專利名稱：：表達熒光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法相關(guān)申請本申請是1999年，11月19日遞交的美國專利申請編號09/444,335的部分繼續(xù)申請，該申請的全部內(nèi)容引入作為參考。神經(jīng)干和祖先細胞通常是從發(fā)育中的或成人的腦中得到的，并作為細胞培養(yǎng)物長時期培養(yǎng)?？梢澡b定，分離和擴展表達某些標記，例如nestin的集落。但是，從這一方法獲得的細胞在培養(yǎng)中經(jīng)過了重復(fù)傳代，不再是最初收獲的細胞。原初細胞的特征特性可能丟失。例如，在體外培養(yǎng)中的時間延長可能導(dǎo)致產(chǎn)生的祖先細胞，盡管仍然沒有完全分化成神經(jīng)細胞(神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞，等等)，但已經(jīng)丟失了真正的多能神經(jīng)干細胞特征。另外，上面的技術(shù)不允許分離保留區(qū)域特異性并表達特異于一個或另一個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的區(qū)域的標記，而同時保留他們產(chǎn)生各種類型的分化細胞的能力的多能早期祖先細胞。所以，能夠直接從動物或胚胎分離干和祖先細胞而不需要延長體外培養(yǎng)的方法是存在需要的。本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)在多能干和祖先細胞中表達熒光蛋白質(zhì)的非人祖先哺乳動物的方法。該方法包括在非人哺乳動物受精卵中導(dǎo)入含有與編碼熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，熒光蛋白質(zhì)是在非人哺乳動物的多能干和祖先細胞中表達的。將含有包括哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA的受精卵導(dǎo)入允許產(chǎn)生子代的同一種類的非人哺乳動物中，調(diào)節(jié)序列與編碼熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接。子代是非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。該方法進一步包括從上面得到的非轉(zhuǎn)基因哺乳動物中選擇多能干和祖先細胞表達熒光基因的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物子代。另外，本發(fā)明涉及表達構(gòu)建體或載體，和含有它的細胞。表達構(gòu)建體包括啟動子序列，編碼綠熒光的蛋白質(zhì)的基因和存在于哺乳動物nestin基因的第二個內(nèi)含子中的調(diào)節(jié)序列。在優(yōu)選的實施方案中，啟動子是nestin基因的啟動子。本發(fā)明也涉及本發(fā)明也涉及測定動物器官或其區(qū)域中的多能干和祖先細胞群體的方法。該方法包括測量發(fā)熒光的來自非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的器官或其區(qū)域的細胞，非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物在它的基因組中整合了含有與編碼熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中的多能干細胞和祖先細胞中表達的。發(fā)熒光的細胞是多能干細胞和祖先細胞。本發(fā)明同時涉及的是得到原初的，非培養(yǎng)的多能干細胞的方法，包括從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎分離表達標記/報道分子蛋白質(zhì)(例如，熒光蛋白質(zhì))的細胞，非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物已經(jīng)在它的基因組中整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，調(diào)節(jié)序列與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)(例如，熒光蛋白質(zhì))的基因可操作地連接。編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎的多能干和子代細胞中表達。在一個實施方案中，多能干和祖先細胞是神經(jīng)干和祖先細胞。在另一個實施方案中，標記/報道分子蛋白質(zhì)是在多能干和祖先細胞中表達的。仍然在另一個實施方案中，標記/報道分子蛋白質(zhì)是熒光蛋白質(zhì)，并且，熒光細胞是通過熒光激活細胞分揀分離的。本發(fā)明也涉及通過這些方法得到或分離的細胞。另外，本發(fā)明涉及評估化合物促進多能干和祖先細胞分化的能力的方法。該方法包括能夠分化的多能干和祖先細胞與待評估的化合物接觸，確定在存在化合物時或細胞中標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量；和將存在化合物時細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量和活對照細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量比較，多能干和祖先細胞的基因組中已經(jīng)整合了含有與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)(熒光蛋白質(zhì))的基因可操作地連接的哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，其中編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中表達的。在存在化合物時或細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量與活對照細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量比較時的減少或缺乏是該化合物促進多能干和祖先細胞分化的能力的證據(jù)。本發(fā)明的其它方面涉及評估化合物的促進全能干和祖先細胞分化成多能干和祖先細胞的能力。在該方法中，將活的全能干和祖先細胞與待評估的化合物接觸。活的全能干和祖先細胞的基因組中整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因(例如，編碼熒光蛋白質(zhì)的基因)可操作地連接，其中標記/報道分子基因是在細胞中表達的。確定在存在化合物時細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)(例如熒光)的測量，并與對照細胞中的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量比較。在存在化合物時的細胞的測定的標記/報道分子蛋白質(zhì)與對照的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量比較時的增加是全能細胞分化成多能干和祖先細胞的證據(jù)。同樣，本發(fā)明涉及評估化合物促進多能干和祖先細胞分化成神經(jīng)細胞的能力的方法。在這一方法中，如果研究的細胞是多能干和祖先細胞，在存在化合物時的細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)(例如熒光)的測量與對照細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量比較時減少是化合物促進多能干和祖先細胞分化成神經(jīng)細胞的能力的證據(jù)。本發(fā)明具有許多優(yōu)點。例如，通過實施本發(fā)明，可以直接得到完整的多能干和祖先細胞以及完整的神經(jīng)干和祖先細胞，而沒有延長體外的培養(yǎng)。產(chǎn)生的細胞保留了區(qū)域特異性而同時保留了產(chǎn)生各種類型的分化細胞的能力。另外，本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細胞可以用于評估促進分化的化合物和對細胞有毒性的化合物。另外，本發(fā)明的方法允許在動物模型中研究多能干和祖先細胞。例如，為了跟蹤體內(nèi)給藥的化合物的效果，研究在腦損傷后或移植實驗后，胚胎期和胚胎后時期的過程中，正常腦中的神經(jīng)發(fā)生。也可以檢測正常的器官發(fā)育過程和移植后的細胞遷移。另外，本發(fā)明提供了評估化合物促進干和祖先細胞和神經(jīng)干和祖先細胞的分化的能力的方法。由于完整的細胞可以從特異的器官或其區(qū)域分離和由于整合進細胞的涉及基因表達的調(diào)節(jié)元素是已知的，可以鑒定對于細胞亞系潛在地是獨立的細胞特異基因，蛋白質(zhì)，表面抗原，和其它細胞特異標記。圖2圖解了包括nestin啟動子，編碼綠熒光蛋白質(zhì)的基因序列，nestin基因的第二個內(nèi)含子序列的表達構(gòu)建體。圖3A-3C和3G表示了來自對照細胞的熒光激活細胞分揀(FACS)的結(jié)果。圖3D-3F和3H-3N表示了從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物得到的細胞的FACS。本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明涉及基因組中已經(jīng)整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物或其子代。與哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列可操作地連接的是編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)如熒光蛋白質(zhì)的基因。標記/報道分子蛋白質(zhì)是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物子代或其胚胎的多能干和祖先細胞中表達的。任何適當?shù)姆侨瞬溉閯游锟梢杂糜谏a(chǎn)如上所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。如本文所用，術(shù)語“非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物”包括非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的新生兒，年幼的子代，發(fā)育的成熟動物，胚胎，以及非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的子代的新生兒，年幼子代，發(fā)育成熟的動物或胚胎。非人轉(zhuǎn)基因動物和它們的子代的例子包括小鼠，大鼠，狗，猴子，以及任何適當?shù)姆侨瞬溉閯游锓N類。優(yōu)選的哺乳動物是小鼠。通常，干細胞認為是具有不對稱分裂的能力的細胞，產(chǎn)生一個拷貝的自身和一個更定型的子細胞。通常，干細胞被認為是具有增殖，展示自身維護，產(chǎn)生大量子代，和應(yīng)答損傷或疾病產(chǎn)生新細胞的能力的未分化細胞。通常祖先細胞是更定型的細胞，分裂不對稱并且可以分化成更成熟的形態(tài)型。如本文所用，術(shù)語“多能干和祖先細胞”是表達nestin的細胞。通常，多能干和祖先細胞是具有區(qū)域特異性的，并且能夠在分化的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生哺乳動物生物體中存在的一些器官或組織特征的細胞類型。神經(jīng)干和祖先細胞是多能干和祖先細胞的一個例子。在分化的基礎(chǔ)上，神經(jīng)干和祖先細胞產(chǎn)生神經(jīng)細胞如神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。多能干和祖先細胞的胚胎或全能前體在本文中指“全能和祖先細胞”。由于它們的全能特征，這些細胞能夠分化成哺乳動物生物體中的任何器官或組織的特征的細胞。如本文所用，全能干和祖先細胞是多能細胞的前體，不具有區(qū)域特異性，并且能夠因為它們不表達nestin的事實而與多能干和祖先細胞相區(qū)別。Nestin是中間產(chǎn)物絲狀蛋白質(zhì)，特別是，它定義了不同的第六類中間產(chǎn)物絲狀蛋白質(zhì)。Nestin例如是在神經(jīng)干和祖先細胞中表達的。當神經(jīng)干和祖先細胞分化成神經(jīng)細胞類型時，nestin的表達消失。在健康的哺乳動物中，CNS的完全分化的細胞，如神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞通常不表達nestin。但是，在一些CNS腫瘤中和在損傷了脊髓或光神經(jīng)后，已經(jīng)鑒定了nestin表達。在損傷的情況中，在反應(yīng)性星狀膠質(zhì)細胞和接近脊髓的中央導(dǎo)管的細胞中已經(jīng)觀察到了nestin的產(chǎn)生。已有報道(C.B.Johansson等人，細胞，96卷25-34頁(1999年))，在成熟的哺乳動物中，腔襯里細胞，如室管膜細胞，特別是在脊髓損傷之后表達nestin。在神經(jīng)干和祖先細胞以外的多能干和祖先細胞中也已經(jīng)觀察到了nestin表達。例如，在Kobayashi，M.，等人，Pediatr.Res.43卷(3)386-392頁(1998年)中報道，nestin在肌肉前體中表達，但是，成熟的肌肉細胞不表達nestin(Zimmerman，L.，等人，神經(jīng)元(US)，12(1)11-24頁(1994年))。Nestin表達已經(jīng)與發(fā)育的器官聯(lián)結(jié)，如肝(Niki，T.等人，肝學，29(2)520-527頁(1999年))，牙(Terling，C.，等人，Int.J.DevBiol，39卷(6)9476-956頁(1995年)，和心臟(Kachinsky，A.M.，等人，組織化學細胞化學雜志，43(8)843-847頁(1995年)。另外，nestin的表達可以存在于胰臟，腸胃道，視網(wǎng)膜的多能干和祖先細胞中。在本發(fā)明的組合物和方法中可以利用各種nestin基因或它的序列。適當?shù)牟溉閯游飊estin基因的例子包括大鼠nestin基因，人nestin基因，小鼠nestin基因和特異于任何其它哺乳動物種類的nestin基因。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物nestin基因是大鼠nestin基因。哺乳動物起源的nestin基因已經(jīng)分離和測序。例如，在1994年8月16日頒給Mckay等人的美國專利編號5,338,839中公開對應(yīng)于nestin蛋白質(zhì)的人nestin基因的核苷酸序列和推測的氨基酸序列，該專利全部引入本文作為參考。例如大鼠中的nestin基因的調(diào)節(jié)元素在Zimmerman，L.等人，神經(jīng)元，12卷11-24(1994年)中有討論，該文獻全部引入作為參考。如本文所用，“哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列”包括一個或多個nestin基因的調(diào)節(jié)序列，nestin基因與編碼蛋白質(zhì)的基因可操作地連接，在多能干和祖先細胞中表達蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物或其子代已經(jīng)在它的基因組中整合了具有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，其中調(diào)節(jié)序列使標記/報道分子蛋白質(zhì)在多能干和祖先細胞中表達。在本發(fā)明的另一個實施方案中，調(diào)節(jié)序列使標記/報道分子蛋白質(zhì)選擇性地在多能干和祖先細胞(例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中)表達。仍然在另一個實施方案中，調(diào)節(jié)序列選擇性地在神經(jīng)干和祖先細胞中表達。優(yōu)選的實施方案中，調(diào)節(jié)序列包括哺乳動物nestin基因的完整的第二個內(nèi)含子序列。也可以利用第二個內(nèi)含子的更短的序列。可以利用的適當?shù)母绦蛄惺潜绢I(lǐng)域已知的。例如，在歐洲神經(jīng)科學雜志，9卷452-462(1997年)中，該文獻全部引入周圍參考，Lothian和Lendahl表達了所產(chǎn)生的具有第二個人內(nèi)含子的3‘部分中最保守的714個堿基對或完全的1852個堿基對的轉(zhuǎn)基因小鼠，人內(nèi)含子給出了非常相似的類nestin表達方式，并且得出結(jié)論重要的對照元素保留在714個堿基對的元素中。在實驗細胞研究(美國)，248卷(2)509-519(1999年)中，該文獻全部引入作為參考，Lothian，等人表示，在人的nestin基因的第二個內(nèi)含子中的374個堿基對區(qū)域是足夠的，并且在這一區(qū)域的120個堿基對的序列是胚胎CNS的神經(jīng)細胞中表達nestin基因所必需的。可選擇地，調(diào)節(jié)序列可以進一步包括存在于哺乳動物nestin基因的第一個內(nèi)含子中的元素?？梢岳酶绦蛄械牡谝粋€內(nèi)含子的全部序列。如Zimmerman等人，在神經(jīng)元，12卷11-24頁(1994年)中討論，該文獻全部引入作為參考，在nestin基因的第一個和第二個內(nèi)含子中的獨立的和特異于細胞類型的元素能夠指導(dǎo)報道基因在發(fā)育中的肌肉和神經(jīng)中分別表達。如本文定義，哺乳動物的nestin基因的調(diào)節(jié)序列可以包括任何適當?shù)膯幼?。在一個實施方案中，啟動子可以是nestin啟動子。在優(yōu)先的實施方案中，nestin啟動子是從與調(diào)節(jié)序列相同餓哺乳動物的nestin基因中得到的。適當?shù)膯幼右部梢园ㄔ诓溉閯游锛毎?，細菌和昆蟲細胞中起作用的啟動子序列。適當?shù)膯幼拥睦影?，但不限于，多角體蛋白，3-磷酸甘油激酶，金屬硫蛋白，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR，SV40和TK啟動子和其他本領(lǐng)域已知的啟動子。在本發(fā)明的組合物和方法中，如上定義，哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列是與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的。編碼標記/報道分子分子蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎的多能干和祖先細胞中表達的。在本發(fā)明的一個實施方案中，標記/報道分子蛋白選擇性地在多能干和祖先細胞中表達。如本文所用，術(shù)語“選擇性地表達”是指標記/報道分子蛋白質(zhì)在多能干和祖先細胞中表達到了占優(yōu)勢的可檢測水平。在另一個實施方案中，標記/報道分子蛋白質(zhì)在神經(jīng)干和祖先細胞中表達到了可檢測的水平。仍然在另一個實施方案中，標記/報道分子蛋白質(zhì)選擇性地在神經(jīng)干和祖先細胞中表達。用于本發(fā)明的組合物和方法中的標記/報道分子蛋白質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。方便和簡單的實驗方法中的標記/報道分子蛋白質(zhì)是優(yōu)選的。例子包括，但不限于，發(fā)光蛋白質(zhì)，熒光蛋白質(zhì)，酶，細胞表面蛋白質(zhì)和本領(lǐng)域其它蛋白質(zhì)。可以利用的優(yōu)選的標記/報道分子蛋白質(zhì)是熒光蛋白質(zhì)。適當?shù)臒晒獾鞍踪|(zhì)的例子包括，但不限于，綠熒光蛋白質(zhì)(GFP)，修飾或增強的綠熒光蛋白質(zhì)(EGFP)，黃熒光蛋白質(zhì)，氰FP，藍FP，紅FP和它們的增強版本(Clontech)和可以發(fā)光的任何其它發(fā)光或熒光蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，標記/報道分子蛋白質(zhì)是熒光蛋白質(zhì)如綠熒光蛋白質(zhì)(GFP)。在另一個實施方案中，GFP為增強熒光而修飾(增強的綠熒光蛋白質(zhì))，可以從Clontech供應(yīng)的pEGFP-N1質(zhì)粒得到。簡要地說，該質(zhì)粒包括與人密碼子參考物有190個沉默堿基的變化，還存在ATG密碼子的更好的Kozak同感序列和氨基酸取代的改變Phe64-Leu和Ser65-Thr。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)在多能干和祖先細胞中表達熒光蛋白質(zhì)的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法，包括在非人哺乳動物的受精卵中導(dǎo)入含有如上定義的哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，哺乳動物的nestin基因與編碼如上所述的熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接，熒光蛋白質(zhì)是在非人哺乳動物的多能干和祖先細胞中表達的。將受精卵導(dǎo)入非人哺乳動物，優(yōu)選地是同一種類，這樣允許產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物子代的子代。本方法也包括從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物子代中選擇那些多能干和子代細胞表達熒光基因的那些子代。在本發(fā)明的一個實施方案中，本方法包括從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物子代選擇神經(jīng)和祖先細胞表達熒光基因的那些子代。表達GFP或為增強熒光修飾的GFP，例如EGFP的基因是優(yōu)選的。本發(fā)明的另一個方面涉及表達產(chǎn)生的在干和祖先細胞中的熒光蛋白質(zhì)的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，產(chǎn)生干和祖先細胞的方法包括在非人哺乳動物中導(dǎo)入含有如上定義的哺乳動物的nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，哺乳動物的nestin基因與編碼如上所述的熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接，熒光蛋白質(zhì)是在非人哺乳動物的干和祖先細胞中表達的；干和祖先細胞也通過在非人哺乳動物，優(yōu)選地同一種類中導(dǎo)入受精卵，允許產(chǎn)生非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物子代而產(chǎn)生，和通過從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物子代選擇那些干和祖先細胞表達熒光基因的子代。在本發(fā)明的一個實施方案中，選擇的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物子代是那些神經(jīng)和祖先細胞表達熒光基因的子代。在優(yōu)選的實施方案中，含有與熒光蛋白質(zhì)可操作地相關(guān)的哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA是含有啟動子序列，優(yōu)選地哺乳動物nestin基因的啟動子序列，編碼綠熒光蛋白質(zhì)和存在于nestin基因的第二個內(nèi)含子中的調(diào)節(jié)序列的表達構(gòu)建體或載體。這樣的構(gòu)建體的里子，生產(chǎn)的方法以及在非人哺乳動物的受精卵中導(dǎo)入構(gòu)建體的方法進一步在下面敘述。含有本發(fā)明的表達構(gòu)建體的一個細胞或一些細胞是可以分離的和可以進一步利用的。例如，可以研究這樣的細胞并且在體外鑒定，或可以用于設(shè)計檢測細胞發(fā)育和/或分化的實驗中。含有本發(fā)明的構(gòu)建體的細胞也可以移植進受體動物的器官中。本發(fā)明的細胞可以用于本領(lǐng)域已知的其它實驗。本發(fā)明也涉及評估非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的生物體，器官或其區(qū)域，在它的子代或在本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因胚胎中多能干和祖先細胞的存在。在優(yōu)選的實施方案中，利用的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物已經(jīng)在基因組中整合了還有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，哺乳動物的nestin基因是可編碼熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的。通過觀察或測量來自非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物其子代或胚胎的的器官或區(qū)域的熒光可以評估多能干和祖先細胞的群體。在受到創(chuàng)傷的器官中，在組織或器官的再生中，在各種治療中，在移植的前后，和在存在或缺乏各種環(huán)境因子或刺激下發(fā)育的各個時期中也可以評估熒光細胞的存在。通過利用本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，和測量其器官或區(qū)域的熒光，和將它與對照動物中的器官或其區(qū)域的熒光比較可以評估對動物模型給藥的和影響多能干和祖先細胞的化合物的體內(nèi)效果。本發(fā)明的另一個方面也涉及獲得或分離原初的，非培養(yǎng)的多能(例如，神經(jīng)的)干和祖先細胞的方法。這樣的細胞在本文中也指完整的，新鮮的，或簡單的原初多能干和祖先細胞。這樣的細胞可以從本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，從其子代，或從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的胚胎，直接地，不需要培養(yǎng)傳代而得到。但是，這些術(shù)語的利用不打算排除在體外研究這些新鮮，完整的或原初的細胞的可能性。因此，一旦才非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物或其子代得到，根據(jù)本發(fā)明的方法分離的原初多能干和祖先細胞可以進一步利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)在體外培養(yǎng)。得到活的原初多能干和祖先細胞的方法包括才非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎分離表達如上定義的標記/報道分子蛋白質(zhì)的細胞，非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的基因組中整合了還有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，nestin基因是和編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的，其中編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因是在非人基因哺乳動物，其子代或胚胎的多能干和祖先細胞中表達的。得到活的原初多能干和祖先細胞的另一個方法包括從基因組中已經(jīng)整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎分離熒光細胞，哺乳動物的nestin基因可操作地與編碼熒光蛋白質(zhì)的基因連接，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎的多能干和祖先細胞中表達的。通過本發(fā)明的組合物和方法可以分離器官或其區(qū)域中存在的多能干和祖先細胞。在優(yōu)選的實施方案中，分離的細胞是神經(jīng)干和祖先細胞。存在于其它器官和表達nestin的多能干和祖先細胞，例如肌肉前體細胞也可以純化(例如，高度累積)。在優(yōu)選地實施方案中，利用熒光激活細胞分揀(FACS)可以分離表達熒光蛋白質(zhì)的細胞。具有了修飾而具有增強的熒光的蛋白質(zhì)后，表達轉(zhuǎn)基因細胞的亮度是非常高的，F(xiàn)ACS證明是快而有效的方法。FACS技術(shù)已知是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。分揀細胞的FACS的用途例如在美國專利編號5,804,387中討論了。在優(yōu)選的實施方案中，熒光蛋白質(zhì)是熒光增強的綠熒光蛋白質(zhì)，并且鑒定為EGFP。最初，通過FACS，不到一個小時，通常10到30分鐘可以從完整的生物體分離非培養(yǎng)EGFP的表達細胞。其它方法也可以用于得到或分離基因組中已經(jīng)整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，該調(diào)節(jié)序列與標記/報道蛋白質(zhì)可操作地連接。例子包括，但不限于，利用發(fā)熒光的(Herzberg)β-gal底物，如Nolan，G.P.，等人，美國國家科學院院刊，85(8)2603-2607頁(1988)中所述，或Stemple，D.L.，等人，細胞，71(6)973-85頁(1992年)中所述的方法。依賴于特異于nestin蛋白質(zhì)的細胞表面標記的表達的方法也可以利用。在本發(fā)明的一個實施方案中，細胞表面標記，例如，受體，可以用作標記/報道分子蛋白質(zhì)而不是GFP。然后，利用熒光或標記的抗體技術(shù)如FACS或與磁性分離結(jié)合的與抗體結(jié)合的磁性珠可以純化多能干和祖先細胞。表面固定抗體的培養(yǎng)皿也可以用于優(yōu)先地見多能干和祖先細胞附粘于培養(yǎng)皿的表面。一旦分離，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以進一步研究和鑒定表達nestin的細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，RNA和蛋白質(zhì)是才分離的原初細胞中分離的。例如可以通過二維電泳或通過等電聚焦鑒定特異于分離細胞的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，同時鑒定了如上所述分離的完整細胞中的特征基因。例如，這可以通過基因嵌片技術(shù)版本完成?；蚯镀椒ǖ睦邮潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括Affimetrix或synteni方法。鑒定這樣的基因的一個方法包括制備在分離的細胞中的例如基因，cDNA，表達序列標記(EST)的目錄或文庫，和將該目錄與在非熒光細胞中表達的基因比較。非熒光細胞可以是在比nestin表達細胞更早期的發(fā)育中的細胞(例如，全能細胞)，或可以是在表達nestin的時期后已經(jīng)分化的細胞。同樣，該目錄可以與特異器官或其區(qū)域中的非熒光細胞表達的基因比較。仍然在本發(fā)明的另一個實施方案中，鑒定了特異于如上所述分離的細胞的表面抗原。鑒定特異于表面抗原的表面細胞的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些技術(shù)包括，例如用分離的細胞免疫動物，和從免疫的動物得到針對細胞特異抗原的抗體。仍然在本發(fā)明的另一個實施方案中，將本發(fā)明分離的細胞移植進動物中。特別是，可以將分離的細胞移植進特異的器官或其區(qū)域中。完成將分離的細胞移植進動物中的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。動物可以是和本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物相同的種類?；蛘撸搫游镆部梢允遣煌姆N類。動物的例子包括小鼠，大鼠，猴子和許多其他的種類。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物或如上所述它的子代和本發(fā)明分離的細胞可以用于鑒定影響全能和多能干和祖先細胞的分化。如本文所用，術(shù)語化合物包括例如，可以在治療，診斷或預(yù)防各種醫(yī)學適應(yīng)癥或病癥中給藥的藥物，和其他生物活性化合物。這樣的化合物通常在本文是指“治療試劑”。優(yōu)選的治療試劑包括生長因子和neutrophins?？梢岳玫钠渌衔锇ǖ幌抻谛》肿?如有機或有機金屬分子)，維生素，蛋白質(zhì)，肽，多肽，病毒，核酸，激素(例如，生長因子)，酶(例如，氧化氮合酶)，和其它天然或重組DNA起源的生物化合物，這些化合物可能在細胞的發(fā)育或分化中有意義。如本文所述，本發(fā)明進一步涉及鑒定化合物是否(I)促進多能干和祖先細胞的分化；(II)對多能干和祖先細胞是毒性的；(III)促進全能到多能干和祖先細胞的分化；和(IV)促進多能干和祖先細胞分化成神經(jīng)細胞的方法。這些方法包括檢測或測量標記/報道分子蛋白質(zhì)的表達。檢測或測量標記/報道基因表達的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。發(fā)光，熒光，酶活性(例如β-gal)，磁性珠和基于抗體的純化的其他方法，熒光激活的細胞分揀，差速離心和本領(lǐng)域已知的其它實驗方法也可以利用。優(yōu)選的標記/報道分子基因是表達如上所述的熒光蛋白質(zhì)的基因。熒光是由本領(lǐng)域已知的技術(shù)和設(shè)備測量的。激發(fā)和發(fā)射波長是根據(jù)利用的熒光標記/報道分子蛋白質(zhì)選擇的，是本領(lǐng)域已知的。在一個實施方案中，利用了GFP(激發(fā)波長是約395納米，發(fā)射波長約為509納米)。在另一個實施方案中，利用了EGFP(激發(fā)波長約為488納米，發(fā)射波長約為507納米)。篩選或評估的化合物可以對本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物給藥或體內(nèi)遞送。這些化合物也可以在體外研究。如本文所用，術(shù)語將化合物“接觸活的多能干和祖先細胞”，“接觸活的全能干和祖先細胞”和“接觸活的神經(jīng)干和祖先細胞”包括在體外處理細胞以及在體內(nèi)給藥化合物。可以將已經(jīng)接受化合物的動物中的器官或其區(qū)域的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量與沒有接受化合物的對照動物中的對應(yīng)的器官或區(qū)域中的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量進行比較。評估體內(nèi)給藥的化合物的效果的另一個適當?shù)姆椒òú乓呀?jīng)接受化合物的殺死的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中收獲和分離細胞，和將分離細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量與沒有接受化合物的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物得到的對照細胞比較。體內(nèi)給藥的化合物和它們對細胞的效果可以例如通過觀察組織熒光變化，或通過對從殺死的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的細胞進行FACS進行評估。利用從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物分離的細胞，或從用含有啟動子序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞(例如，全能干和祖先細胞；多能干和祖先細胞)，編碼標記/報道分子的蛋白質(zhì)的基因和存在于哺乳動物nestin基因的第二個內(nèi)含子中的調(diào)節(jié)序列，通過如上所述的方法也可以篩選化合物。可以將細胞與待評估的化合物接觸，測量存在化合物時的標記/報道分子蛋白質(zhì)(例如，熒光蛋白質(zhì))，與對照細胞中的標記/報道分子的蛋白質(zhì)比較。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，將存在化合物時的細胞的樣品與對照細胞的樣品比較，比較的方法使標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量(例如，熒光)中的任何差異可以唯一地歸結(jié)于化合物的效果。在本發(fā)明的一個實施方案中，將基因組中已經(jīng)整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA的多能干和祖先細胞與待篩選的化合物接觸，調(diào)節(jié)序列與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因可操作地連接。在沒有細胞破壞時，與對照細胞中測定的標記/報道分子蛋白質(zhì)比較時，在接觸化合物的細胞中觀察到的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量的降低是化合物促進(增強，增加)干和祖先細胞分化成不再表達nestin基因的細胞的能力的證據(jù)。對標記/報道分子蛋白質(zhì)的延長的測定暗示了化合物抑制(降低)分化的能力。在利用的標記/報道分子蛋白質(zhì)是熒光蛋白質(zhì)的實施方案中，與對照細胞的熒光比較，存在化合物時，細胞中的熒光延長暗示了在存在化合物時多能干和祖先細胞的分化降低。用另一句話說，在抑制分化的化合物存在時的是細胞將比對照細胞發(fā)熒光更長時期。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，分離的細胞是神經(jīng)干和祖先細胞，并且，與對照細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量(例如，熒光)比較時，當這些降表與化合物接觸時觀察到的標記/報道蛋白質(zhì)的測量(例如，熒光)的下降或增強是化合物促進或延遲神經(jīng)干和祖先細胞分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的能力的證據(jù)。在另一個實施方案中，先于nestin基因的表達的發(fā)育時期的細胞(例如，全能細胞)可以用于篩選促進它們分化成表達nestin基因的細胞，例如多能干和祖先細胞的化合物。例如，由于與沒有接觸化合物的對照全能細胞比較，增強了熒光或增加了另一個標記/報道分子蛋白質(zhì)的存在，可以評估與化合物接觸后全能細胞的分化。在優(yōu)選的實施方案中，多能干和祖先細胞包括神經(jīng)干和祖先細胞。全能細胞是可以從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或從本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的胚中分離的。在分離全能細胞中利用的技術(shù)的例子包括培養(yǎng)ES細胞，裂解胚泡，基于啟動熒光色素的表達的全能特異啟動子的FACS分揀，通過抗體，F(xiàn)ACS，磁性珠，親和柱或固定于培養(yǎng)皿的抗體的全能特異細胞表面標記選擇。如本領(lǐng)域已知，將對照全能細胞與接觸化合物的全能細胞在除了存在待評估的化合物以外的各個方面比較?？梢院Y選的促進全能細胞的分化的化合物的例子包括如上所述的那些。在優(yōu)選的實施方案中，才包括生長因子，neurotrophin和治療試劑的組可以選擇待評估的化合物。也可以評估化合物對多能干和祖先細胞，例如對神經(jīng)干和祖先細胞的毒性。將活細胞與待評估的化合物接觸，將才這些細胞觀察到的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量(例如，熒光)與對照細胞的熒光比較。由此，在存在化合物時細胞的測量(例如，熒光)的下降可以是化合物對細胞的破壞以及細胞分化成不再表達nestin的細胞類型的證據(jù)。在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，通過獨立的技術(shù)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)測量細胞的破壞。例如，如果將熒光利用為標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量，就可以利用非熒光技術(shù)測量細胞破壞。當與活對照細胞(非與化合物接觸)的熒光和數(shù)目比較時，與待評估毒性的化合物接觸的細胞中活細胞的數(shù)目的減少偶聯(lián)的標記/報道分子蛋白質(zhì)測量(例如，熒光)的降低是化合物對多能干和祖先細胞，或在優(yōu)選的實施方案中對神經(jīng)干和祖先細胞的毒性的證據(jù)。本發(fā)明進一步通過并不打算限制本發(fā)明的下面的實施例來說明。所有本文引證的參考文獻全部引入作為參考。實施例實施例1圖1A和1B表示了nestin啟動子，來自SV40的聚腺苷酸化序列，和來自nestin基因的第二個內(nèi)含子的亞克隆，并如下所述地進行。通過用XbaI和BamHI限制性酶裂解，從含有nestin啟動子(Zimmerman，L.，等人，神經(jīng)元，12卷11-24(1994年))，polyA，和nestin基因的第二個內(nèi)含子的質(zhì)粒中除去SV40拼接/聚腺苷酸化區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了250個核苷酸堿基對的帶，連接進也已經(jīng)用XbaI和BamHI裂解的pBSM13+載體(可從Stratagene購買和表示在圖1C)。然后，通過KlenowDNA聚合酶處理將polyA-pBSM13+載體的XbaI位點的末端平齊化，在這一位點中克隆AscI的接頭(它的序列是pAGGCGCGCCT)(SEQIDNO1)，在現(xiàn)存的AscI限制位點的每一側(cè)再建立XbaI位點。用限制酶BamHI和SmaI切割大鼠Nestin啟動子/polyA/第二個內(nèi)含子質(zhì)粒消化第二個內(nèi)含子(1.8kb核苷酸)，然后將3’連接到也已經(jīng)用BamHI和SmaI限制酶裂解的polyA-pBSM13+質(zhì)粒。為了將啟動子序列克隆進polyA/第二個內(nèi)含子/pBSM13+質(zhì)粒，將polyA/第二個內(nèi)含子/pBSM13+質(zhì)粒中的HindIII位點的末端平齊化，再連接，產(chǎn)生了NheI位點。然后，用SpeI-SaII限制酶消化，從大鼠nestin啟動子/polyA/第二個內(nèi)含子質(zhì)粒消化nestin啟動子(5.8kb核苷酸)，并且連接到已經(jīng)用NheI-SaII限制酶消化的polyA/第二個內(nèi)含子/pBSM13+質(zhì)粒中，將nestin啟動子5’放置于聚腺苷酸化位點。SpeI限制位點是與NheI位點相容的。以這一方式，產(chǎn)生了還有啟動子和大鼠的第二個內(nèi)含子元素，并且SV40聚腺苷酸化序列放置于兩個元素之間的質(zhì)粒。將pEGFP-N1質(zhì)粒(Clontech)用作GFP的來源，該質(zhì)粒編碼已經(jīng)增強熒光的GFP的突變版本。為了在大鼠nestin啟動子/polyA/第二個內(nèi)含子/pBSM13+質(zhì)粒亞克隆這一基因，GFP的翻譯終止密碼子3‘末端的NotI限制位點是用NotI限制酶消化的，并用KlenowDNA聚合酶末端平齊化，將Asc接頭(如上所述)連接進該位點。這樣產(chǎn)生了替代NotI位點的AscI限制位點。將在GFP基因的5’端的多接頭中發(fā)現(xiàn)的XmaI限制位點末端平齊化(如上所述)，并且再連接，以便破壞SmaI位點。然后用限制酶SalI和AscI消化EGFP，產(chǎn)生780bp的DNA片段，并且連接進Nestin啟動子的3‘端和polyA位點的5’端的nestin啟動子/EGFP/SV40polyA/第二個內(nèi)含子/pBSM13+質(zhì)粒(已經(jīng)用SalI和AscI消化)。用限制酶SmaI消化約10微克的質(zhì)粒。氯化銫離心制備本文也稱為“zGFP”的含有nestin啟動子/EGFP/SV40polyA/第二個內(nèi)含子/pBSM13+的質(zhì)粒。圖2表示了nestin啟動子-EGF-N1-SV40PolyA-Nestin第二個內(nèi)含子/pBSM13+(ZGFP)的完整質(zhì)粒。為了線性化，將SmaI切出，得到8.55kb的啟動子片段，GFP和第二個內(nèi)含子；3.1kb的帶是pBLUESCRIPT主鏈。通過瓊脂糖凝膠，純化含有Nestin啟動子-EGFP-polyA/第二個內(nèi)含子的DNA片段。實施例2將如實施例1中所述得到的特異片段導(dǎo)入C57BL/6xBALB/cBy雜合體品系的500個卵母細胞的原核。然后，將已注射的卵母細胞轉(zhuǎn)移到12個假孕的母性中。這一過程總共產(chǎn)生了86個F0pup。為了轉(zhuǎn)基因檢測，對從尾巴分離的DNA進行了PCR分析。利用于PCR的引物序列是CCTCTACAAATGTGTGATGGC(對應(yīng)于SV40聚腺苷酸化區(qū))(SEQIDNO2)，和GCGCACCATCTTCTTCAAGGACG(對應(yīng)于EGFP序列)(SEQIDNO3)。在30微升含有10％的DMS，2.5mMMgCl2，1xPCR緩沖液，0.2nM每種dNTP，0.4微摩爾/升每種引物和1uamplitaq(BoeringerMannheim)中進行PCR。進行了44個循環(huán)的，55度退火(30秒)和65度延伸(1分鐘)。在這些溫度下，在86個F0小鼠中的8個中檢測期望的470個堿基對的片段。在這8個轉(zhuǎn)基因的小鼠中，3個是雄性，5個是雌性。實施例3為了評估在這些陽性轉(zhuǎn)基因小鼠中，EGFP的表達是否是在空間和時間上受到Nestin啟動子和第二個內(nèi)含子的控制的，將3個轉(zhuǎn)基因陽性雄性小鼠和3-6星期的大C57BL/6的雌性小鼠交配。確定交配的孢塞是E0.5。在它們到了超過母體中出現(xiàn)交配孢塞的時期時，加工胚胎。在適當成熟時，用CO2，隨后使頸脫位，殺死母小鼠。移取胚胎，放置于0度PBS中，洗滌，再用4％的過甲醛，在4度過夜。在過甲醛處理后，將胚胎用于全樣載片分析，或放置于30％的蔗糖中直到胚胎完全沉沒后(通常2天)24小時。將胚胎包埋在O.C.T.(最適切片溫度)的化合物(從VWR得到)中，接著用LeiciaJungFrigocut2800E恒溫切片機，盒子溫度為-20度，主體溫度為-17度進行恒溫切片。切片有40-60微米厚，并且黏附在明膠薄片上。分析E10.5，E13.5，和E16.5胚胎的熒光。利用LeicadMPS30解剖顯微鏡觀察全樣載片成象，目鏡0.8X，附加的是Mercury燈和GFP濾片。利用Zeissaxiophot顯微鏡和FITC濾片和附帶的CCDspot相機(Diagnostic儀器公司)分析切片組織；因為組織比顯微鏡觀察到的視野更大，所以可以在10X的放大鏡下取切片，再在AdobePhotoshop構(gòu)成鑲嵌狀。首先通過在4％的過甲醛中浸泡小鼠加工成熟的腦。然后，從顱中取出腦，進一步用4％的過甲醛，在4度處理4小時。在固定后，在30％的蔗糖中浸泡腦直到浸沒后(通常3天)1天。用如上所述的方法，但是盒子溫度-30度，主體溫度-27度進行Sagittal恒溫切片。實施例4為了盡早在胚胎期第7.5天開始形成神經(jīng)板時標記神經(jīng)上皮細胞，確定Nestin的表達。為了評估這些陽性轉(zhuǎn)基因小鼠中EGFP的表達是否是在空間和時間上受Nestin啟動子和第二個內(nèi)含子的控制的，將第三個轉(zhuǎn)基因陽性小鼠與3-6個星期大的C57BL/6雌性小鼠交配。確定交配孢塞的建立是在E0.5時。在母體的年齡超過了出現(xiàn)交配孢塞時，加工胚胎。在成熟適當時，用CO2，然后頸脫位殺死母體。移取胚胎，放置于0度的PBS中洗滌，接著用全樣載體顯微鏡觀察。在胚胎期(E)9.5，12.5，14.5，15.5，16.5，和18.5天時制備小鼠胚胎。用LeicaMPS30解剖顯微鏡，在0.8X的物鏡下，和附帶的Mercury燈和GFP濾片下觀察全樣載片成象。在這些時期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整個區(qū)域包括視網(wǎng)膜，晶狀體，和脊髓中觀察到GFP的表達。在E12.5天后表達開始消失，這與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育的發(fā)育過程相關(guān)。神經(jīng)分化在這個時期開始，導(dǎo)致干細胞的形成的明顯的降低和分化的形式的增加。如上所述制備的胚胎腦的冠狀切面的分析更明白地表示了這一過程。但是，小鼠沒有保留在PBS，而是用4％的過甲醛在4度過夜，固定。在過甲醛處理后，將胚胎放置于30％的蔗糖中，直到胚胎完全沉沒(通常2天)后24小時。在O.C.T.(最適切片溫度)化合物(Sigma)中包埋胚胎，接著用LeicaJungFrigocut2800E恒溫切片機，盒子的溫度是-20度，主體的溫度是-17度進行恒溫切片。切片有30微米厚，黏附在明膠薄片上。分析E12.5，E14.5，E15.5，E18.5天的胚胎的熒光。用Zeissaxiophot顯微鏡，F(xiàn)ITC濾片和附帶的CCDspot相機(Diagnostic儀器公司)分析切片組織；因為組織比顯微鏡觀察到了大得多，所以在10X的放大鏡下去切片，再在AdobePhotoshop中再構(gòu)建。對于成熟的小鼠制備同樣的成象。首先通過在4％的過甲醛中浸泡小鼠加工成熟小鼠的腦。然后從顱中取腦，進一步在4度，4％的過甲醛中處理4小時。在固定后，在30％的蔗糖中浸泡腦直到浸沒后(通常3天)1天。用如上所述的方法，但是盒子溫度-30度，主體溫度-27度進行箭頭形恒溫切片。成熟的小鼠(6星期)顯示在過去報道的如用BrdU摻入鑒定的神經(jīng)發(fā)生的位點的腦區(qū)域有GFP的表達，這些位點如齒狀回(Kempermann等人，美國國家科學院院刊，94(19)10409-10414(1997年)，側(cè)腹帶(Morshead，等人，神經(jīng)元，13卷(5)1071-1082頁(1994年)，嗅球，和嘴遷移流(Subonen等人，自然，383卷(6601)624-627(1996年)。實施例5為了確定EGFP的基因在神經(jīng)干細胞中是否是在時間和空間上表達的，進行了免疫組織化學實驗。小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)起源于外胚的條帶，原條的嘴。這一組織變成了神經(jīng)板，出現(xiàn)在胚胎發(fā)生的7.5天。到胚胎發(fā)生的第9天和10天，神經(jīng)板進行快速的細胞生長，在神經(jīng)板反側(cè)的細胞融和形成神經(jīng)管。神經(jīng)管的腔最終變成成熟的小鼠的腦的腦室，和脊髓了中央管道。正是在組織的腔的這一界面形成了腦的主要的分裂和發(fā)育。由于細胞從腦室的表面切向遷移，它們變得更加特異于對稱的細胞分裂。幾個抗原是已知的，可以確定腦中的主要的細胞類型(通常是神經(jīng)干，神經(jīng)元，星形膠質(zhì)，和血細胞)的發(fā)育時期。在這些實驗中，鑒定了腦的幾個不同的表現(xiàn)型，用免疫組織學途徑，在數(shù)量和位置上進行比較。為了確定是否這些熒光標記細胞確實代表了細胞類型，nestin陽性(nestin+)細胞和神經(jīng)干細胞，將GFP細胞與分化的神經(jīng)元(βIII微管蛋白)的標記和分化的星形膠質(zhì)細胞(GFAP)比較。這些比較允許分析是否胚胎和成熟時期的腦中的Nestin+/GFP+細胞協(xié)同定位。結(jié)果表明，在發(fā)育時期有非常明顯的遷移，而在胚胎發(fā)生早期，緊緊圍繞腦室的細胞是GFP+，而在腦室的遠側(cè)，這一表達方式具有一個非常明顯的GFP+表達的下調(diào)和βIII微管蛋白免疫組織化學的升高。Nestin啟動子足夠允許GFP在圍繞腦室的那些區(qū)域中表達。在成熟的小鼠中，Nestin啟動子調(diào)節(jié)GFP的表達方式大大地下降了。與前面提到的標記的協(xié)同定位相比，βIII微管蛋白和GFAP發(fā)現(xiàn)是相互混合的，但完全不是協(xié)同定位。在側(cè)腦室的后區(qū)中，存在高度的與星形細胞標記GFAP的區(qū)域協(xié)同定位，但細胞協(xié)同定位很小。在側(cè)腦室的前區(qū)，那里細胞開始從腦室發(fā)散進入嘴遷移流，所以與GFAP相比，與神經(jīng)元標記βIII微管蛋白存在更高程度的區(qū)域協(xié)同定位。由于細胞沿著嘴遷移流遷移，再次存在高度的Nestin-GFP的表達；但是，GFP與GFAP或微管蛋白的標記的協(xié)同定位很小或沒有。這些結(jié)果支持，后腦室產(chǎn)生的大量的新細胞變成了神經(jīng)元的想法以及一些星形膠質(zhì)細胞是對稱分裂的祖先細胞的想法。同時，這些結(jié)果表明nestin-GFP轉(zhuǎn)基因不是與分化的表現(xiàn)型的標記協(xié)同定位的。實施例6將轉(zhuǎn)基因陽性雄性小鼠與C57B6雌性小鼠交配。出現(xiàn)交配孢塞標志著雌性的受精卵已經(jīng)在胚胎發(fā)育的0.5天了。在胚胎發(fā)生的13.5天時，殺死母體，移取胚胎。為了表明在轉(zhuǎn)基因陽性和陰性littermate的發(fā)育之間沒有殘余，進行冠到腰的測量，在有鼠之間沒有發(fā)現(xiàn)大小的表現(xiàn)型。在4度的PBS中洗滌胚胎，用手舉紫外燈，確定哪個小鼠是轉(zhuǎn)基因的，哪個不是。在這時，整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達了高水平的GFP，并且通過這一UV方法可以容易地確定轉(zhuǎn)基因小鼠。才胚胎中移取腦組織，放置于4度下的Hank緩沖鹽溶液(HBSS)(Gibco)(總共5毫升)中。然后，與2X胰蛋白酶溶液以1∶1混合，胰蛋白酶溶液是在HBSS中含有0.25％胰蛋白酶(Gibco)，1毫摩爾/升EDTA(Gibco)，和1毫克/毫升膠原酶(Gibco)的溶液。將這一溶液在37度下每3分鐘攪拌溫育15分鐘。為了淬滅酶消化活性，加入0.1毫克/毫升卵類粘蛋白(Sigma)。然后用19，再用21規(guī)格的注射筒磨碎組織。在Beckmantabletop離心機中，在4度500rpm，將細胞離心10分鐘。然后，在冰冷的PBS，以1X106個細胞/毫升再懸浮細胞。以這一方法制備兩個原初細胞樣品，一個取自陽性nestin/GFP小鼠的腦組織，一個取自陰性nestin/GFP小鼠的鬧組織。兩個樣品來自同一母體(littermate)的胚胎中。用CoulterEliteESPFACS進行熒光激活細胞分揀(FACS)。除了分揀和回收時期，在PBS中的冰上保留細胞，以便可以持久地做這些實驗。將細胞放于70微米的尼龍網(wǎng)膜上，除去細胞塊，然后經(jīng)過FACS。用于GFP檢測的濾器是光電倍增管2(PMT2)，它的發(fā)射波長是520和530納米之間。FACS結(jié)果表示在圖3A-3N。為了確定熒光的背景水平，以及確定這一神經(jīng)元群體的細胞的大小和形狀，首先通過FACS機器分析來自Nestin-GFP的陰性胚胎的細胞。結(jié)果表示在圖3A-3C，圖中表明了當通過FACS機器時，非轉(zhuǎn)基因胚胎腦細胞(對照細胞)出現(xiàn)和什么。圖3A表明了這一群體的細胞的大小(向前分散或FS)和形狀(側(cè)向分散或LS)。A塊表示的是健康的群體，如FACS工作過去確定的，沒有發(fā)現(xiàn)成塊的細胞。每個點表示一個數(shù)據(jù)點(一個真正的細胞)。通常，在FS軸的底部的點表示細胞碎片，而LS軸的極右邊的點表示細胞群。包括了69.9％的細胞群體的盒子“A”代表了在下面的數(shù)據(jù)組中分析的細胞庫?？赡艹扇旱倪@一盒子以外的細胞，死的或細胞碎片不包括在內(nèi)。圖3B中表示的數(shù)據(jù)點是在左邊的小組中的盒子“A”中g(shù)ated的那些。“Gated”指只有圖3A的盒子“A”中的那些細胞在圖3B中分析了。圖3B表示了GFP熒光(垂直軸)比較來自圖3A的gateA的細胞的FS或細胞大小(水平軸)的相對程度。將盒子“C”放置于這一細胞群體周圍，標記了背景熒光。然后，將gateC用作背景熒光的標記，用于以后的實驗。在這一Cgate上面登記的任何點都表示具有比背景更高的熒光強度的細胞，所以是GFP陽性，因為在隨后的實驗中GFP是熒光的唯一來源。(在標記為“C”的盒子的外側(cè)的非轉(zhuǎn)基因小鼠細胞沒有熒光)圖3C表示與水平軸上對數(shù)規(guī)模的GFP的熒光強度的比較中的垂直軸上的細胞數(shù)，并且表明了來自腦的非轉(zhuǎn)基因細胞群體是無GFP強度的。圖3D-3E表示了來自轉(zhuǎn)基因littermate的細胞的FACS分析。通常，懷孕的小鼠有約9個胚。當在這些實驗中移取這些胚時，用手舉的UV燈照，就可以將轉(zhuǎn)基因陽性的胚和陰性的胚區(qū)別。陽性的在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有熒光特征。圖3D是在分析了相同數(shù)目的細胞(71，322)后的對照。(在圖3G和圖3H中每一側(cè)都表明，陽性和陰性細胞的群體在向前和向后的分布上是相同的)。NestinGFP細胞展示了與非轉(zhuǎn)基因littermate相同的大小和形狀。在轉(zhuǎn)基因組織中，70.1％的所有細胞發(fā)現(xiàn)是在gateA中的，而非轉(zhuǎn)基因細胞發(fā)現(xiàn)有69.9％的細胞在gateA中。圖3E表明，Nestin-GFP陽性細胞展示了兩個群體，一個在gateC中，所以是無GFP表達的細胞的群體(與背景群體相同)，另一個在gateB中，展示了具有比背景高100X的熒光。在分析的71，322個細胞中，41.1％具有比對照細胞更高的熒光強度。第二個群體，如盒子“B”所指，包括了31.0％的細胞。用FACS機器分揀盒子“B”的細胞(或分離)。圖3F展示了兩個峰，表示了高GFP熒光區(qū)(表示為gateD)。這一數(shù)據(jù)證明，在這一實驗中，在來自胚胎期13.5天的小鼠的腦的39.3％的細胞中，nestin-第二個內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄單位是有活性的。同時，在這一39.3％中，31％的細胞有比背景細胞高100X的熒光。下面的實驗利用FACS機器進一步純化高GFP熒光的群體。再次分揀來自如上所述的實驗中的盒子B的細胞。將細胞分揀成gateA和gateB，保證群體健康，是高熒光的單個細胞。結(jié)果表明在圖3I-3K。分揀的結(jié)果是，來自上面實驗的gateB的細胞(總?cè)后w的31％)現(xiàn)在含有了展示高GFP熒光的總?cè)后w細胞的93.1％。為了確定兩輪細胞分揀的細胞的純度，離心gateB的細胞(圖3J)，再懸浮于更小體積的PBS中。再次通過FACS分析群體，再次分揀。結(jié)果表示在圖3L-3N。分析了這一組中的1，289個細胞，99.9％的細胞具有高GFP熒光。這證明，分揀的細胞(gateB，圖3J)代表了高水平表達GFP轉(zhuǎn)基因的高純度群體。實施例7為了確定nestinGFP細胞是否是干細胞或祖先細胞，也進行了基于神經(jīng)球集落形成的實驗。神經(jīng)球集落形成最初是由Reynolds和Weiss，科學，255卷1701-1710頁(1992年)中設(shè)計的普通實驗，該文獻全部內(nèi)容引入作為參考，該實驗用于確定是否細胞確實是神經(jīng)干細胞。通過從酶分解的腦組織生長原初細胞培養(yǎng)物，能夠鑒定當放置于含有EGF的無血清培養(yǎng)基中時，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生大的球體集落的細胞。然后，將這些球體群體接種在粘連蛋白包衣的蓋玻片上，培養(yǎng)基中含有小牛胎血清，在那里，它們開始粘連于表面，隨后細胞在5到7天內(nèi)分化成3種不同的神經(jīng)細胞表現(xiàn)型(神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細胞，和少突膠質(zhì))。這些分化的細胞不再進行有絲分裂，不再表達干細胞標記nestin。在這些實驗中利用的方法如下。從成熟的轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠品系，通常利用小鼠品系#33收獲細胞。用400微升15％的氯化水合物作為鎮(zhèn)靜劑注射(腹膜內(nèi))給小鼠。在沒有反射后，用冰冷的10毫升Hanks緩沖鹽溶液(沒有鈣或鎂)灌注小鼠除去血液。然后，從顱骨中分解出腦，放置于HBSS+中。通過雙冠解剖，除去嗅球和小腦制備腦室區(qū)域。然后將組織放置于含有100微升/毫升的青霉素G/鈉和100微克/毫升硫酸鏈霉素(Gibco)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在冰上放置5分鐘。允許組織固定，除去所有上清液。然后，在存在versene時，加入6微升胰蛋白酶0.025％(Gibco)，并允許酶消化組織10分鐘。然后，用吸管吸放細胞，直到它們成如止血器確定的單個細胞，加入DMEM/F12沉淀細胞3次，離心除去胰蛋白酶，然后在M21無血清培養(yǎng)基中再懸浮，補充20納克/毫升的EGF。然后，以20,000個細胞/微升培養(yǎng)基的密度或更低的集落密度鋪細胞。用1000納克EGF每3天補充一次培養(yǎng)基。在5天后出現(xiàn)神經(jīng)球，兩個星期時直徑50-80微米。以這樣的方法，得到大量的神經(jīng)球是可能的，所有的神經(jīng)球是高度GFP陽性的。在存在FBS時，在粘連蛋白上鋪這些熒光球以后，各種其他細胞類型如非熒光神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞就分化了。后腦室的nestin-GFP派生細胞能夠形成神經(jīng)球，以及在誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)得到多種表現(xiàn)型，表明nestin-GFP細胞是神經(jīng)干細胞。實施例8同時進行了神經(jīng)元移植實驗。在這些實驗中，將才轉(zhuǎn)基因小鼠純化和分離的nestin-GFP+細胞插入受體動物(在這些研究中是SpragueDawley大鼠)的腦中。進行實驗評估是否nestin-GFP細胞可以移植到受體大鼠的腦中，和是否這些細胞不僅存活而且摻入了它們所遞送的區(qū)域的正常發(fā)育過程中。用CO2窒息母體制備胚胎期的小鼠，隨后立即除去胚胎，轉(zhuǎn)移到冰冷的HBSS。用手舉UV燈確定轉(zhuǎn)基因陽性胚胎，除去整個頭。然后，將組織放置于含有100U毫升青霉素G/鈉和100U/毫升硫酸鏈霉素(Gibco)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在冰上5分鐘。允許組織固定，除去所有上清液。在存在versene時加入6微升胰蛋白酶0.025％(Gibco)，允許酶消化組織10分鐘。然后，用吸管回吸細胞，知道它們?nèi)缰寡鞔_定的為單個細胞。加入EMEM/F12，沉淀細胞3次，離心除去胰蛋白酶。裂解胚胎期14天的小鼠(在這一時期是CNS中60％的GFP+)。將細胞稀釋成10微升中20,000個細胞，并保留在HBSS+中，冰上，直到受體大鼠準備進行細胞轉(zhuǎn)移。分別用100毫克/公斤和10毫克/公斤的氯胺酮和塞拉嗪的混合物麻醉大鼠準備成熟的大鼠。通過捏，抓反彈檢測鎮(zhèn)靜的程度。當鎮(zhèn)靜時，用電剃刀并定位在立體的框架中，刮動物的頭上的毛。然后，打開大鼠的嘴，在門牙之間插入牙條，在聽覺道每側(cè)放置耳條，鎖定。在動物的脖子上繃緊脖子上的夾子，用甜菜堿清洗皮膚。用10號解剖刀，在頭皮上做1。5厘米的中線切入，用鑷子和小剪刀，在中線開始，并移到后面，除去顱骨膜，暴露腦殼。交叉冠狀和箭頭狀縫合，鑒定前鹵點，作為立體參考點。然后在附加在立體框架中的架子上的Hamilton微量注射器中裝載20,000個細胞。移動針尖到前鹵點，記錄AP和ML坐標(Paxinos和Watson1982年，用于坐標)，然后移動到立體坐標，用于后腦室。在這個位置，用固定于牙鉆的1號碳化物鉤著物在標記點鉆一個洞。將針下降到硬腦膜的頂部，記錄它的垂直坐標，并約以1毫米/分鐘降低到腹惻。以約1微升/分鐘注射細胞，保持針4分鐘，以1毫米/分鐘的速度移取細胞。然后，用鹽在移取點洗皮膚，用用反切針，非可吸收2.0號乙塞昂縫合封閉，覆蓋防腐劑凝膠。以這一方法，可以將細胞準確地注射進腦室，該方法也允許通過調(diào)節(jié)AP和ML坐標直接注射。在一個星期的生存期后，發(fā)現(xiàn)細胞能夠生存并且摻入了腦中。本發(fā)明已經(jīng)特定地說明了，并且參考優(yōu)選的實施方案敘述了，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，不脫離附加的權(quán)利要求的范圍可以作各種形式和細節(jié)上的變化。序列表<110>冷泉港實驗室格雷高里·N·艾妮科洛波夫約翰·米格諾尼<120>表達熒光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠<130>1314.1062002<150>US09/444,335<151>1999-11-19<160>3<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成接頭<400>1aggcgcgcct10<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2cctctacaaatgtgtgatggc21<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3gcgcaccatcttcttcaaggacg權(quán)利要求1.在基因組中整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，調(diào)節(jié)序列與編碼熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代的多能干和祖先細胞中表達的。2.權(quán)利要求1所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物或其子代的多能干和祖先細胞中選擇性地表達的。3.權(quán)利要求1所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物或其子代的神經(jīng)干和祖先細胞中表達的。4.權(quán)利要求1所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中哺乳動物是小鼠。5.權(quán)利要求1所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列是從大鼠nestin基因得到的。6.權(quán)利要求1所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中調(diào)節(jié)序列包括哺乳動物nestin基因的第二個內(nèi)含子序列。7.權(quán)利要求1所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中調(diào)節(jié)序列包括啟動子。8.權(quán)利要求7所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中啟動子和調(diào)節(jié)序列是從同一哺乳動物nestin基因中得到的。9.一種生產(chǎn)在多能干和祖先細胞中表達熒光蛋白質(zhì)的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法，包括(a)在非人哺乳動物的受精卵中導(dǎo)入含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，調(diào)節(jié)序列是與編碼熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的，熒光蛋白質(zhì)是在非人哺乳動物的多能干和祖先細胞中表達的；(b)將受精卵導(dǎo)入同一種類的非人哺乳動物中；(c)允許非人哺乳動物產(chǎn)生也是非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的直待；和(d)選擇多能干和祖先細胞表達熒光基因的(C)的非人哺乳動物的子代。10.權(quán)利要求9中所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中選擇性地表達的。11.權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在神經(jīng)干和祖先細胞中表達的。12.權(quán)利要求9所述的方法，其中非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物是小鼠。13.權(quán)利要求9所述的方法，其中哺乳動物的nestin基因的調(diào)節(jié)序列是從大鼠nestin基因中得到的。14.權(quán)利要求9所述的方法，其中調(diào)節(jié)序列包括哺乳動物nestin基因的第二個內(nèi)含子序列。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中調(diào)節(jié)序列進一步包括啟動子。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中啟動子和調(diào)節(jié)序列是從同一哺乳動物的nestin基因得到的。17.權(quán)利要求9的方法產(chǎn)生的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。18.一種包括啟動子，編碼綠熒光蛋白質(zhì)的基因和存在于哺乳動物nestin基因的第二個內(nèi)含子中的調(diào)節(jié)序列的表達構(gòu)建體。19.一種含有表達構(gòu)建體的細胞，構(gòu)建體中包括啟動子序列，編碼綠熒光蛋白質(zhì)的基因和存在于哺乳動物nestin基因的第二個內(nèi)含子中的調(diào)節(jié)序列。20.一種在動物器官或其區(qū)域中測量多能干和祖先細胞群體的方法，包括測量從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的器官或其區(qū)域中發(fā)熒光的細胞，轉(zhuǎn)基因哺乳動物的基因組中已經(jīng)整合了含有調(diào)節(jié)序列的DNA，調(diào)節(jié)序列是與編碼熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的多能干和祖先細胞中表達的，其中發(fā)熒光的細胞是多能干和祖先細胞。21.權(quán)利要求20所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中選擇性地表達的。22.權(quán)利要求20所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在神經(jīng)干和祖先細胞中表達的。23.權(quán)利要求20所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中調(diào)節(jié)序列包括哺乳動物nestin基因的第二個內(nèi)含子序列。24.權(quán)利要求20所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或其胚胎，其中調(diào)節(jié)序列進一步包括啟動子。25.權(quán)利要求24所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎，其中啟動子和調(diào)節(jié)序列是從同一哺乳動物的nestin基因中得到的。26.一種得到原初的，非培養(yǎng)的，多能干和祖先細胞的方法，包括從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎分離表達標記/報道分子蛋白質(zhì)的細胞，這些細胞的基因組中已經(jīng)整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)序列是與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的，其中編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎的多能干和祖先細胞中表達的。27.通過權(quán)利要求26的方法得到的細胞。28.一種從基因組中已經(jīng)整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎中得到原初，非培養(yǎng)的，多能干和祖先細胞的方法，其中調(diào)節(jié)序列是與編碼熒光蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的，編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎的多能干和祖先細胞中表達的。29.權(quán)利要求28所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎的多能干和祖先細胞中表達的。30.權(quán)利要求28所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其子代或胚胎中表達的。31.權(quán)利要求28所述的方法，其中調(diào)節(jié)序列含有哺乳動物nestin基因的第二個內(nèi)含子序列。32.權(quán)利要求28所述的方法，其中調(diào)節(jié)序列進一步包括啟動子。33.權(quán)利要求32所述的方法，其中啟動子和調(diào)節(jié)序列是從同一哺乳動物的nestin基因中得到的。34.權(quán)利要求28所述的方法，其中還包括鑒定和/或分離在所述的分離的熒光細胞中表達的基因。35.權(quán)利要求28所述的方法，其中還包括鑒定和/或分離在所述的熒光細胞中表達蛋白質(zhì)。36.權(quán)利要求28的方法，其中還包括鑒定和/或分離在所述的分離熒光細胞上表達的細胞特異表面抗原。37.權(quán)利要求28所述的方法，其中還包括將所述的分離的熒光細胞移植進活的動物或可存活的胚胎。38.權(quán)利要求28所述的方法，其中熒光細胞是通過熒光激活細胞分揀分離的。39.通過權(quán)利要求28所述的方法得到的細胞。40.一種評估化合物促進多能干和祖先細胞的分化的能力的方法，包括(a)將活的多能干和祖先細胞與待評估的化合物接觸，多能干和祖先細胞的基因組中整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，調(diào)節(jié)序列與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)基因可操作地連接，其中編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中表達的；(b)在存在化合物時，確定(a)的活細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量；(c)其中與活對照細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量比較，存在化合物時，活細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量的降低或缺乏是化合物促進多能干和祖先細胞分化的能力的證據(jù)。41.權(quán)利要求40所述的方法，其中標記/報道分子蛋白質(zhì)是熒光蛋白質(zhì)，標記/報道蛋白質(zhì)的測量是熒光。42.權(quán)利要求41所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中選擇性地表達的。43.權(quán)利要求41所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在神經(jīng)干和祖先細胞中表達的。44.權(quán)利要求40的方法，其中化合物是治療試劑。45.權(quán)利要求40所述的方法，其中分化是神經(jīng)干和祖先細胞。46.一種評估化合物對多能干和祖先細胞的毒性的方法，包括(a)將活的干和祖先細胞和待評估的化合物接觸，活的干和祖先細胞的基因組中已經(jīng)整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，調(diào)節(jié)序列與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因可操作地連接，其中編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中表達的；(b)確定在存在化合物時表達標記/報道分子蛋白質(zhì)的活細胞；和(c)將表達(b)的標記/報道分子蛋白質(zhì)的活細胞和活的，表達標記/報道分子的蛋白質(zhì)的對照細胞比較；其中，與表達標記/報道分子蛋白質(zhì)的活的對照細胞比較，存在化合物時表達標記/報道分子蛋白質(zhì)的活細胞的減少或缺乏是化合物對多能干和祖先細胞的毒性的證據(jù)。47.權(quán)利要求46所述的方法，其中標記/報道分子蛋白質(zhì)是熒光蛋白質(zhì)，表達標記/報道分子蛋白質(zhì)的細胞是熒光細胞。48.權(quán)利要求47所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中選擇性地表達的。49.權(quán)利要求47所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在神經(jīng)干和祖先細胞中表達的。50.一種評估化合物促進全能細胞分化成多能干和祖先細胞的能力的方法，包括(a)將活的全能干和祖先細胞和和待評估的化合物接觸，全能干和祖先細胞的基因組中已經(jīng)整合了含有哺乳動物nestin基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)序列是與編碼標記/報道分子的蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的，其中編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中表達的；(b)確定存在化合物時(a)的活細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量；和(c)將(b)的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量與對照細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量比較；其中與對照細胞的標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量比較，存在化合物時標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量的增加是化合物促進全能細胞分化成多能干和祖先細胞的能力的證據(jù)。51.權(quán)利要求50所述的方法，其中標記/報道分子蛋白質(zhì)是熒光蛋白質(zhì)，標記/報道分子蛋白質(zhì)的測量是熒光。52.權(quán)利要求51所述的方法，其中編碼熒光蛋白質(zhì)的基因是在多能干和祖先細胞中選擇性地表達的。53.權(quán)利要求51所述的方法，其中化合物是治療性試劑。全文摘要產(chǎn)生了非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，這些哺乳動物的基因組中摻入了哺乳動物的nestin基因的調(diào)節(jié)序列的DNA，調(diào)節(jié)序列是與編碼標記/報道分子蛋白質(zhì)的基因可操作地連接的。調(diào)節(jié)序列可以含有一個啟動子和存在于哺乳動物nestin基因中的第二個內(nèi)含子的序列。標記/報道分子蛋白質(zhì)優(yōu)選地是熒光蛋白質(zhì)，例如綠熒光蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)經(jīng)修飾以增強熒光。在非轉(zhuǎn)基因哺乳動物或其子代的器官中觀察到了多能的，和特別是，神經(jīng)干和祖先細胞群體。多能的干和祖先細胞可以從非人的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，子代或其胚，例如通過FACS，而不通過組織培養(yǎng)直接分離。文檔編號C12N15/09GK1411470SQ00817408公開日2003年4月16日申請日期2000年11月14日優(yōu)先權(quán)日1999年11月19日發(fā)明者格雷高里·N·艾妮科洛波夫,約翰·米格諾尼申請人:冷泉港實驗室