專利名稱：端粒酶活性抑制蛋白的制備和純化的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和生物化學工程領域。更具體地說，本發(fā)明涉及采用基因重組技術(shù)制備端粒酶活性抑制蛋白的方法，該方法可以高效地和大規(guī)模地制備高純度和高生物學活性的端粒酶活性抑制蛋白。
背景技術(shù)：
端粒酶(Telomerase)是一種合成和延伸細胞染色體端粒的核糖核蛋白，它包含兩種基本成分逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基hTERT和RNA組分hTR。端粒酶能以自身RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成端粒重復列，加到染色體的末端，以彌補細胞分裂時端粒DNA的丟失，維持端粒的長度。
研究表明，在正常人體細胞內(nèi)端粒酶活性幾乎檢測不到，因此，人正常體細胞分裂次數(shù)是有限的，細胞每分裂一次，端粒便丟失50-200bp，當端?？s短到一定程度時細胞生長受到抑制，即稱為細胞衰老，并走向死亡。
然而，在絕大多數(shù)惡性腫瘤細胞(85％)中普遍可以檢測到端粒酶活性且活性較強，端粒酶對端粒的重新合成補償了它在細胞繁殖過程中的持續(xù)丟失，從而使得細胞可以不斷的分裂，這是細胞永生化和癌變的一個重要機制。
Kim等分析總結(jié)了大量研究結(jié)果，檢測了100多種惡性腫瘤標本，指出端粒酶診斷腫瘤的敏感性為85％，特異性為91％，陽性預測值為91％，陰性預測值為81％，充分表明端粒酶在腫瘤診斷中的價值(Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells andcancer.Science.1994 Dec 23；266(5193)2011-5.)。并認為端粒酶被激活是發(fā)生惡性腫瘤的主要因素之一，其激活及表達程度與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關，抑制端粒酶并使端粒縮短被認為是抑制癌細胞的一種機制，因此端粒酶成為腫瘤靶向治療的理想靶點。
目前，以端粒酶為靶點的腫瘤治療研究，主要采用了針對端粒酶RNA組分的反義核酸技術(shù)(Kondo S.，Kondo Y.，Li G.，et al，Targeted therapy of humanmalignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomeraseRNA.Oncogene，1998，163323-3330.Ludwig A，Saretzki G，Holm PS，et al.Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizes breast epithelial cells toinhibitors of topoisomerase.Cancer Res，2001，613053-3061；Feng J.，F(xiàn)unk W.D.，Wang S.S.，et al.The RNA component of human telomerase，Science，1995，2691236-1241)、基因治療技術(shù)、切割端粒酶mRNA的核酶技術(shù)(Ludwig A，Saretzki G，Holm PS，et al.Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizesbreast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase.Cancer Res，2001，613053-3061)和抑制端粒酶基因轉(zhuǎn)錄活性的技術(shù)等(Meyerson，M.Counter C.M.，EatonE.N.，et al.hEST2，the putative human telomerase catalytic subunit gene，is up-regulated in tumor cells and during immortalization，Cell，1997，90785-795；W.C.Hahn，S.A.Stewart，M.W.Brooks，S.G.York，E.Eaton，A.Kurachi，R.L.Beijersbergen，J.H.Knoll，MMeyerson，R.A.Weinberg，Inhibition of telomeraselimits the growth of human cancer cells，Nat.Med，1999，5164-1170)。這些技術(shù)可以使腫瘤細胞的端?？s短，進而使細胞進入危機期或者死亡，或者使腫瘤細胞的致瘤性顯著下降。
LPGENE是一種具有抑制腫瘤細胞的端粒酶活性的蛋白，它是一類新的蛋白質(zhì)制劑，有重要的應用前景。LPGENE蛋白是由LPTS(Liver putative tumorsuppressor，LPTS)基因編碼，該基因是本發(fā)明人利用定位克隆的方法從人的正常肝cDNA文庫中得到的一個肝相關的候選抑癌新基因(C.Liao，M.J.Zhao，H.Song，K.Uchida，K.K.Yokoyama，T.P.Li，Identification of the gene for a novelliver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of heterozygosityregion of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma.Hepatology 32(2000)721-727)。該基因編碼的蛋白具有抑制細胞端粒酶的活性(Zhou X.Z.，LuK.P..The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor.Cell，2001，107，347-359)。LPTS基因定位于人第8號染色體8p23區(qū)段，該區(qū)段在多種惡性腫瘤細胞中高頻缺失。研究表明，LPTS在肝癌組織及肝癌細胞系中表達量極低或不表達，腫瘤細胞中端粒酶活性的升高，可能與LPTS基因的缺失或表達下調(diào)有關。已有文獻報道將LPTS基因?qū)敫伟┘毎?，能抑制肝癌細胞的生長、增殖、最后引起死亡(Liao C，Zhao MJ，Zhao J，et al.Mutation analysis of novelhuman liver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol，2003，989-93；Zhou X.Z.，Lu K.P..The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor.Cell，2001，107，347-359.)。因此，LPTS蛋白具有抑制腫瘤細胞生長，并導致死亡的作用。
中國專利ZL00115395.1公開了LPTS的基因序列和編碼蛋白的氨基酸序列。然而，在以往的研究報告中，LPTS蛋白是以GST-融合蛋白或His-融合蛋白的形式在大腸肝菌中重組表達，然后通過GST-或Ni柱親和層析分離和純化融合蛋白。然而，親和層析柱純化方法生產(chǎn)成本高，根本不適于大量制備。
因此，本領域迫切需要研制出一種成本低、可供大規(guī)模制備，獲得目的蛋白的分離純化工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種制備LPTS蛋白的方法，該方法可有效地和規(guī)?；苽銵PTS蛋白，并使獲得的蛋白具有相當高的純度和抑制端粒酶的生物學活性。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離端粒酶活性抑制劑的方法，其中端粒酶活性抑制劑是LPTS蛋白或其活性片段，該方法包括步驟(a)對含有LPTS蛋白或其活性片段的發(fā)酵液樣品，進行陽離子交換層析，獲得含所述LPTS蛋白或其活性片段的初提純液，其中所述的活性片段具有全長LPTS的80％以上的端粒酶抑制活性；(b)對步驟(a)中的初提純液，進行葡聚糖凝膠層析，從而獲得純化的LPTS蛋白或其活性片段。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中使用的陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中的條件是，陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2，30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH緩沖液為平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl溶液段的洗脫峰作為初提純液。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中所用的葡聚糖凝膠是Sephadex G100。
在另一優(yōu)選例中，步驟(b)中的條件是，葡聚糖凝膠是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3為平衡液和洗脫液，收集主洗脫峰(用SDS-PAGE電泳驗證)即為純化的LPTS蛋白或其活性片段。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)和(b)之間還包括步驟將步驟(a)中的初提純液的體積濃縮至初提純液原體積的1/3-1/50。
在另一優(yōu)選例中，所述的純化的LPTS蛋白的純度大于80％，其活性片段的純度大于90％。
在另一優(yōu)選例中，所述的活性片段是具有至少80％全長LPTS的端粒酶抑制活性的活性片段，較佳地選自下組(i)LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的多肽；(ii)6His與LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的融合蛋白。
更佳地，所述的活性片段是具有SEQ ID NO5或6所示氨基酸序列的多肽。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中的發(fā)酵液樣品是用超聲波破碎菌體后，經(jīng)離心而獲得上清液。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用本發(fā)明上述方法制備的端粒酶活性抑制劑，其中端粒酶活性抑制劑是LPTS蛋白的活性片段，并且所述的活性片段選自下組(i)LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的多肽；(ii)6His與LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的融合蛋白。
在另一優(yōu)選例中，所述的粒酶活性抑制劑是具有SEQ ID NO5或6所示氨基酸序列的多肽。


圖1顯示了重組表達載體pET-24-LPGENE1和LPGENE2的構(gòu)造圖。
圖2顯示了LPGENE1和LPGENE2在大腸肝菌中的誘導表達結(jié)果。其中，各泳道如下1LPGENE1誘導表達前；2LPGENE1誘導表達后；3LPGENE2誘導表達前；4LPGENE1誘導表達后；5分子量標準物。
圖3顯示了LPGENE1經(jīng)SP-Sepharose柱層析純化后的結(jié)果。其中，各泳道如下1分子量標準物；2-50.5M NaCl洗脫液；61M NaCl洗脫液。
圖4顯示了LPGENE2經(jīng)SP-Sepharose柱層析純化后的結(jié)果。其中，各泳道如下1分子量標準物；2-50.5M NaCl洗脫液；61M NaCl洗脫液。
圖5顯示了LPGENE1經(jīng)Sephadex G100柱層析純化后的結(jié)果。其中泳道1-6為洗脫液。
圖6顯示了LPGENE2經(jīng)Sephadex G100柱層析純化后的結(jié)果。其中泳道1-7為洗脫液。
圖7顯示了最終獲得LPGENE1和LPGENE2蛋白的純度。其中，各泳道如下1LPGENE2的誘導表達；2LPGENE2的SP-Sepharose層析純化；3LPGENE2的Sephadex G100層析純化；4LPGENE1的誘導表達；5LPGENE1的SP-Sepharose層析純化。
圖8顯示LPGENE1和LPGENE2經(jīng)Hi-Sepharose 4B柱純化后的結(jié)果。其中，各泳道如下1LPGENE1經(jīng)Hi-Sepharose 4B柱純化后的結(jié)果；2，4分子量標準物；3LPGENE2經(jīng)Hi-Sepharose 4B柱純化后的結(jié)果。
圖9顯示了純化后的LPGENE1和LPGENE2蛋白具有抑制腫瘤細胞端粒酶的活性。其中，各泳道如下1-5加入LPGENE1蛋白的濃度(ug/ml)分別為1.6，3.2，6.4，12.8，25.6；6-10LPGENE2蛋白0.62，1.25，2.5，5，10；11空白對照。
圖10顯示了純化后的LPGENE1和LPGENE2蛋白具有特異的免疫原性。泳道1LPTS抗體與純化后的LPGENE2蛋白專一性結(jié)合；泳道2LPTS抗體與純化后的LPGENE1蛋白專一性結(jié)合。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)LPTS基因特別適合于用基因工程技術(shù)重組表達其蛋白質(zhì)產(chǎn)物，經(jīng)產(chǎn)物的分離純化后，用于肝細胞肝癌及其它腫瘤的治療。
如本文所用，術(shù)語“LPGENE”和“LPTS”可互換使用，指公開于中國專利ZL00115395.1的LPTS基因或其編碼蛋白(如SEQ ID NO1和2所示的基因和編碼蛋白)。該術(shù)語還包括具有抑制端粒酶活性的活性片段(如含有C末端197個氨基酸的活性片段，尤其是具有SEQ ID NO5所示序列的活性片段)或衍生物(如在C末端或N端帶有6His、GST序列的融合蛋白，尤其是具有SEQ ID NO6所示序列的活性片段。該術(shù)語包括含有或不含有起始甲硫氨酸的多肽。
如本文所用，術(shù)語“LPGENE1”指全長的LPTS基因或其編碼蛋白，例如SEQ ID NO1所示的基因、SEQ ID NO2所示的編碼蛋白和SEQ ID NO3所示的帶6His的全長LPTS蛋白。
如本文所用，術(shù)語“LPGENE2”指LPTS蛋白的C末端197氨基酸的活性片段或其編碼序列，例如SEQ ID NO4所示的編碼序列或SEQ ID NO5和6所示的活性片段。
為了描述方便，在實施例中，將“LPGENE1”和“LPGENE2”通稱為“LPGENE”。
本發(fā)明還提供一種新的能穩(wěn)定表達并且純度極高的LPTS活性片段，它就是LPGENE2。
在本發(fā)明中，術(shù)語“LPGENE2蛋白”、“LPGENE2多肽”或“端粒酶抑制蛋白活性片段LPGENE2”可互換使用，都指具有人端粒酶抑制蛋白LPGENE2氨基酸序列(SEQ ID NO5)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的端粒酶抑制蛋白LPGENE2。該術(shù)語還包括SEQ ID NO5與6His等標簽序列形成的融合蛋白(SEQ ID NO6)。
如本文所用，“分離的LPGENE蛋白或多肽”是指LPGENE蛋白或其多肽片段基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化LPGENE蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的LPGENE多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人LPGENE蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持天然LPTS的端粒酶抑制活性(如80％以上)，與SEQ ID NO2的氨基酸序列有80％以上序列相同性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人LPGENE多肽”指具有端粒酶抑制活性的SEQ ID NO2和5序列的多肽。該術(shù)語還包括具有端粒酶抑制活性的、SEQ ID NO2和5序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-20個，較佳地1-10個，更佳地1-8個，最佳地1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人LPGENE蛋白的活性片段和活性衍生物。
發(fā)明還提供人LPGENE蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然LPGENE多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人LPGENE蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID2或5的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1


本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1或4所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQID NO2或5的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1或4所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
本發(fā)明的人LPGENE核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明LPGENE蛋白的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含LPGENE編碼序列的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或LPGENE蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的LPGENE多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人LPGENE多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人LPGENE多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人LPGENE編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，真菌細胞如酵母；CHO、COS、293細胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組的LPGENE多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明還提供了一種抑制端粒酶活性的組合物，它含有抑制有效量(如0.001-99.99wt％)的本發(fā)明LPGENE多肽以及可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。本發(fā)明的組合物可以被制成針劑、溶液、片劑。
在本發(fā)明的一個實施例中，將LPTS基因編碼328個氨基酸的全長cDNA(LPGENE1)和編碼C端197氨基酸的cDNA(LPGENE2)插入pET24a+質(zhì)粒的NdeI/Xho1位點。經(jīng)測序驗證序列無誤后轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL-21。然后進行誘導表達，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測菌體中表達的蛋白。LPGENE1蛋白在30℃誘導時表達量較37℃低，產(chǎn)率約為33.5mg/L，但可以減少LPGENE1蛋白的降解。出乎意料的是，LPGENE2在37℃誘導表達時，產(chǎn)率大幅提高，約為59.5mg/L，占菌體總蛋白的39％，并且表達的LPGENE2蛋白質(zhì)很穩(wěn)定，不易被降解。
本發(fā)明還提供了從發(fā)酵液中分離純化LPGENE1和LPGENE2的方法。將發(fā)酵液離心獲得菌體，然后超聲波破碎細胞，采用離子交換層析等多種分離方法，獲得高純度的LPGENE蛋白。LPGENE蛋白富含堿性氨基酸，pI值約為10，偏堿性，所以先采用陽離子交換介質(zhì)(如SP-Sepharose柱層析)，分離純化目的蛋白。然后再將含目的蛋白的分離液經(jīng)超濾濃縮后，經(jīng)Sephadex G100柱層析進一步純化。目的蛋白LPGENE1的純度達80％以上，LPGENE2的純度可達95％以上。LPGENE1和LPGENE2蛋白的總回收率分別為27.1％和34.3％。
本發(fā)明還提供了對LPGENE蛋白的活性檢測技術(shù)。LPGENE是一種很強的端粒酶活性抑制劑，實施例3詳細地描述了測定LPGEGE抑制端粒酶的生物學活性的方法，以及制備含有端粒酶的SMMC-7721肝癌細胞裂解液，作為檢測底物的方法。
本發(fā)明還提供了采用Western Blotting實驗對純化的LPGENE1和LPGENE2蛋白的特異免疫活性進行鑒定。即將LPGENE蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用特異的抗LPGENE抗體進行雜交，確定蛋白的特異免疫原性。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
(a)與Ni柱親和層析相比較，本發(fā)明所涉及的分離純化工藝簡單，易于操作，生產(chǎn)成本較低，回收率和產(chǎn)品純度較高，適于工業(yè)放大，從而可以大規(guī)模生產(chǎn)LPGENE蛋白；(b)本發(fā)明方法純化得到的蛋白在純度、回收率、體外抑制端粒酶活性和免疫原性與親和層析方法獲得的蛋白一致。
(c)LPGENE2蛋白質(zhì)不僅性能很穩(wěn)定，不易被降解，而且端粒酶抑制活性高于全長LPTS蛋白。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1.LPGENE1和LPGENE2的基因工程菌的制備和誘導表達(a)LPGENE1和LPGENE2基因的制備以全長LPTS基因序列(制法見中國專利ZL00115395.1)為模板，用以下引物，P1(上游引物)5’-CATATGTCTATGCTGGCTGAACGTCGG-3’(SEQ ID NO7)P2(下游引物)5’-CTCGAGTTTGGAATCTTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO8)通過PCR反應，獲得兩端帶有酶切位點NdeI和Xho1的含全長LPTS編碼序列的PCR擴增產(chǎn)物(LPGENE1基因)，序列見SEQ ID NO1；PCR反應條件為在50μl體系中進行，包括1μl模板，1μl dNTP mix(10mM)，上下游引物(20μM)各1μl，5μl10×PYROBEST buffer，0.5μl PYROBEST酶，補加去離子水至50μl。反應條件為94℃3分鐘，然后是30個循環(huán)，每循環(huán)包括94℃30秒，56℃40秒，72℃60秒，30個循環(huán)后再72℃延伸5分鐘，4℃保溫。
同樣，以全長LPTS基因序列(制法見中國專利ZL00115395.1)為模板，用以下引物，P3(上游引物)5’-CATATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGC-3’(SEQ ID NO9)
P2(下游引物)5’-CTCGAGTTTGGAATCTTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO8)通過PCR反應，獲得的PCR擴增產(chǎn)物兩端帶有酶切位點NdeI和Xho1，并含有編碼LPTS蛋白C端196氨基酸并在N端加上甲硫氨酸共197個氨基酸的DNA序列(LPGENE2基因)，序列見SEQ ID NO4。PCR反應條件同上。
(b)LPGENE1和LPGENE2工程菌的構(gòu)建將如上獲得的LPGENE1基因和LPGENE2基因的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過NdeI和Xho1酶切后，分別插入經(jīng)NdeI和Xho1酶切的pET24a+質(zhì)粒(購自Novagen公司)，得到質(zhì)粒pET-24-LPGENE1和pET-24-LPGENE2(通稱為pET-24-LPGENE)。經(jīng)測序驗證序列無誤后轉(zhuǎn)化常規(guī)的宿主菌E.coli BL-21(DE3)。獲得分別表達LPGENE1和LPGENE2的工程菌。
LPGENE1和LPGENE2表達質(zhì)粒的構(gòu)造見圖1。LPGENE1的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO1、2和3所示，LPGENE2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO4、5和6所示。
在本實施例中，因為選用的質(zhì)粒上帶有6His的編碼序列，因此表達的目的蛋白的C端含有6×His。帶有6His的LPGENE的蛋白序列示于SEQ ID NO3和6(SEQ ID NO3為帶有6His的LPGENE1的蛋白序列，SEQ ID NO6為有6His的LPGENE2的蛋白序列)。
(c)LPGENE在大腸肝菌中的誘導表達將pET-24-LPGENE重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL-21，挑取陽性克隆進行酶切鑒定和測序鑒定，將驗證后的單克隆接種到5ml卡那霉素含量為100mg/L的2YT培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含有16g Trypton，10g酵母提取物，5g NaCl)中，37℃振蕩，培養(yǎng)過夜。次日，以1％接種量接入新鮮的2YT培養(yǎng)基(kan+)中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。當A600約等于0.6時，加入IPTG，終濃度為0.5mmol/L，誘導表達3～4h，誘導表達的溫度37℃或30℃。在加入IPTG前吸取少量菌液做菌體蛋白陰性對照。離心收集誘導表達后的菌體，懸浮后用超聲波破碎。超聲破菌條件見實施例2。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測上述制備菌體中的LPGENE蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制及電泳方法見文獻(汪家政，范明主編.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京科學出版社，2001，77)，濃縮膠的濃度為5％，分離膠的濃度為12％，電泳緩沖液采用Tris-甘氨酸系統(tǒng)。將待檢測的IPTG誘導前后菌體以及超聲波破碎后的離心沉淀加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，超聲波破碎后上清加等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，沸水浴5min，離心1min，然后上樣，進行電泳。
LPGENE1和LPGENE2在大腸肝菌中的誘導表達結(jié)果見圖2。其中，泳道1，3為LPGENE工程菌在誘導前的蛋白表達結(jié)果，泳道2，4為誘導后的蛋白表達。結(jié)果表明，誘導后LPGENE蛋白的表達量明顯增加。
LPGENE1蛋白的誘導溫度可采用37℃或30℃。在37℃誘導時蛋白表達量較高，產(chǎn)率約為50mg/L，約占菌體總蛋白的35％。降低誘導溫度如30℃，誘導4h后，產(chǎn)率約為33.5mg/L，占菌體總蛋白的32％，降低誘導溫度，表達量下降，但可以減少LPGENE1蛋白的降解。
LPGEGE2的誘導表達與LPGENE1基本相同，但LPGENE2的最適誘導表達溫度是37℃，誘導時間為3h，產(chǎn)率約為59.5mg/L，可占菌體總蛋白的39％，并且表達的LPGENE2蛋白質(zhì)很穩(wěn)定，不易被降解。
實施例2.LPGENE1和LPGENE2的分離純化在實驗室少量制備純化的LPGENE蛋白可以采用商品化的Hi-Sepharose 4B柱進行親和層析。為了大量制備純化的LPGENE蛋白，本實施例采用了離子交換等分離方法，獲得了高純度的LPGENE蛋白。
具體分離純化工藝可包括以下幾個步驟(1)超聲波破碎菌體取離心所得的菌體，加入20倍細菌體積的緩沖液(30mmol/L KH2PO4-NaOH)重懸細胞，再加入2‰的100mM的PMSF(苯甲基磺酰氟)(終濃度0.2mM)。然后在冰浴條件下，超聲波破碎細胞，(超聲儀，寧波新芝公司制造)，超聲條件如下工作時間7秒，間隙時間25秒，工作功率400W，工作次數(shù)50～100次(根據(jù)體積和和菌體濃度而變)，每超聲30次加入同等量的PMSF。超聲結(jié)束后4℃離心，12000rpm離心30分鐘，收集上清，加同等量2‰PMSF，待用。
(2)SP-Sepharose層析將超聲后上清過預平衡的SP-Sepharose柱(SP-Sepharose FastFlow，Pharmacia公司)。柱平衡液為30mmol/L的KH2PO4-NaOH緩沖液(pH7.8)，吸附后再用5倍柱體積的此平衡液洗滌，至無蛋白質(zhì)流出后，用階段性梯度洗脫，洗脫液分別為0.3、0.5和1.0mol/L的NaCl溶液(用平衡液配制，各5倍柱體積)，分別收集各段流出峰，SDS-PAGE電泳檢測各個峰的蛋白質(zhì)純度和含量。層析在4℃冷庫中進行。
結(jié)果見圖3和圖4。其中圖3中的樣品3為LPGENE1經(jīng)SP-Sepharose柱層析，用0.5mol/L的NaCl溶液洗脫后的洗脫液，圖4中的樣品3、4為LPGENE1經(jīng)SP-Sepharose柱層析，用0.5mol/L的NaCl溶液洗脫后的洗脫液。結(jié)果表明，LPGENE蛋白在0.5mol/L的NaCl溶液洗脫段流出，并且純度比較高。
(3)經(jīng)SP-Sepharose層析純化所得蛋白的超濾濃縮將SP-Sepharose層析得到的LPGENE純化蛋白溶液移入Millipore超濾離心管(Amecon Ultra-4，膜截留分子量為10,000，Millipore公司)，4000g，4℃離心，濃縮至原體積的1/20。具體方法見公司說明。在濃縮后的蛋白質(zhì)溶液中再補加溶液及PMSF，終濃度分別為30mmol/L和0.2mM，裝入透析袋，然后把透析袋放入20倍于蛋白質(zhì)樣品體積的緩沖液(30mmol/L NH4HCO3)進行透析，用磁器緩緩攪拌緩沖液，攪拌透析溫度4℃，每4h更換一次透析緩沖液，共4次。
(4)Sephadex G100層析取濃縮后的蛋白質(zhì)樣品2ml加入經(jīng)30mmol/L NH4HCO3平衡液預平衡的Sephadex G100柱(1.6cm×100cm，Pharmacia公司)，再用此平衡液洗脫，收集各洗脫峰，直至無峰出現(xiàn)。在收集的蛋白溶液中加入終濃度為0.2mM的PMSF。實驗在4℃條件下進行。SDS-PAGE檢測LPGENE1和LPGENE2濃度和含量。
結(jié)果見圖5和圖6。其中圖5為LPGENE1經(jīng)Sephadex G100柱層析純化后的結(jié)果，圖6為LPGENE2經(jīng)Sephadex G100柱層析純化后的結(jié)果。結(jié)果表明，Sephadex G100能有效地提高LPGENE蛋白的純度，特別是可以除去樣品中的色素，核酸，多糖等物質(zhì)，并且能夠更換樣品的緩沖液組份，有利于作進一步的處理、檢測和應用。
LPGENE蛋白富含堿性氨基酸，pI值約為10，偏堿性，所以先采用陽離子交換介質(zhì)SP-Sepharose，以30mmol/L的KH2PO4-NaOH(pH7.8)緩沖液為平衡液，收集在0.5mol/L NaCl溶液段的洗脫峰，可以很好的分離純化目的蛋白。再經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G100層析分離，LPGENE2蛋白的SDS-PAGE電泳基本呈單一條帶，純度達95％，由于LPGENE1蛋白比較容易被水解，全長蛋白純度約為80％，見圖7。經(jīng)過整個純化過程LPGENE1和LPGENE2蛋白的總回收率分別為27.1％和34.3％，見表1。
表1 LPGENE1和LPGENE2蛋白純化回收率

將本發(fā)明的二步分離方法與現(xiàn)有技術(shù)中采用Ni-Sepharose 4B柱親和層析方法得到的蛋白(見圖8)進行比較。結(jié)果表明，本發(fā)明的二步分離方法能有效的分離制備LPGENE蛋白，除了去掉一些小分子量蛋白質(zhì)或肽段，還可除去色素、核酸、多糖等雜質(zhì)，獲得的蛋白純度較Hi-Sepharose 4B柱層析獲得的蛋白純度有所提高。就蛋白的總回收率而言，兩種方法基本相接近，然而本發(fā)明純化方法的成本低，并且適合大規(guī)模生產(chǎn)。
實施例3.LPGENE1和LPGENE2生物學活性檢測LPGENE是一種很強的端粒酶活性抑制劑。本發(fā)明采用TPAP法測定實施例2中制備并純化的LPGEGE的生物學活性。
端粒酶來自常規(guī)的SMMC-7721肝癌細胞的裂解液，具體制備方法如下將SMMC-7721肝癌細胞接種在10ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為RPMI 1640，溫度為37℃，5％CO2條件下貼壁培養(yǎng)，滿瓶后收取培養(yǎng)細胞。即將培養(yǎng)基吸干，用PBS洗一遍細胞，然后用胰酶將細胞消化，PBS沖洗細胞，吸入離心管，4000rpm離心收集細胞。再用洗滌緩沖液(10mM Hepes-KOH(pH7.5)，1.5mM MgCl2，10mM KCl，1mMDTT(二硫蘇糖醇))洗一遍細胞，離心。用冰預冷的裂解緩沖液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM MgCl2，1mM EGTA，0.1mM PMSF，5mM巰基乙醇，0.5％CHAPS，10％glycerol)500ul重懸細胞，置冰上30分鐘，4℃，12,000rpm高速離心30分鐘，離心獲得上清可用來測定端粒酶活性。上清液可在-70℃保存，端粒酶活性可以經(jīng)受多次的凍溶仍保持穩(wěn)定。
TPAP測定法在500ul Eppendorf管中進行，反應體積為50ul。在管中加入42μL反應緩沖液(20mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，63mM KCl，0.005％Tween-20，1mM EGTA，0.1mg/ml BSA)，1μL SMMC-7721肝癌細胞裂解液上清，0.25μL10mMdNTP，1μL倍比稀釋的LPGENE蛋白，混勻后在冰上放置10min，管內(nèi)再加入1μLTs引物(Ts primer，0.1μg/μL)，開始PCR反應。先在25℃延伸反應30分鐘，90℃滅活3分鐘，然后再加入1μL Cx引物(Cx primer)，0.5μL(2U)Taq酶，繼續(xù)PCR反應。
反應條件為94℃，2分鐘加熱后，在94℃30秒，50℃40秒，72℃40s條件下，進行33個循環(huán)反應，最后72℃保溫2分鐘。
引物的序列為Ts引物5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’(SEQ ID NO10)Cx引物5’-(CCCTTA)3CCCTAA-3’(SEQ ID NO11)。
然后電泳鑒定上述PCR反應產(chǎn)物。電泳采用10％聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)非變性膠，0.5×TBE緩沖液，電壓100V，6～8小時。PAGE膠銀染顯色，拍照。
TRAP實驗結(jié)果表明，實施例2制備獲得的LPGENE蛋白在體外有較高的端粒酶抑制活性，LPGENE1和LPGENE2兩種蛋白分別在約為12.8ug/ml和10ug/ml濃度時，能完全抑制端粒酶的活性(圖9)。
實施例4.LPGENE1和LPGENE2蛋白特異的免疫反應原性為了確定純化后的LPGENE1和LPGENE2蛋白是否具有特異的免疫活性，本實施例中采用Western Blotting實驗進行檢測。
LPGENE蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用特異的抗LPGENE抗體進行雜交本。實驗中的一抗為LPGENE蛋白的家兔抗血清，并經(jīng)親和層析純化。二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG。具體的實驗操作見參考文獻汪家政，范明主編.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京科學出版社，2001，166。
Western實驗結(jié)果表明，本方法制備的LPGENE能與抗體特意性的結(jié)合，見圖10。圖中樣品1和2分別為LPGENE1和LPGENE2，具有良好的免疫反應原性。
實施例5.C端不含6His的LPGENE2蛋白的制備和活性測試基本上按實施例1中所述的方法，不同點僅在于PCR引物，此實施例中所用的上游引物同實施例1中的P1引物相同，而下游引物有所不同，本實施例所用的下游引物為5’-CTCGAGTCATTTGGAATCTTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO12)，即在酶切位點之前加了一個終止密碼子，這樣，在蛋白翻譯表達時，到此便終止翻譯，從而制得表達C端不含6His的LPGENE2蛋白的大腸桿菌工程菌。
按實施例2中所述的類似方法，在37℃進行誘導表達不含6His的LPGENE2蛋白，并按相同的純化方法和條件分離純化該蛋白，通過(1)超聲波破碎菌體；(2)SP-Sepharose層析；(3)超濾濃縮；(4)Sephadex G100層析等過程)，從而制得C端不含6His的LPGENE2蛋白，其純度達95％，LPGENE2蛋白的總回收率達34.0％。
按實施例3的方法測試C端不含6His的LPGENE2蛋白的對端粒酶活性的抑制作用，結(jié)果表明，在約10ug/ml濃度時，能完全抑制端粒酶的活性。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>端粒酶活性抑制蛋白的制備<130>055751<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>984<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(984)<223>
<400>1atg tct atg ctg gct gaa cgt cgg cgg aag cag aag tgg gct gtg gat 48Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp1 5 10 15cct cag aac act gcc tgg agt aat gac gat tcc aag ttt ggc cag cgg 96Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg20 25 30atg cta gag aag atg ggg tgg tct aaa gga aag ggt tta ggg gct cag 144Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln35 40 45gag caa gga gcc aca gat cat att aaa gtt caa gtg aaa aat aac cac 192Glu Gln Gly Ala Thr Asp His Ile Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His50 55 60ctg gga ctc gga gct acc atc aat aat gaa gac aac tgg att gcc cat 240Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His65 70 75 80cag gat gat ttt aac cag ctt ctg gcc gaa ctg aac act tgc cat ggg 288Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly85 90 95cag gaa acc aca gat tcc tcg gac aag aag gaa aag aaa tct ttt agc 336Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser100 105 110ctt gag gaa aag tcc aaa atc tcc aaa aac cgt gtt cac tat atg aaa 384Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys115 120 125ttc aca aaa ggg aag gat ctg tca tct cgg agc aaa aca gat ctt gac 432Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp130 135 140
tgc att ttt ggg aaa aga cag agt aag aag act ccc gag ggc gat gcc 480Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala145 150 155 160agt ccc tcc act cca gag gag aac gaa acc acg aca acc agc gcc ttc 528Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe165 170 175acc atc cag gag tac ttt gcc aag cgg atg gca gct ctg aag aac aag 576Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys180 185 190ccc cag gtt cca gtt cca ggg tct gac att tct gag acg cag gtg gaa 624Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu195 200 205cgt aaa agg ggg aag aaa aga aat aaa gag gcc aca ggt aaa gat gtg 672Arg Lys Arg Gly Lys Lys Arg Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val210 215 220gaa agt tac ctc cag cct aag gcc aag agg cac acg gag gga aag ccc 720Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro225 230 235 240gag agg gcc gag gcc cag gag cga gtg gcc aag aag aag agc gcg cca 768Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro245 250 255gca gaa gag cag ctc aga ggc ccc tgc tgg gac cag agt tcc aag gcc 816Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala260 265 270tct gct cag gat gca ggg gac cat gtg cag ccg cct gag ggc cgg gac 864Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp275 280 285ttc acc ctg aag ccc aaa aag agg aga ggg aag aaa aag ctg caa aaa 912Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys290 295 300cca gta gag ata gca gag gac gct aca cta gaa gaa acg cta gtg aaa 960Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys305 310 315 320aag aag aag aag aaa gat tcc aaa 984Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys325<210>2<211>328<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp1 5 10 15Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg20 25 30Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln35 40 45Glu Gln Gly Ala Thr Asp His Ile Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His
50 55 60Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His65 70 75 80Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly85 90 95Gin Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser100105 110Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys115 120 125Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp130 135 140Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala145 150 155 160Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe165 170 175Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys180 185 190Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu195 200 205Arg Lys Arg Gly Lys Lys Arg Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val210 215 220Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro225 230 235 240Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro245 250 255Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala260 265 270Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp275 280 285Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys290 295 300Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys305 310 315 320Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys325<210>3<211>334<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3Met Ser Met Leu Ala Glu Arg Arg Arg Lys Gln Lys Trp Ala Val Asp1 5 10 15Pro Gln Asn Thr Ala Trp Ser Asn Asp Asp Ser Lys Phe Gly Gln Arg20 25 30Met Leu Glu Lys Met Gly Trp Ser Lys Gly Lys Gly Leu Gly Ala Gln35 40 45Glu Gln Gly Ala Thr Asp His Ile Lys Val Gln Val Lys Asn Asn His50 55 60
Leu Gly Leu Gly Ala Thr Ile Asn Asn Glu Asp Asn Trp Ile Ala His65 70 75 80Gln Asp Asp Phe Asn Gln Leu Leu Ala Glu Leu Asn Thr Cys His Gly85 90 95Gln Glu Thr Thr Asp Ser Ser Asp Lys Lys Glu Lys Lys Ser Phe Ser100 105 110Leu Glu Glu Lys Ser Lys Ile Ser Lys Asn Arg Val His Tyr Met Lys115 120 125Phe Thr Lys Gly Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp130 135 140Cys Ile Phe Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala145 150 155 160Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe165 170 175Thr Ile Gln Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys180 185 190Pro Gln Val Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu195 200 205Arg Lys Arg Gly Lys Lys Arg Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val210 215 220Glu Ser Tyr Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro225 230 235 240Glu Arg Ala Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro245 250 255Ala Glu Glu Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala260 265 270Ser Ala Gln Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp275 280 285Phe Thr Leu Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys290 295 300Pro Val Glu Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys305 310 315 320Lys Lys Lys Lys Lys Asp Ser Lys His His His His His His325 330<210>4<211>591<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(591)<223>
<400>4atg aag gat ctg tca tct cgg agc aaa aca gat ctt gac tgc att ttt48Met Lys Asp Leu Set Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp Cys Ile Phe1 5 10 15
ggg aaa aga cag agt aag aag act ccc gag ggc gat gcc agt ccc tcc 96Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala Ser Pro Ser20 25 30act cca gag gag aac gaa acc acg aca acc agc gcc ttc acc atc cag 144Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe Thr Ile Gln35 40 45gag tac ttt gcc aag cgg atg gca gct ctg aag aac aag ccc cag gtt 192Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys Pro Gln Val50 55 60cca gtt cca ggg tct gac att tct gag acg cag gtg gaa cgt aaa agg 240Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu Arg Lys Arg65 70 75 80ggg aag aaa aga aat aaa gag gcc aca ggt aaa gat gtg gaa agt tac 288Gly Lys Lys Arg Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val Glu Ser Tyr85 90 95ctc cag cct aag gcc aag agg cac acg gag gga aag ccc gag agg gcc 336Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro Glu Arg Ala100 105 110gag gcc cag gag cga gtg gcc aag aag aag agc gcg cca gca gaa gag 384Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro Ala Glu Glu115 120 125cag ctc aga ggc ccc tgc tgg gac cag agt tcc aag gcc tct gct cag 432Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala Ser Ala Gln130 135 140gat gca ggg gac cat gtg cag ccg cct gag ggc cgg gac ttc acc ctg 480Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp Phe Thr Leu145 150 155 160aag ccc aaa aag agg aga ggg aag aaa aag ctg caa aaa cca gta gag 528Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys Pro Val Glu165 170 175ata gca gag gac gct aca cta gaa gaa acg cta gtg aaa aag aag aag 576Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys Lys Lys Lys180 185 190aag aaa gat tcc aaa 591Lys Lys Asp Ser Lys195<210>5<211>197<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Met Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp Cys Ile Phe1 5 10 15Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala Ser Pro Ser20 25 30Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe Thr Ile Gln35 40 45
Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys Pro Gln Val50 55 60Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu Arg Lys Arg65 70 75 80Gly Lys Lys Arg Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val Glu Ser Tyr85 90 95Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro Glu Arg Ala100 105 110Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro Ala Glu Glu115 120 125Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala Ser Ala Gln130 135 140Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp Phe Thr Leu145 150 155 160Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys Pro Val Glu165 170 175Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys Lys Lys Lys180 185 190Lys Lys Asp Ser Lys195<210>6<211>203<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>帶有6His的融合蛋白<400>6Met Lys Asp Leu Ser Ser Arg Ser Lys Thr Asp Leu Asp Cys Ile Phe1 5 10 15Gly Lys Arg Gln Ser Lys Lys Thr Pro Glu Gly Asp Ala Ser Pro Ser20 25 30Thr Pro Glu Glu Asn Glu Thr Thr Thr Thr Ser Ala Phe Thr Ile Gln35 40 45Glu Tyr Phe Ala Lys Arg Met Ala Ala Leu Lys Asn Lys Pro Gln Val50 55 60Pro Val Pro Gly Ser Asp Ile Ser Glu Thr Gln Val Glu Arg Lys Arg65 70 75 80Gly Lys Lys Arg Asn Lys Glu Ala Thr Gly Lys Asp Val Glu Ser Tyr85 90 95Leu Gln Pro Lys Ala Lys Arg His Thr Glu Gly Lys Pro Glu Arg Ala100 105 110Glu Ala Gln Glu Arg Val Ala Lys Lys Lys Ser Ala Pro Ala Glu Glu115 120 125Gln Leu Arg Gly Pro Cys Trp Asp Gln Ser Ser Lys Ala Ser Ala Gln
130 135 140Asp Ala Gly Asp His Val Gln Pro Pro Glu Gly Arg Asp Phe Thr Leu145 150 155 160Lys Pro Lys Lys Arg Arg Gly Lys Lys Lys Leu Gln Lys Pro Val Glu165 170 175Ile Ala Glu Asp Ala Thr Leu Glu Glu Thr Leu Val Lys Lys Lys Lys180 185 190Lys Lys Asp Ser Lys His His His His His His195 200<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7catatgtcta tgctggctga acgtcgg 27<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ctcgagtttg gaatctttct tctt24<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9catatgtacg gccgcaagaa acgccgc 27
<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10aatccgtcga gcagagtt 18<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11cccttaccct tacccttacc ctaa24<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12ctcgagtcat ttggaatctt tcttctt 2權(quán)利要求
1.一種分離端粒酶活性抑制劑的方法，其中端粒酶活性抑制劑是LPTS蛋白或其活性片段，其特征在于，該方法包括步驟(a)對含有LPTS蛋白或其活性片段的發(fā)酵液樣品，進行陽離子交換層析，獲得含所述LPTS蛋白或其活性片段的初提純液，其中所述的活性片段具有全長LPTS的80％以上的端粒酶抑制活性；(b)對步驟(a)中的初提純液，進行葡聚糖凝膠層析，從而獲得純化的LPTS蛋白或其活性片段。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中使用的陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中的條件是，陽離子交換介質(zhì)是SP-Sepharose，以pH7.8±0.2，30±5mmol/L的KH2PO4-NaOH緩沖液為平衡液，收集在0.5±0.05mol/L NaCl溶液段的洗脫峰作為初提純液。
4.如權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(b)中所用的葡聚糖凝膠是Sephadex G100。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)中的條件是，葡聚糖凝膠是Sephadex G100，以30±10mmol/L NH4HCO3為平衡液和洗脫液，收集主洗脫峰，用SDS-PAGE電泳驗證，即為純化的LPTS蛋白或其活性片段。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(a)和(b)之間還包括步驟將步驟(a)中的初提純液的體積濃縮至初提純液原體積的1/3-1/50。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的純化的LPTS蛋白的純度大于80％，其活性片段的純度大于90％。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的活性片段是具有至少80％全長LPTS的端粒酶抑制活性的活性片段，較佳地選自下組(i)LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的多肽；(ii)6His與LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的融合蛋白。
9.一種用權(quán)利要求1所述方法制備的端粒酶活性抑制劑，其中端粒酶活性抑制劑是LPTS蛋白的活性片段，并且所述的活性片段選自下組(i)LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的多肽；(ii)6His與LPTS的C末端的197個氨基酸構(gòu)成的融合蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的端粒酶活性抑制劑，其特征在于，所述的粒酶活性抑制劑是具有SEQ ID NO5或6所示氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了采用基因重組技術(shù)制備端粒酶活性抑制蛋白的方法，該方法可以高效地和大規(guī)模地制備高純度和高生物學活性的端粒酶活性抑制蛋白。
文檔編號C07K1/18GK1948339SQ20051003052
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日
發(fā)明者趙慕鈞, 陳光明, 趙靜, 孫成副, 陳國元, 李載平 申請人:中國科學院上海生命科學研究院