專利名稱：純化凝固蛋白的手段和實(shí)施其的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及純化可用作藥物的活性成分的凝固蛋白的領(lǐng)域。 現(xiàn)有技術(shù)凝固蛋白構(gòu)成藥物的有效成分已有很長時(shí)間。在用作藥物活性成分的凝固蛋白中，可特別提到因子VII、因子VIII、凝血酶或血管性血友病因子(von Willebrand factor)0直到最近，只能通過從人血漿中純化得到凝固蛋白。在過去幾年中，以重組蛋白的方式已得到一些凝固蛋白，這些重組蛋白在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的體液中，例如在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中產(chǎn)生。在所有情況下，包含凝固蛋白的待純化的起始材料由具有復(fù)雜構(gòu)成的材料組成， 其中目的蛋白和非常大量的物質(zhì)共同存在，這些物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、氨基酸、礦物鹽、細(xì)胞碎片和代謝廢物例如尿素、尿酸或膽紅素。因此，考慮到供人使用的藥物營銷所需要的健康和管理特性，開發(fā)純化凝固蛋白的方法是一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)?？梢岳斫?，在計(jì)劃用于預(yù)防或治療凝血疾病的藥物中，用作活性成分的凝固蛋白應(yīng)當(dāng)以高度純化的形式存在，并且不與能夠?qū)τ袡C(jī)體產(chǎn)生不利的不理想的物質(zhì)包括其他凝固蛋白、白蛋白、免疫球蛋白或上述蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物相關(guān)聯(lián)。純化多種凝固蛋白的方法是已知的，包括純化因子VIII、抗-凝血酶-III、纖溶酶原、因子VII或血管性血友病因子。所有已知方法包括一連串基于蛋白質(zhì)沉淀的步驟、通過層析基質(zhì)的步驟、接著是連續(xù)洗脫步驟、深層過濾步驟、超濾步驟或濃縮步驟的選擇-分離步驟。值得一提的是，開發(fā)純化凝固蛋白的方法需要長時(shí)間的研究和對連續(xù)中間產(chǎn)物的一致性的多次控制，以保證將得到的終產(chǎn)物具有高純度，為非修飾的形式，并且基本上不含不理想的物質(zhì)，無論這些方法完全是新的，或這些方法是已知方法的改良，甚至是微小的改良。特別地，對具有酶活性的凝固蛋白，例如因子VII、VIII和XI，純化的最終蛋白質(zhì)必須是非激活的。然而，在純化步驟的任一步中凝固蛋白傾向于被激活，包括在層析步驟中，如果沒有堅(jiān)持預(yù)設(shè)的設(shè)定狀態(tài)(例如濾器或使用的層析基質(zhì)的質(zhì)量、鹽濃度或溫度)的話。上面提及的至少部分解釋了為什么已知方法不包括基于下述原理的親和層析步驟，即目的凝固蛋白在嫁接在層析底物上的配體上的特異性固定，然后在層析洗脫液中回收純化的蛋白質(zhì)。在純化治療目的的蛋白質(zhì)的方法中缺乏親和層析純化步驟也可通過此技術(shù)的缺點(diǎn)解釋，其中觀察到嫁接在親和基質(zhì)上的配體分子的部分脫離，發(fā)現(xiàn)所述配體分子和純化的治療蛋白質(zhì)在洗脫液體積中相結(jié)合?？梢岳斫庠谟糜谥委熌系K的藥物中存在可能對有機(jī)體不利的層析基質(zhì)的組成物質(zhì)是被醫(yī)學(xué)條例所禁止的。盡管純化凝固蛋白的已知方法是符合要求的，在現(xiàn)有技術(shù)中需要替代方法或與先有方法相比改進(jìn)的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于選擇性結(jié)合凝固蛋白的親和基質(zhì)，其包含在其上固定了特異性結(jié)合所述凝固蛋白的核酸適配子(nucleic aptamer)的固體基質(zhì)材料。在一些實(shí)施方案中，所述核酸適配子由脫氧核糖核酸適配子組成。另外本發(fā)明的一個(gè)主題是在基質(zhì)上固定凝固蛋白的方法，其包括下述步驟，即使包含所述凝固蛋白的樣品與親和基質(zhì)接觸。本發(fā)明也涉及純化凝固蛋白的方法，其包括以下步驟a)使包含凝固蛋白的樣品與如上定義的親和基質(zhì)接觸，以在(i)在所述親和基質(zhì)上固定的核酸適配子和(ii)所述凝固蛋白之間形成復(fù)合物，和b)從在步驟a)中形成的復(fù)合物中釋放所述蛋白，和c)回收純化形式的所述凝固蛋白。本發(fā)明也涉及重組人凝固蛋白的純化組合物，其包含至少99. 9%以重量計(jì)的所述重組人蛋白質(zhì)，并且其基本上不含非人蛋白質(zhì)。附圖簡述

圖1顯示了在使用固定了抗-人FVII核酸適配子的親和基質(zhì)純化兔奶中產(chǎn)生的重組人因子VII的方法的實(shí)施中得到的層析譜。沿χ-軸時(shí)間；沿y_軸在254nm處的吸光度值(OD)。圖2表示隨時(shí)間變化的在^Onm處的吸光度測量值曲線。圖3是SDS PAGE電泳凝膠圖，其上具有能夠相對定量條帶的考馬斯亮藍(lán)染色。在圖3中凝膠從左至右的泳道表示以下初始產(chǎn)物的遷移結(jié)果，圖從左至右為-泳道‘‘2”或‘iMD"初始組合物Betafact ,
-泳道‘‘3”或‘‘NR”對應(yīng)圖2的層析譜的1號峰的非留存部分，
-泳道‘‘4” 或‘ 1”對應(yīng)圖2的層析譜的2號峰的洗脫部分。 圖4表示隨時(shí)間變化的在^Onm處的吸光度測量值曲線。 圖5是SDS PAGE電泳凝膠圖。在圖5中凝膠從左至右的泳道表示以下初始產(chǎn)物
的遷移結(jié)果-泳道“E5”通過MEP HyperCel層析步驟純化的包含轉(zhuǎn)基因人因子IX的轉(zhuǎn)基因母豬奶的初始組合物，-泳道‘ 6”對應(yīng)圖4的層析譜的1號峰的非留存部分，-泳道“E7”對應(yīng)圖4的層析譜的2號峰的洗脫部分，-泳道‘ 8”對應(yīng)圖4的層析譜的3號峰的再生部分，-泳道“TFIX” 純化的人血漿因子IX對照。 圖6表示隨時(shí)間變化的在^Onm處的吸光度測量值曲線。在圖6中，1號峰對應(yīng)未在柱中留存的初始產(chǎn)物的部分。2號峰對應(yīng)洗脫部分。圖7表示初始產(chǎn)物和洗脫產(chǎn)物的凝膠圖，通過SDS PAGE分析和硝酸銀染色以顯現(xiàn)雜質(zhì)的消除1號泳道對應(yīng)初始產(chǎn)物，2號泳道對應(yīng)洗脫部分。盡管初始產(chǎn)物具有相當(dāng)高的純度，值得一提的是洗脫部分不再包含任何污染物或降解的形式。圖8表示Mapt2固定適配子與轉(zhuǎn)基因兔奶中產(chǎn)生的重組人因子VII的結(jié)合曲線。箭頭對應(yīng)不同注射的時(shí)間，在圖8上從左至右分別為1 重組因子VII的注射；2 包含IM NaCl的緩沖液的注射；3 包含2M NaCl的緩沖液的注射；4 包含3M NaCl的緩沖液的注射； 5 包含IOmM EDTA的50mM Tris緩沖液的注射。沿χ-軸時(shí)間，以秒表示；沿y_軸響應(yīng)信號的值，以任意單位(RU)表示。圖9表示Mapt2固定適配子與轉(zhuǎn)基因兔奶中產(chǎn)生的重組人因子VII的結(jié)合曲線。 箭頭對應(yīng)不同注射的時(shí)間，在圖9上從左至右分別為1 :50%丙二醇；2 =IOmM的EDTA。發(fā)明詳述在長時(shí)間的研究后，申請者開發(fā)了純化凝固蛋白的方法，其包括層析步驟，其中目的蛋白與預(yù)固定在層析基質(zhì)上的配體特異性結(jié)合，并然后釋放留存在所述基質(zhì)上的目的蛋白質(zhì)，回收洗脫液中的純化蛋白質(zhì)。更具體地，根據(jù)本發(fā)明，提供了用于純化凝固蛋白的方法，其包括目的凝固蛋白與上面固定了特異性結(jié)合所述目的蛋白質(zhì)的核酸適配子的基質(zhì)結(jié)合的步驟，和其后的回收所述純化的目的蛋白質(zhì)的步驟。令人驚訝地，根據(jù)本發(fā)明已顯示在其上固定了特異性針對目的凝固蛋白的核酸適配子(即以包含這樣的核酸適配子的固定化合物的形式)的親和層析基質(zhì)可成功地用于得到可用作藥物活性成分的凝固蛋白的方法。本發(fā)明涉及選擇性結(jié)合凝固蛋白的親和基質(zhì)，其包含在其上固定了特異性結(jié)合所述凝固蛋白的核酸適配子(即以包含這樣的核酸適配子的固定化合物的形式)的固體基質(zhì)材料。特異性結(jié)合目的凝固蛋白的核酸適配子分子以及包含這些核酸適配子的化合物構(gòu)成了所述固體基質(zhì)材料攜帶的特異性結(jié)合所述靶蛋白質(zhì)的位點(diǎn)。術(shù)語“核酸適配子”包含具有5-120個(gè)核苷酸長度的單鏈核酸，且其特異性結(jié)合凝固蛋白。措辭“包含核酸適配子的化合物”也包含下述化合物，其在結(jié)構(gòu)中包含上面定義的所述核酸。因此，包含特異性結(jié)合人或哺乳動物凝固蛋白的脫氧核糖核酸的化合物包含下述化合物，其中所述核酸被包含在含有生物素分子的結(jié)構(gòu)中。根據(jù)本發(fā)明已顯示如上定義的親和基質(zhì)能夠有效固定目的凝固蛋白，其在本說明書中也可被稱為“靶蛋白質(zhì)”。如上定義的親和基質(zhì)具有吸附靶蛋白質(zhì)的高容量，因?yàn)槭构腆w基質(zhì)接觸包含待純化的凝固蛋白的液體溶液使固體基質(zhì)攜帶的靶位點(diǎn)飽和至少50%成為可能。根據(jù)本發(fā)明也已顯示，與核酸適配子分子特異性結(jié)合的凝固蛋白可隨后以至少 75%的良好產(chǎn)量從親和基質(zhì)上被洗脫。此外，已顯示本發(fā)明的親和基質(zhì)對目的凝固蛋白具有高特異性，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)所述凝固蛋白可具有相對洗脫液中包含的蛋白質(zhì)總重量高達(dá)以重量計(jì)99. 95%的范圍的純度。如在實(shí)施例中所說明的，使用包含高純度的靶凝固蛋白(例如相對所述初始產(chǎn)物中包含的蛋白質(zhì)總重量以重量計(jì)超過98% )的組合物作為初始產(chǎn)物，使用根據(jù)本發(fā)明的親和基質(zhì)，目的凝固蛋白的純度可進(jìn)一步得到2個(gè)數(shù)量級的提高。值得一提的是包括當(dāng)在初始產(chǎn)物中存在的雜質(zhì)具有與希望純化的靶凝固蛋白非常接近的結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)特性時(shí)，在純度中也能得到這樣的提高。也已顯示本發(fā)明的親和基質(zhì)使純化基本序列截然不同的凝固蛋白，例如人因子VII和人因子IX成為可能。也已顯示本發(fā)明的親和基質(zhì)使從復(fù)雜組合物的初始介質(zhì)(例如富含人因子IX的血漿組合物和來自人因子IX轉(zhuǎn)基因動物的奶)中純化凝固蛋白成為可能，且所述親和基質(zhì)具有與所述目的凝固蛋白結(jié)合的高特異性。也已顯示本發(fā)明的親和基質(zhì)使從也包含非人直向同源蛋白質(zhì)的初始介質(zhì)中選擇性純化人凝固蛋白成為可能，例如從人因子IX轉(zhuǎn)基因動物的奶中，所述奶也包含由所述轉(zhuǎn)基因動物天然產(chǎn)生的因子IX，由所述轉(zhuǎn)基因動物天然產(chǎn)生的所述因子IX(或內(nèi)源FIX)可為例如豬FIX。也已顯示本發(fā)明的親和基質(zhì)使從也包含非人直向同源蛋白質(zhì)的初始介質(zhì)中選擇性純化人凝固蛋白成為可能，例如從人因子VII轉(zhuǎn)基因動物的奶中，所述奶也包含由所述轉(zhuǎn)基因動物天然產(chǎn)生的因子VII，由所述轉(zhuǎn)基因動物天然產(chǎn)生的所述因子FVII (或內(nèi)源 FVII)可為例如兔FVII。重要地，已顯示特別是對于從復(fù)雜組合物(例如血漿或所述目的凝固蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動物的體液)中純化目的凝固蛋白，得到本發(fā)明的親和基質(zhì)的上述高吸附能力、良好產(chǎn)量和高特異性的特征。也已顯示核酸適配子在固體基質(zhì)上的固定是不可逆的和長效的，因?yàn)樵谙疵撘喝芤褐形礄z測到從基質(zhì)上脫離的核酸適配子的存在。特別地，已顯示本發(fā)明的親和基質(zhì)可通過在洗脫后去除保持與基質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)被“再生”非常多次而沒有顯著的下述損傷(i)其對靶凝固蛋白的吸附能力，(ii)其針對所述靶蛋白質(zhì)的特異性，或(iii)對固定在固體基質(zhì)材料上的核酸適配子的不進(jìn)行釋放。 此外，可根據(jù)已知技術(shù)和使用已知再生試劑，例如尿素實(shí)施本發(fā)明的親和基質(zhì)的再生。核酸用作目的凝固蛋白的配體具有許多優(yōu)勢。由于其寡核苷酸的性質(zhì)，適配子具有弱免疫原性和對嚴(yán)格物理化學(xué)條件(尿素、DMS0、極酸或極堿的pH的存在，使用有機(jī)溶劑或高溫)的高抗性，在用作親和配體的情況下，這允許多種用于控制健康安全，特別是有關(guān)病毒或非常規(guī)病原體的安全的策略。此外，它們具有高度的選擇性。最后，如已經(jīng)提及的， 適配子的生產(chǎn)涉及相對有限的成本。因此，本發(fā)明的親和基質(zhì)的上述特征的組合使所述親和基質(zhì)能夠被用作純化凝固蛋白的手段，因?yàn)?所述親和基質(zhì)使實(shí)施純化具有非常高純度的凝固蛋白的方法成為可能。-所述親和基質(zhì)未被檢測到釋放不理想的物質(zhì)，特別是未檢測到核酸適配子分子釋放至包含純化的凝固蛋白的洗脫液的溶液中。-核酸適配子分子的可能脫離不導(dǎo)致有關(guān)人健康的缺點(diǎn)，-當(dāng)凝固蛋白具有酶活性時(shí)，目的凝固蛋白在親和基質(zhì)上的結(jié)合和然后洗脫不導(dǎo)致所述凝固蛋白以可檢測得到的量的形成激活形式，-生產(chǎn)所述親和基質(zhì)相對便宜，這特別歸功于核酸適配子生產(chǎn)的低成本，和-所述親和基質(zhì)用于純化凝固蛋白的使用自身相對便宜，這歸功于所述基質(zhì)的長壽命，特別因?yàn)槠湓偕啻蔚目赡苄裕统掷m(xù)長時(shí)間。此外，如已經(jīng)提及的，在從構(gòu)成復(fù)雜的介質(zhì)中，特別是從工業(yè)規(guī)模上常規(guī)使用的介質(zhì)，例如人血漿或培養(yǎng)基或包含所述目的蛋白質(zhì)的生物液中純化的方法中，本發(fā)明的親和基質(zhì)能夠以可逆的方式選擇性結(jié)合靶凝固蛋白并具有良好的產(chǎn)量和良好的特異性。此外，如在本說明書中稍后將詳細(xì)說明的，本發(fā)明的親和基質(zhì)適于處理大體積的包含目的凝固蛋白的溶液。本發(fā)明的親和基質(zhì)因此構(gòu)成純化凝固蛋白的工具，其極佳地適于在工業(yè)規(guī)模上使用。根據(jù)本發(fā)明的親和基質(zhì)的其他優(yōu)勢將稍后在本說明書中詳細(xì)說明，或者涉及親和基質(zhì)自身的描述，或者涉及純化凝固蛋白的方法，其中使用所述親和基質(zhì)。就申請者所知，本發(fā)明首次描述了包含固定化核酸適配子的親和基質(zhì)，用于在工業(yè)規(guī)模上使用的條件下純化凝固蛋白。此外，特異性針對凝血酶、針對因子VII和針對因子 IX的多種核酸適配子是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(見PCT申請?zhí)朩O 02/26932)。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“選擇性結(jié)合”旨在指通過使親和基質(zhì)接觸合適組成的溶液(其也可被稱為洗脫溶液)，使目的凝固蛋白與親和基質(zhì)的固定化核酸成分的特異性非共價(jià)結(jié)合，所述結(jié)合是可逆的，在所述親和基質(zhì)上所述核酸和所述目的蛋白質(zhì)之間形成非共價(jià)復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“凝固蛋白”旨在指在導(dǎo)致血凝塊形成的級聯(lián)反應(yīng)鏈中涉及的任意蛋白質(zhì)。凝固蛋白包含因子I (纖維蛋白原)、因子II (凝血酶原)、因子V(前加速素)、 因子VII (前轉(zhuǎn)變素)、因子VIII (抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或PTA)、因子XII (Hageman因子)、因子XIII (纖維蛋白穩(wěn)定因子或FSF)、PK (前激肽釋放酶)、HMWK (高分子量激肽原)、組織促凝血酶原激酶、肝素輔因子II (HCII)、蛋白質(zhì)C(PC)、凝血調(diào)節(jié)蛋白(TM)、蛋白質(zhì)S(PS)、血管性血友病因子 (vffF)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)，或其他組織因子。在一些實(shí)施方案中，凝固蛋白由具有酶活性的凝固蛋白組成。具有酶活性的凝固蛋白包括因子II (凝血酶原)、因子VII (前轉(zhuǎn)變素)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或PTA)、因子 XII (Hageman因子)、因子XIII (纖維蛋白穩(wěn)定因子或FSF)、PK (前激肽釋放酶)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，凝固蛋白由天然或重組人凝固蛋白組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，凝固蛋白是天然或重組人因子VII。通常，在其上可固定本發(fā)明的適配子的固體基質(zhì)包括具有通常在過濾基質(zhì)、膜等中可見的結(jié)構(gòu)和組成的任意類型的基質(zhì)。固體基質(zhì)特別包括樹脂、親和層析柱樹脂、聚合物珠、磁珠、順磁性珠、過濾膜的基質(zhì)材料，等等。固體基質(zhì)也特別包括基于玻璃或金屬的材料，例如鋼、金、銀、鋁、銅、硅、玻璃或陶瓷。固體基質(zhì)也特別包括聚合物材料，例如聚乙烯、 聚丙烯、聚酰胺、聚偏乙烯及其組合。在一些實(shí)施方案中，固體基質(zhì)上可包被便于和適配子、或和包含所述適配子的化合物連接、結(jié)合、形成復(fù)合體、固定或相互作用的材料。在一些實(shí)施方案中，固體基質(zhì)是玻璃載片，其表面覆蓋金層，已經(jīng)過羧甲基化處理的層，葡聚糖層，膠原層，抗生物素蛋白層，鏈霉抗生物素層，等等。這樣，根據(jù)本發(fā)明的適配子，或根據(jù)本發(fā)明的包含所述適配子的化合物可通過例如上述附著涂料的方式，被固定在固體基質(zhì)上，或者通過生成共價(jià)鍵的化學(xué)反應(yīng)，或者通過經(jīng)非共價(jià)鍵的連接，例如氫鍵、靜電力、范德華力，等等。實(shí)施例描述了根據(jù)本發(fā)明的親和基質(zhì)的實(shí)施方案，其中核酸適配子通過包含結(jié)構(gòu)中其的化合物經(jīng)非共價(jià)鍵固定在固體基質(zhì)材料上。在實(shí)施例中，特別描述了包含在其表面嫁接鏈霉抗生物素分子的固體基質(zhì)材料的親和基質(zhì)，在包含適配子的化合物結(jié)構(gòu)中包含的核酸適配子在其一端與生物素分子偶聯(lián)， 并且所述適配子通過基質(zhì)材料的鏈霉抗生物素分子和包含所述核酸適配子的化合物的生物素分子之間的非共價(jià)固定化固定在所述固體基質(zhì)材料上。在實(shí)施例中，描述了包含在其上嫁接鏈霉抗生物素分子的基質(zhì)材料的親和基質(zhì)的一個(gè)實(shí)施方案。這些固體基質(zhì)材料是容易商業(yè)獲得的。措辭“特異性結(jié)合凝固蛋白的核酸”或“適配子”或“核酸適配子”旨在指具有結(jié)合給定目的凝固蛋白的能力的DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)分子，所述能力比結(jié)合任意其他蛋白質(zhì)的能力更強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的親和基質(zhì)的成分核酸適配子具有結(jié)合給定人凝固蛋白的能力，所述能力比結(jié)合任意其他的人蛋白質(zhì)的能力更強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸適配子特別具有結(jié)合給定人凝固蛋白的能力，所述能力比結(jié)合任意其他由非人哺乳動物基因組編碼的同源蛋白質(zhì)的能力更強(qiáng)。例如， 特異性針對人因子VII的核酸適配子具有結(jié)合人因子VII的能力，所述能力比結(jié)合來源于非人哺乳動物的因子VII，包括兔因子VII的能力更強(qiáng)。用于本說明書的目的，當(dāng)通過使用上述結(jié)合檢測技術(shù)中的任一種和在相同檢測條件下，用第一種核酸得到的結(jié)合信號值相比用第二種核酸得到的在統(tǒng)計(jì)上顯著更高時(shí)，第一種核酸具有比等效質(zhì)量的第二種核酸更強(qiáng)的結(jié)合人因子Vll/VIIa的能力。例如，當(dāng)使用的結(jié)合檢測技術(shù)是Biaeore 技術(shù)時(shí)，當(dāng)?shù)谝环N核酸的共振信號值比測量的第二種核酸的共振信號值在統(tǒng)計(jì)上顯著更高時(shí)(與表示的共振測量單位無關(guān))，第一種核酸具有比等效質(zhì)量的第二種核酸更強(qiáng)的結(jié)合人因子Vll/VIIa的能力。2個(gè)“在統(tǒng)計(jì)上”有差異的測量值包括彼此具有大于使用的結(jié)合檢測技術(shù)的測量誤差的差異的2個(gè)值。優(yōu)選地，本發(fā)明的親和基質(zhì)的核酸適配子對靶凝固蛋白具有強(qiáng)親和力。優(yōu)選地，所述核酸適配子對所述靶凝固蛋白具有小于500nM的Kd值。Kd值可根據(jù)Biaeore 技術(shù)測量。例如，已顯示包含SEQ ID No 86序列的核酸適配子具有結(jié)合人因子Vll/VIIa的能力，所述能力比其結(jié)合任意來源于非人哺乳動物的因子Vll/VIIa的能力顯著更強(qiáng)。特別地，盡管SEQ ID No 86序列的核酸具有結(jié)合任意類型的人因子Vll/VIIa，包括天然因子 Vll/VIIa或重組因子Vll/VIIa的強(qiáng)能力，其結(jié)合由非人哺乳動物基因組編碼的因子VII/ Vila，包括兔因子Vll/VIIa的能力弱或無能力。更具體地，對包含SEQ id No 86序列的適配子，根據(jù)Biacore 技術(shù)已測定出結(jié)合人因子Vll/VIIa的能力的值為約100nM(以解離常數(shù)Kd表示)。此外，所述核酸適配子對人血漿因子Vll/VIIa和對重組人因子Vll/VIIa(例如在轉(zhuǎn)基因兔中產(chǎn)生的)二者具有相同的結(jié)合能力。已顯示SEQ ID No 86序列的核酸和人因子Vll/VIIa之間形成的復(fù)合物是化學(xué)計(jì)量的，即形成復(fù)合物的SEQ ID No 86序列的核酸的分子數(shù)與人因子Vll/VIIa的分子數(shù)的比例為約1 1，且可特別地為1 1。如已經(jīng)在上面提到的，本發(fā)明的親和基質(zhì)可在純化由非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物產(chǎn)生的重組人凝固蛋白的方法的步驟中使用。在純化凝固蛋白的方法的這些實(shí)施方案中，復(fù)雜的初始介質(zhì)包括與大量蛋白質(zhì)混合的重組人蛋白質(zhì)，所述大量蛋白質(zhì)由所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物天然產(chǎn)生，其中視情況而定包括與重組人蛋白質(zhì)同源的凝固蛋白?？梢岳斫?，在這些實(shí)施方案中，本發(fā)明的親和基質(zhì)的成分核酸適配子選擇性結(jié)合目的人蛋白質(zhì)、而在相同操作條件下不結(jié)合由非人哺乳動物天然產(chǎn)生的同源蛋白質(zhì)是有利的。在本發(fā)明的親和基質(zhì)的成分核酸適配子的這些特定實(shí)施方案中，所述適配子“特異性”結(jié)合目的人凝固蛋白的能力也可被表示為分別針對人蛋白質(zhì)和針對非人哺乳動物同源蛋白質(zhì)的解離常數(shù)Kd的比例。根據(jù)本發(fā)明的親和基質(zhì)的成分核酸適配子的另一個(gè)特征，所述核酸適配子特異性結(jié)合人凝固蛋白的能力也可被表示為以下條件(A)人Kd/非人 Kd < 0.01(A)，其中-“人Kd”是核酸適配子針對所述人蛋白質(zhì)的解離常數(shù)，以摩爾單位表示，和-“非人Kd”是所述核酸適配子針對所述非人同源蛋白質(zhì)的解離常數(shù)，以相同的摩爾單位表示。優(yōu)選地，為了在純化重組人凝固蛋白的方法中最佳使用本發(fā)明的親和基質(zhì)，也可通過人Kd/非人Kd的比例小于0. 005定義特異性結(jié)合所述重組人蛋白質(zhì)的核酸適配子。本發(fā)明的親和基質(zhì)的成分核酸適配子可根據(jù)名為SELEX的技術(shù)制備。使用的術(shù)語“適配子”包括能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的單鏈核酸，DNA或RNA分子。適配子通常包括 5-120個(gè)之間的核苷酸并可根據(jù)名為SELEX(通過指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)進(jìn)化)的方法在體外選擇，其最初在PCT申請?zhí)朩O 1991/019813中詳細(xì)描述。選擇適配子的SELEX方法由下述步驟組成使蛋白質(zhì)與核酸、DNA或RNA的組合文庫(一般為1015個(gè)分子)接觸；去除不結(jié)合靶的核酸，分離和擴(kuò)增結(jié)合靶的核酸。重復(fù)此方法直到溶液中富集了足夠的對目的蛋白質(zhì)具有良好親和力的核酸(Tuerk和Gold，“Systematic evolution of ligands by exponential enrichment :RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase" (1990) Science,249 (4968) :505-10 禾口 Ellington 禾口 Szostak，“Invitro selection of RNA molecules that bind specific ligands”，(1990)Nature Aug 30 ；346 (6287) :818-22)。 其他 SELEX 方法的實(shí)例在文件 EP 0 786 469, EP 668 931, EP 1 695 978 和 EP 1 493 825 中給出，其中的教導(dǎo)可重現(xiàn)以實(shí)施選擇根據(jù)本發(fā)明使用的核酸適配子的方法。為了在純化人因子Vll/VIIa的手段中使用，特異性結(jié)合目的凝固蛋白的核酸優(yōu)選地被包含在化學(xué)結(jié)構(gòu)(在本說明書中又稱“化合物”)中，其也包含間隔手段，且在適當(dāng)時(shí)包含在固體基質(zhì)上固定的手段。在一些實(shí)施方案中，核酸適配子被包含在以下通式(I)的化合物的結(jié)構(gòu)中[FIX]x-[SPACJy-[APT] (I)，其中:-[FIX]表示用于固定在基質(zhì)上的化合物，-[SPAC]表示間隔鏈，-[APT]表示特異性結(jié)合凝固蛋白的核酸，又稱核酸適配子，-χ是等于0或1的整數(shù)，和_y是等于0或1的整數(shù)。
在通式(I)的化合物的一些實(shí)施方案中，[APT]由SEQ ID No 86序列的脫氧核糖核酸組成。在通式(I)的化合物中以[SPAC]表示的“間隔鏈”可為任意已知類型。所述間隔鏈具有以下功能，即物理性間隔核酸和在其上固定所述化合物的固體基質(zhì)表面，及賦予核酸相對可固定于其上的固體基質(zhì)的表面的相對移動性。間隔鏈限制或阻止由于固體基質(zhì)和核酸彼此距離過近造成的立體障礙，距離過近阻礙所述核酸和可能與所述核酸分子接觸的凝固蛋白分子之間的結(jié)合事件。在通式(I)的化合物中間隔鏈優(yōu)選地結(jié)合在適配子核酸的5’端或3’端。有利地，間隔鏈同時(shí)結(jié)合適配子的一端和固體基質(zhì)。具有間隔鏈的此構(gòu)造具有不直接在固體基質(zhì)上固定適配子的優(yōu)勢。優(yōu)選地，間隔鏈?zhǔn)欠翘禺愋怨押塑账峄蚓垡叶?(PEG)。當(dāng)間隔鏈由非特異性寡核苷酸組成時(shí)，所述寡核苷酸有利地包含至少5個(gè)核苷酸的長度，優(yōu)選5-15個(gè)核苷酸之間的長度。在間隔鏈由聚乙二醇組成的通式(I)的化合物的實(shí)施方案中，所述間隔鏈包含 PEG(C18)類型的聚乙二醇，例如由Sigma Aldrich公司出售的PEG(C18)。為了在間隔鏈上固定適配子，可使用多種化學(xué)基團(tuán)化學(xué)修飾核酸，例如能共價(jià)固定所述核酸的基團(tuán)，例如硫醇、胺或能夠與固體基質(zhì)上存在的化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)的任意其他基團(tuán)。在通式(I)的化合物中，化合物[FIX]由選自下述的化合物組成(i)能夠與固體基質(zhì)材料形成一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵的化合物和(ii)能夠通過弱非共價(jià)鍵，包括氫鍵、靜電力或范德華力特異性結(jié)合固體基質(zhì)的化合物。化合物[FIX]的第一種類型包含雙功能偶聯(lián)劑，例如戊二醛，SIAB或SMCC。SIAB,由Hermanson G. T. (1996,Bioconjugate techniques,San Diego :Academic Press, pp 239-242)描述，是下面通式(I)的化合物
權(quán)利要求
1.選擇性結(jié)合凝固蛋白的親和基質(zhì)，其包含在其上固定了特異性結(jié)合所述凝固蛋白的核酸適配子的固體基質(zhì)材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的親和基質(zhì)，其特征在于所述核酸適配子由脫氧核糖核酸適配子組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的親和基質(zhì)，其特征在于所述核酸適配子被包括在以下通式 (I)的化合物的結(jié)構(gòu)中[FIX]x-[SPACJy-[APT] (I)，其中:-[FIX]表示用于固定在基質(zhì)上的化合物，-[SPAC]表示間隔鏈，-[APT]表示特異性結(jié)合凝固蛋白的核酸，-χ是等于0或1的整數(shù)，和-y是等于0或1的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的親和基質(zhì)，其特征在于，在通式⑴的化合物中，[APT]由SEQID No. 1序列的脫氧核糖核酸組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的親和基質(zhì)，其特征在于所述凝固蛋白選自因子I(纖維蛋白原)、因子II (凝血酶原)、因子V(前加速素)、因子VII (前轉(zhuǎn)變素)、因子VIII (抗血友病因子A)、因子IX (抗血友病因子B)、因子X (司徒因子)、因子XI (Rosenthal因子或 PTA)、因子XII (Hageman因子)、因子XIII (纖維蛋白穩(wěn)定因子或FSF) ,PK(前激肽釋放酶)、 HMWK(高分子量激肽原)、組織促凝血酶原激酶、肝素輔因子II (HCII)、蛋白質(zhì)C(PC)、凝血調(diào)節(jié)蛋白(TM)、蛋白質(zhì)S(PS)、血管性血友病因子(vWF)和組織因子途徑抑制劑(TFPI)，或其他組織因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的親和基質(zhì)，其特征在于所述固體基質(zhì)材料選自樹脂、 聚合物珠、磁珠、順磁性珠、過濾膜的基質(zhì)材料和聚合物材料。
7.在基質(zhì)上固定凝固蛋白的方法，其包括以下步驟，其中使包含所述凝固蛋白的樣品接觸根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的親和基質(zhì)。
8.純化凝固蛋白的方法，其包括以下步驟a)使包含凝固蛋白的樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的親和基質(zhì)接觸，以在(i) 在所述親和基質(zhì)上固定的核酸適配子和(ii)所述凝固蛋白之間形成復(fù)合物，和b)從在步驟a)中形成的復(fù)合物中釋放蛋白質(zhì)，和c)回收純化形式的所述凝固蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述樣品選自人血漿、或人血漿部分、或所述凝固蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶、或所述奶的部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其特征在于所述血漿蛋白質(zhì)是人的。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述樣品包含至少一種非人血漿蛋白質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述人血漿蛋白質(zhì)與所述非人血漿蛋白質(zhì)是同源的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述人血漿蛋白質(zhì)是所述非人血漿蛋白質(zhì)的同系物。
14.根據(jù)權(quán)利要求8至13任一項(xiàng)的方法，其特征在于通過使所述親和基質(zhì)接觸含有二價(jià)離子螯合劑、優(yōu)選EDTA的洗脫緩沖液進(jìn)行步驟b)。
15.重組人凝固蛋白的純化組合物，其包含以重量計(jì)至少99.9%的所述重組人蛋白質(zhì)，且其基本上不含非人蛋白質(zhì)。
16.包含根據(jù)權(quán)利要求15的重組人凝固蛋白的純化組合物的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及選擇性結(jié)合凝固蛋白的親和基質(zhì)，其包含在其上固定了特異性結(jié)合所述凝固蛋白的核酸適配子的固體基質(zhì)。
文檔編號C07K1/22GK102405288SQ201080017046
公開日2012年4月4日 申請日期2010年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月19日
發(fā)明者G·佩雷, M·諾格雷 申請人:Lfb生物技術(shù)公司