專利名稱：一種利用熒光蛋白作為熒光探針測量電離輻射下細(xì)胞氧化脅迫損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物和生化檢測領(lǐng)域，涉及對電離輻射引起細(xì)胞生化反應(yīng)及損傷的定量測量和評價(jià)，提出熒光蛋白作為定量測量細(xì)胞在輻射反應(yīng)中氧化脅迫產(chǎn)生自由基作用的內(nèi)源性熒光探針。
背景技術(shù)：
由于核技術(shù)在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用的迅速發(fā)展，相關(guān)的核安全以及電離輻射對生物及人類健康的影響日益受到關(guān)注，因此，人們迫切需要了解電離輻射對細(xì)胞損傷的機(jī)理并進(jìn)行輻射防護(hù)，這就要求對輻射作用生物(細(xì)胞)過程能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量的探測，目前還是一個(gè)正在嘗試解決的難題。一般地，電離輻射除了通過能量傳遞的直接作用外，主要通過對含水物質(zhì)的輻解反應(yīng)生成的各種自由基的間接作用對機(jī)體的損傷。在水輻射分解生成的各種一級自由基中，ROS(Reactive Oxygen Species)是最為重要的一種， 包括02_、· OH和H2O2，并且生成的ROS含量與細(xì)胞的輻射損傷程度存在一定的正相關(guān)性。 因此，準(zhǔn)確和定量測量輻射反應(yīng)中ROS作用是解決問題的關(guān)鍵技術(shù)之一。利用熒光探針可能成為一種有效的手段，因?yàn)樗梢詫?shí)時(shí)、高靈敏、定性和定量檢測ROS的含量；比如，美國 ^witrogen公司就可以提供各種在體外(in Vitro)鑒別自由基的熒光探針。進(jìn)一步，利用熒光探針檢測活體組織或細(xì)胞在電離輻射過程中生成的ROS這方面現(xiàn)在也有一些有益的嘗試；比如，朱茂祥等利用熒光探針的方法探測了 6tlCo Y射線照射誘發(fā)BEP2D細(xì)胞內(nèi)ROS 水平提高，得到初步的劑量效應(yīng)關(guān)系。但是，目前測量細(xì)胞內(nèi)ROS的各種光譜探針還存在許多不足，如易被光萃滅，易發(fā)生自氧化或被氧化，非特異性定位標(biāo)記及自身參與生物體反應(yīng)生成ROS等。如何避免上述缺點(diǎn)，從而在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對輻射引發(fā)的ROS產(chǎn)生和變化的檢測， 特別是對細(xì)胞中各個(gè)細(xì)胞器進(jìn)行特異性定位標(biāo)記、甚至能確定和識別DNA或蛋白質(zhì)具體位點(diǎn)，即尋求一種熒光性質(zhì)高效、靈敏、穩(wěn)定、準(zhǔn)確追蹤細(xì)胞輻射氧化脅迫產(chǎn)生ROS的熒光探針，并建立其熒光強(qiáng)度和ROS的定量化的關(guān)系，正是本發(fā)明的意義和目的所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用熒光蛋白作為熒光探針測量電離輻射下細(xì)胞氧化脅迫損傷的方法。本發(fā)明的內(nèi)容即是利用具有熒光性質(zhì)的天然或增強(qiáng)型的熒光蛋白作為活的組織或細(xì)胞在電離輻射過程中ROS(Reactive Oxygen Species)生成量的內(nèi)標(biāo)物或內(nèi)源性熒光探針，基于依據(jù)是熒光蛋白在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中的成功應(yīng)用和其熒光性質(zhì)的特殊優(yōu)點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)熒光蛋脅迫下與自由脅迫下與自由基作用而改變其熒光性質(zhì)，從而其熒光強(qiáng)度可作為輻射生化反應(yīng)中ROS含量的定量化指標(biāo)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案利用熒光蛋白作為熒光探針測量電離輻射下細(xì)胞氧化脅迫損傷的方法，包括下列步驟(1)利用一般分子生物學(xué)融合蛋白表達(dá)的方法或商業(yè)化的試劑對細(xì)胞中的電離輻射產(chǎn)生氧化脅迫敏感的細(xì)胞器進(jìn)行熒光蛋白靶向定位標(biāo)記；(2)對特異性表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞的電離輻照處理；(3)利用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光光譜儀對線粒體內(nèi)熒光蛋白的熒光強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量分析。所述的利用熒光蛋白作為熒光探針測量電離輻射下細(xì)胞氧化脅迫損傷的方法，所述的熒光蛋白選擇定位表達(dá)在對電離輻射敏感的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，對電離輻射產(chǎn)生自由基含量進(jìn)行定量化的測量，從而通過直接觀測蛋白熒光強(qiáng)度變化推測電離輻射對細(xì)胞具體部位的損傷。雖然熒光蛋白的熒光性質(zhì)較為穩(wěn)定，但因?yàn)樗且环N蛋白質(zhì)，其發(fā)光特性由蛋白構(gòu)象和其組成氨基酸性質(zhì)決定，而構(gòu)象和氨基酸又受ROS的作用和影響，所以，我們提出利用熒光蛋白作為定量化測量電離輻射損傷細(xì)胞的內(nèi)源性熒光探針的方案。依據(jù)原理如下(1)在R0S(主要為·0Η)作用下蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變并導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度減弱。 A. A. Alnuami等證實(shí)綠色熒光蛋白GFP在· OH作用下其自發(fā)熒光強(qiáng)度減弱，熒光減弱程度與暴露時(shí)間呈線性關(guān)系。進(jìn)一步，我們利用超聲作為ROS(主要為·0Η)產(chǎn)生源，證實(shí)了生成的ROS可引起GFP熒光強(qiáng)度的減弱(見附圖1)，并得到熒光強(qiáng)度隨ROS含量變化的規(guī)律。 這就證明GFP熒光強(qiáng)度確實(shí)可作為ROS含量的定量化指標(biāo)。(2)電離輻射對生物體作用可以通過直接和間接作用兩種途徑，其中通過自由基反應(yīng)的間接作用是主要作用方式；這是因?yàn)殡婋x輻射作用于水，可以產(chǎn)生反應(yīng)活性強(qiáng)的活性氧自由基和水合電子等
H2O^HO., H., e"，H0O0 2eq 2 2這些水的輻解反應(yīng)物進(jìn)一步作用于生物體(細(xì)胞)中的蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞膜等物質(zhì)從而產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)。(3)利用一般分子生物學(xué)方法或商業(yè)化的試劑對細(xì)胞內(nèi)多種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如線粒體、細(xì)胞膜等進(jìn)行熒光蛋白靶向定位標(biāo)記；對特異性表達(dá)GFP的細(xì)胞的輻照處理后產(chǎn)生 R0S;然后利用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光光譜儀等可以對細(xì)胞中輻射導(dǎo)致ROS 改變GFP的熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測和定量分析。本發(fā)明的有益效果與其它熒光探針相比，此熒光反應(yīng)不需外加的底物和輔助因子，只需紫外光或藍(lán)光激發(fā)，發(fā)射的熒光易于檢測，靈敏度高；熒光性質(zhì)穩(wěn)定，能耐受長時(shí)間光照，從而延長了可探測時(shí)間；在較大的PH范圍內(nèi)(pH 7-12)也能正常發(fā)光，對高溫、去垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶具有較強(qiáng)抗性；對細(xì)胞無毒害；不受假陽性干擾；構(gòu)建載體方便；表達(dá)沒有種屬、組織和位置特異性。


圖1超聲處理對綠色熒光蛋白GFP熒光強(qiáng)度的影響示意圖。其中功率=^W，熒光測定激發(fā)波長=488nm，狹縫寬度=2. 5nm。
具體實(shí)施例方式1、利用GFP靶向定位線粒體測量細(xì)胞在電離輻射早期ROS生成過程線粒體是細(xì)胞氧化磷酸化的場所，通過合成ATP為細(xì)胞的生命活動提供能量，在維持生物體正常生理功能方面起著非常重要的作用。作為唯一具有核外遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，其 直是輻射生物學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。線粒體是細(xì)胞內(nèi)源性ROS主要來源，呼吸鏈中約的氧經(jīng)旁路反應(yīng)生成氧自由基。當(dāng)細(xì)胞受到輻射損傷時(shí)，呼吸鏈?zhǔn)艿揭种?，電子傳遞鏈中漏出的電子增多并與氧生成更多的氧自由基。自由基的增加又可加重?fù)p傷線粒體內(nèi)各種生物大分子，降低氧化磷酸化功能，從而進(jìn)一步加劇線粒體內(nèi)自由基的生成。J. K. Leach 等證實(shí)線粒體呼吸鏈?zhǔn)禽椛渌录?xì)胞內(nèi)ROS生成的場所，呼吸鏈缺陷型細(xì)胞在輻射過程中生成的ROS含量與正常細(xì)胞相比明顯降低。所以實(shí)時(shí)、定量研究輻射早期線粒體中ROS生成量具有重要意義。其具體測量步驟如下(1)利用商業(yè)化試劑對細(xì)胞線粒體進(jìn)行GFP靶向標(biāo)記，方法見產(chǎn)品說明書。也可用一般分子生物學(xué)融合蛋白表達(dá)的方法對線粒體進(jìn)行靶向表達(dá)和標(biāo)記。(2)線粒體特異性表達(dá)GFP的細(xì)胞的電離輻照(Y射線輻照、荷能離子束輻照等)處理。(3)最后利用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光光譜儀等對線粒體內(nèi)GFP熒光強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測和定量分析。2、利用GFP靶向定位細(xì)胞膜測量細(xì)胞在電離輻射過程中ROS對細(xì)胞膜的損傷輻射生物學(xué)研究表明，細(xì)胞膜是僅次于DNA的輻射損傷的靶，對輻射非常敏感。水輻解生成的氧自由基可引起膜脂質(zhì)過氧化損傷，蛋白質(zhì)交聯(lián)與斷裂，膜流動性改變等。膜結(jié)構(gòu)的破壞將嚴(yán)重干擾代謝的方向性、有序性和協(xié)調(diào)性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。我們提出利用 GFP靶向定位于細(xì)胞膜可定點(diǎn)分析電離輻射過程中細(xì)胞膜ROS含量的變化及其對膜組分的損傷。
權(quán)利要求
1.一種利用熒光蛋白作為熒光探針測量電離輻射下細(xì)胞氧化脅迫損傷的方法，其特征在于包括下列步驟(1)利用一般分子生物學(xué)融合蛋白表達(dá)的方法或商業(yè)化的試劑對細(xì)胞中的電離輻射產(chǎn)生氧化脅迫敏感的細(xì)胞器進(jìn)行熒光蛋白靶向定位標(biāo)記；(2)對特異性表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞的電離輻照處理；(3)利用激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光光譜儀對線粒體內(nèi)熒光蛋白的熒光強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用熒光蛋白作為熒光探針測量電離輻射下細(xì)胞氧化脅迫損傷的方法，其特征在于所述的熒光蛋白選擇定位表達(dá)在對電離輻射敏感的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，對電離輻射產(chǎn)生自由基含量進(jìn)行定量化的測量，從而通過直接觀測蛋白熒光強(qiáng)度變化推測電離輻射對細(xì)胞具體部位的損傷。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用熒光蛋白作為熒光探針測量電離輻射下細(xì)胞氧化脅迫損傷的方法，利用熒光蛋白選擇定位表達(dá)在對電離輻射敏感的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，對電離輻射產(chǎn)生自由基含量進(jìn)行定量化的測量，從而通過直接觀測蛋白熒光強(qiáng)度變化推測電離輻射對細(xì)胞具體部位的損傷，本發(fā)明發(fā)射的熒光易于檢測，靈敏度高，熒光性質(zhì)穩(wěn)定，在較大的pH范圍內(nèi)也能正常發(fā)光，對高溫、去垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶具有較強(qiáng)抗性，對細(xì)胞無毒害，不受假陽性干擾，構(gòu)建載體方便，表達(dá)沒有種屬、組織和位置特異性。
文檔編號G01N21/64GK102230895SQ201110079510
公開日2011年11月2日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者余增亮, 柯志剛, 黃青 申請人:中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院