎo)入上 述基因的細(xì)胞中，觀察到四環(huán)素激勵使得表達(dá)熒光素酶和細(xì)胞內(nèi)的發(fā)光現(xiàn) 象。
在圖1的裝置中，對于物鏡15來說，使用Olympus UApo/340(20x， N.A. 0.75)以及顯微鏡的商用物鏡"Oil， 20x， N.A.0.8"或"5x， N.A.0.13"。對于 CCD攝像機8，使用5° C致冷的顯微鏡攝像機"DP30BW(Olympus)"。在 此CCD攝像機中，CCD元件(對應(yīng)于圖像傳感器7)為2/3英寸的類型，其 像素數(shù)量為1360x1024，且每個像素的尺寸為6平方nm。從物鏡穿過成像 透鏡(中繼透鏡)并在CCD元件上形成的樣本圖像的總放大率設(shè)置為4倍。 在觀察和對Hela細(xì)胞成像期間，整個裝置被暗箱覆蓋。
在下面的過程中執(zhí)行上述試驗操作。
(l)制備Hda細(xì)胞樣本，其中共同表達(dá)始終表達(dá)TetR的載體和包括與 Tet02的表達(dá)載體相連的熒光素酶基因的質(zhì)體。對于培養(yǎng)基，可以使用包含
10mMHEPES，具有l(wèi)mM熒光素酶的D-MEM介質(zhì)。
(2) 下面，(l)中的樣本用作樣本，且采集照明圖像和發(fā)光圖像。 一直配 對采集照明圖像和發(fā)光圖像。 一次圖像獲取的曝光時間(在CCD攝像機上 信號的積分時間)對照明圖像設(shè)置為10msec，對發(fā)光圖像設(shè)置為5min。
(3) 隨后將四環(huán)素加入樣本以導(dǎo)致其中的熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄，并且在添 加四環(huán)素之后立即如過程(2)所示成對采集樣本的照明圖像和發(fā)光圖像。
(4) 隨后，如圖8所示，過程(2)的采集圖像以10min的間隔重復(fù)約10 小時。采集圖像的過程通過計算機處理自動執(zhí)行，其中在本發(fā)明的裝置中， CCD攝像機獲得的光信號自動轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。
(5) 在完成圖像獲取之后，獲取的照明圖像和發(fā)光圖像被疊加以確定表 達(dá)熒光素酶的Hela細(xì)胞。隨后，表達(dá)熒光素酶的Hela細(xì)胞隨時間變化的 發(fā)光強度被數(shù)字化并進(jìn)行分析。在疊加圖像上很難確定Hela細(xì)胞的發(fā)光位 置時，以偽彩色顯示CCD攝像機8的輸出值，為了可以通過人眼容易地識 別發(fā)光位置。
圖9A、 9B和9C分別示出照明圖像、發(fā)光圖像和疊加圖像。圖10示 出ROI-l和ROI-2區(qū)域中兩個細(xì)胞中發(fā)光強度隨時間的變化，每個區(qū)域都 環(huán)繞在圖9C的以上述方式獲得的疊加圖像的方框中。因此，已經(jīng)示出，根 據(jù)本發(fā)明，可以確定哪個細(xì)胞發(fā)光并測量其發(fā)光隨時間的變化。
例子2
在例子2中，使用與例子l中一樣的裝置，執(zhí)行發(fā)光細(xì)菌(P.發(fā)光菌)的 發(fā)光觀察，且監(jiān)視細(xì)胞中試劑激勵的發(fā)光強度隨時間的變化。發(fā)光細(xì)菌是 活動的，發(fā)光生物體以下面的形式廣泛存在自然中，(i)海水中的獨立活生 物體，(ii)與魚或頭足類動物的發(fā)光器官共生，(iii)死魚、動物尸體中的增殖， (iv)咸水魚消化道中或烏賊表皮上的習(xí)慣性寄生，且該細(xì)菌連續(xù)顯示出強的 發(fā)光，足以在氧氣條件下通過眼睛觀察。
觀察中，將Olympus UApo/340(40x， N.A. 1.35)或Oil Iris "Oil, 40x， N.A. 1.35"用作物鏡15。其他采集圖像的條件與例子1中一樣。
試驗操作以下面的過程執(zhí)行。
(l)發(fā)光細(xì)菌，作為共生生物體存在于螢魷(fireflysquid)的發(fā)光器官內(nèi)，
其被隔絕開并在包括3%NaCl的LB培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。將甘油添加到此培養(yǎng)基 內(nèi)以獲得25。/。的甘油溶液(v/v)為最終濃度。
(2) 將(1)中的樣本用作樣本，且采集照明圖像(觀察圖像)和發(fā)光圖像。 照明圖像和發(fā)光圖像始終成對采集。 一次圖像獲取的曝光時間(在CCD攝 像機上信號的積分時間)對照明圖像設(shè)置為10msec，對發(fā)光圖像設(shè)置為 lmin。
(3) 隨后使用自動分配設(shè)備100，將氨比西林添加到樣本中，禁止發(fā)光 細(xì)菌中的細(xì)胞壁合成。由此，抑制發(fā)光細(xì)菌的增殖，使得細(xì)菌滅絕。這樣 執(zhí)行添加氨比西林，其中自動分配設(shè)備100的操作與圖像采集同步，其中 在添加氨比西林之后立即執(zhí)行采集圖像，其中照明圖像和發(fā)光圖像成對采集。
(4) 隨后，上述過程(2)描述的圖像采集以5min的間隔重復(fù)直到添加氨 比西林之后經(jīng)過1小時。采集圖像的過程通過計算機處理自動執(zhí)行，其中 在本發(fā)明的裝置中，CCD攝像機獲得的光信號自動轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。
(5) 在完成圖像獲取之后，獲取的照明圖像和發(fā)光圖像被疊加以從中確 定強的發(fā)光細(xì)菌。隨后，以采集各個圖像的時間順序排列疊加圖像以形成 動畫，且追蹤伴隨著發(fā)光細(xì)菌運動的發(fā)光位置的改變，且數(shù)字化和分析發(fā) 光細(xì)菌的發(fā)光隨時間的改變。此時，用計算機處理自動執(zhí)行發(fā)光細(xì)菌的跟
蹤o
圖11A、 11B和11C分別示出照明圖像、發(fā)光圖像和疊加圖像(表達(dá)為 偽彩色)。圖12示出圖11C中PP-1區(qū)域中發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強度隨時間的變 化。根據(jù)例子2，已經(jīng)示出，即使在諸如細(xì)菌的微生物體在測量期間運動， 也可以確定哪個微生物體發(fā)光以及測量其發(fā)光隨時間的變化。
例子3
在例子3中，執(zhí)行發(fā)光細(xì)菌(V.tischeri)的發(fā)光觀察，其中跟蹤發(fā)光細(xì)菌 的位置和發(fā)光強度隨時間的變化。采集圖像的條件與例子2中一樣。 試驗操作以下列步驟進(jìn)行。
(l)發(fā)光細(xì)菌，在包括3%NaCl的瓊脂LB培養(yǎng)基盤內(nèi)培養(yǎng)，這里將發(fā) 光強度高的群體分類并懸浮在包括3%NaCl的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)。
(2) 將(1)中的樣本用作樣本，且采集照明圖像(觀察圖像)和發(fā)光圖像。 照明圖像和發(fā)光圖像始終成對釆集。 一次圖像獲取的曝光時間(在CCD攝 像機上信號的積分時間)對照明圖像設(shè)置為5msec，對發(fā)光圖像設(shè)置為3min。
(3) 隨后，重復(fù)上述過程(2)描述的圖像采集。采集圖像的過程通過計算 機處理自動執(zhí)行，其中在本發(fā)明的裝置中，從CCD攝像機獲得的光信號自 動轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。
(4) 在完成圖像采集之后，獲取的照明圖像和發(fā)光圖像被疊加。由于發(fā) 光細(xì)菌隨時間變化運動，就以采集各個圖像的時間順序排列疊加的圖像以 形成動畫，且追蹤伴隨著發(fā)光細(xì)菌(V.t.)運動的發(fā)光位置的改變，且數(shù)字化 和分析發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光隨時間的改變。此時，可以用計算機處理自動執(zhí)行 發(fā)光細(xì)菌的跟蹤。
圖13A、 13B和13C分別示出照明圖像、發(fā)光圖像和疊加圖像，且圖 14示出發(fā)光細(xì)菌隨時間變化移動。圖15示出發(fā)光細(xì)菌(V.t.)發(fā)光強度隨時 間變化。如例子3所示，即使在諸如細(xì)菌的微生物體在測量期間運動，本 發(fā)明也可以測量指定的發(fā)光部分隨時間變化的發(fā)光。如所示，僅通過跟蹤 動態(tài)主體，而與有無激勵無關(guān)，例如行為性和/或細(xì)胞學(xué)分析(增殖活動等) 都是可行的。此外，由于可以跟蹤細(xì)菌的動態(tài)條件，就可以測量樣本中發(fā) 光區(qū)域的運動，而與有無激勵無關(guān)。
盡管對于具體實施例詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來 說，在本發(fā)明的范圍其他的各種可行的實施例也是顯而易見的。
權(quán)利要求
1、一種使用光學(xué)成像設(shè)備獲取生物源樣本圖像的裝置，包括照明部分，用于照明該樣本；照明圖像獲取部分，用于獲取該樣本的照明圖像；發(fā)光圖像獲取部分，用于獲取該樣本中細(xì)胞的發(fā)光圖像；圖像處理部分，用于疊加該照明圖像和該發(fā)光圖像以產(chǎn)生疊加圖像，并確定該疊加圖像中的分析區(qū)域。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該光學(xué)成像設(shè)備是光學(xué)顯微 鏡；該照明圖像是在該光學(xué)顯微鏡下利用該照明部分的照明光在透射光觀 察中獲得的透射光顯微鏡圖像，且該發(fā)光圖像是在該光學(xué)顯微鏡下觀察該 細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光而獲得的發(fā)光顯微鏡圖像；其中該照明圖像獲取 部分和該發(fā)光圖像獲取部分包括共用顯微鏡圖像采集設(shè)備，其采集該透射 光顯微鏡圖像和該發(fā)光顯微鏡圖像。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2的裝置，其特征在于，該顯微鏡圖像采集設(shè)備具有 光接收面，且該光學(xué)顯微鏡包括在該顯微鏡圖像采集設(shè)備的光接收面上形 成該樣本的圖像的物鏡和透鏡組件，其中該物鏡的數(shù)值孔徑與投射在該光 接收面上的該樣本圖像的放大率之間比率的平方值為0.01或更大。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該裝置包括熒光圖像獲取部 分，用于獲取該細(xì)胞的熒光圖像。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4的裝置，其特征在于，該光學(xué)成像設(shè)備是光學(xué)顯微 鏡；該熒光圖像是在該光學(xué)顯微鏡下的樣本熒光觀察中獲得的熒光顯微鏡 圖像，且該發(fā)光圖像是在該光學(xué)顯微鏡下觀察該細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光 而獲得的發(fā)光顯微鏡圖像；其中該熒光圖像獲取部分和該發(fā)光圖像獲取部 分包括共用顯微鏡圖像采集設(shè)備，其采集該熒光顯微鏡圖像和該發(fā)光顯微 鏡圖像。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該裝置包括顯示部分，用于 顯示該疊加圖像。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該裝置包括記錄部分，用于 記錄該疊加圖像。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l的裝置，其特征在于，該裝置包括細(xì)胞激勵供給部 分，用于激勵細(xì)胞。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8的裝置，其特征在于，該細(xì)胞激勵供給部分是從包 括以下部分的組中選出的至少一個試劑供給部分，用于給該細(xì)胞提供試 劑；溫度調(diào)節(jié)部分，用于調(diào)節(jié)該樣本的溫度；以及氣體供給部分，用于給 該細(xì)胞提供氣體。
10、 一種利用光學(xué)成像設(shè)備獲取生物源樣本圖像的方法，其特征在于 該方法包括下面的步驟照明該樣本并獲取其照明圖像；不照明樣本而獲取該樣本中的細(xì)胞的發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光的發(fā)光圖像； 疊加該照明圖像和該發(fā)光圖像以產(chǎn)生疊加圖像；以及 確定該疊加圖像中的分析區(qū)域。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括顯示該疊加圖 像的步驟。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括記錄該疊加圖 像的步驟。
13、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，執(zhí)行兩次或更多次照明該 樣本和獲取該照明圖像的步驟。
14、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括在獲取該照 明圖像和該發(fā)光圖像的步驟之前的給該細(xì)胞激勵的步驟。
15、 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于，該方法包括在給該細(xì)胞 激勵的歩驟之前的獲取該照明圖像和該發(fā)光圖像的步驟。
16、 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其特征在于，在給該細(xì)胞激勵的步驟中給該細(xì)胞的激勵是從包括以下激勵的組中選出的至少一個激勵試劑激勵；電激勵、通過氣體的激勵和通過熱的激勵。
17、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，還包括步驟測量該發(fā)光圖像中與該分析區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域中的光強，并顯示該光強的變化。
18、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括獲取該樣本中細(xì)胞的熒光圖像的步驟。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其特征在于，該方法包括這樣的步驟顯示該照明圖像中與該分析區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域、該發(fā)光圖像中與該分析區(qū)域 對應(yīng)的區(qū)域、和該熒光圖像中與該分析區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域中的至少兩個區(qū)域。
20、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該光學(xué)成像設(shè)備是光學(xué)顯 微鏡；該照明圖像是在該光學(xué)顯微鏡下的透射光觀察中獲得的透射光顯微鏡圖像，且該發(fā)光圖像是在該光學(xué)顯微鏡下觀察該細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的光而獲得的發(fā)光顯微鏡圖像；其中該透射光顯微鏡圖像和該發(fā)光顯微鏡圖 像通過共用顯微鏡圖像采集設(shè)備而采集。
21、 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其特征在于，該顯微鏡圖像采集設(shè)備具 有光接收面，且該光學(xué)顯微鏡包括在該顯微鏡圖像采集設(shè)備的光接收面上 形成該樣本的圖像的物鏡和透鏡組件，其中該物鏡的數(shù)值孔徑與投射在該 光接收面上的該樣本圖像的放大率之間比率的平方值為0.01或更大。
22、 一種獲取生物源樣本圖像的裝置，該裝置包括光學(xué)顯微鏡；顯微 鏡圖像采集設(shè)備，用于采集該光學(xué)顯微鏡觀察的該樣本的顯微鏡圖像；以 及圖像處理設(shè)備，用于獲得該顯微鏡圖像作為圖像數(shù)據(jù)并執(zhí)行圖像處理， 其中，該圖像處理設(shè)備包括圖像疊加部分，用于通過疊加透射光圖像和發(fā) 光圖像產(chǎn)生疊加圖像，其中在該光學(xué)顯微鏡下用該顯微鏡圖像采集設(shè)備在 該樣本的透射光觀察中采集該樣本的圖像而獲得該透射光圖像，以及在該 光學(xué)顯微鏡下用該顯微鏡圖像采集設(shè)備對該樣本中細(xì)胞內(nèi)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)出的 光進(jìn)行采集而獲得該發(fā)光圖像；還包括圖像區(qū)域指定部分，用于指定該疊 加圖像中的分析區(qū)域。
23、 根據(jù)權(quán)利要求22的裝置，其特征在于，該顯微鏡圖像采集設(shè)備具 有光接收面，且該光學(xué)顯微鏡包括物鏡和透鏡組件，用于在該顯微鏡圖像 采集設(shè)備的光接收面上形成該樣本的圖像，其中該物鏡的數(shù)值孔徑與在該 光接收面上投影的該樣本圖像的放大率之間比率的平方值為0.01或更高。
全文摘要
提供了一種使用光學(xué)成像設(shè)備對生物源的樣本的發(fā)光現(xiàn)象成像的新裝置和新方法。在本發(fā)明的裝置和方法中，對通過照明樣本獲得的照明圖像和不照明樣本而對樣本中細(xì)胞的發(fā)光現(xiàn)象發(fā)射的光獲取的發(fā)光圖像進(jìn)行疊加，以產(chǎn)生疊加圖像。在疊加圖像中，確定分析區(qū)域。由此，即使在發(fā)光觀察中探測的光很微弱的時候，也可以指定樣本的細(xì)胞中發(fā)光細(xì)胞和/或發(fā)光位置。
文檔編號G01N21/64GK101351735SQ20068004954
公開日2009年1月21日 申請日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月27日
發(fā)明者福岡莊尚, 秋吉龍?zhí)? 鈴木浩文 申請人:奧林巴斯株式會社