專利名稱：人源化抗ErbB2抗體及用抗ErbB2抗體進(jìn)行的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源化抗ErbB2抗體和用例如人源化抗ErbB2抗體等抗ErbB2抗體治療癌癥的方法。
背景技術(shù)：
受體酪氨酸激酶的ErbB家族是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和生存中重要的介體。該受體家族包括4個(gè)不同的成員，即表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR或ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
有證據(jù)表明由erbB1基因編碼的EGFR與人類的惡性腫瘤有關(guān)。尤其是在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭部腫瘤、頸部腫瘤和胃癌以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腫瘤中觀察到EGFR的增高表達(dá)。EGFR受體表達(dá)增加通常與同一癌細(xì)胞中EGFR配體，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)的產(chǎn)生增加相關(guān)，導(dǎo)致通過(guò)自分泌刺激途徑活化受體。Baselga和Mendelsohn，Pharmac.Ther.64127-154(1994)。針對(duì)EGFR或其配體、TGF-α和EGF的單克隆抗體已經(jīng)在這些惡性腫瘤的治療中作為治療藥物被評(píng)價(jià)。例如見(jiàn)Baselga和Mendelsohn，出處同上；Masui等，癌癥研究441002-1007(1984)；和Wu等，J.Clin.Invest.951897-1905(1995)。
ErbB家族的第二個(gè)成員p185neu最初確定為經(jīng)化學(xué)處理的大鼠的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物。neu原癌基因的活化形式是由編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域中點(diǎn)突變(纈氨酸突變?yōu)楣劝彼?引起。在乳腺癌和卵巢癌中檢測(cè)到neu的人類同系物的擴(kuò)增，并且與預(yù)后不良相關(guān)(Slamon等，科學(xué)，235177-182(1987)；Slamon等，科學(xué)，244707-712(1989)；和美國(guó)專利4968603)。到目前為止，在人類癌癥中還沒(méi)有報(bào)道與neu原癌基因點(diǎn)突變相類似的點(diǎn)突變。在其它癌癥，包括胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰腺和膀胱的癌癥中，也觀察到ErbB2的過(guò)度表達(dá)(常見(jiàn)原因(但并非一律)是由于基因擴(kuò)增)。參見(jiàn)，如King等，科學(xué)，229974(1985)；Yokata等，柳葉刀1765-767(1986)；Fukushigi等，分子細(xì)胞生物學(xué)，6955-958(1986)；Geurin等，癌基因研究，321-31(1988)；Cohen等，癌基因，481-88(1989)；Yonemura等，癌癥研究，511034(1991)；Borst等，Gynecol.Oncol.，38364(1990)；Weiner等，癌癥研究，50421-425(1990)；Kem等，癌癥研究，505184(1990)；Park等，癌癥研究，496605(1989)；Zhau等，Mol.Carcinog.，3354-357(1990)；Aasland等，英格蘭癌癥雜志，57358-363(1988)；Williams等，Pathiobiology 5946-52(1991)；和McCann等，癌癥，6588-92(1990)。ErbB2可在前列腺癌中過(guò)度表達(dá)(Gu等，Cancer Lett.99185-9(1996)；Ross等，Hum.Pathol.28827-33(1997)；Ross等，癌癥792162-70(1997)；和Sadasivan等，J.Urol.150126-31(1993))。
針對(duì)大鼠p185neu和人ErbB2蛋白產(chǎn)物的抗體已有報(bào)道。Drebin及其同事已經(jīng)制備了抗大鼠neu基因產(chǎn)物p185neu的抗體。例如見(jiàn)Drebin等，細(xì)胞，41695-706(1985)；Myers等，酶學(xué)方法，198277-290(1991)；和WO94/22478。Drebin等(癌基因2273-277(1988))報(bào)道與p185neu的兩種不同區(qū)域反應(yīng)的抗體混合物對(duì)移植入裸鼠體內(nèi)的neu轉(zhuǎn)化型NIH-3T3細(xì)胞有協(xié)同抗癌作用。另見(jiàn)1998年10月20日發(fā)布的美國(guó)專利5824311。
Hudziak等(分子細(xì)胞生物學(xué)9(3)1165-1172(1989))報(bào)道了一組用人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3鑒定的抗ErbB2抗體的制備。暴露于所述抗體72小時(shí)之后，SK-BR-3細(xì)胞單層通過(guò)結(jié)晶紫染色確定相對(duì)細(xì)胞增殖。利用這種檢測(cè)方法，用稱為4D5的抗體得到了最大抑制率，該抗體抑制細(xì)胞增殖達(dá)56％。在此檢測(cè)中，該組其它抗體降低細(xì)胞增殖的程度較低。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗體4D5使ErbB2過(guò)度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系對(duì)TNF-α的細(xì)胞毒作用敏感。另見(jiàn)1997年10月14日發(fā)布的美國(guó)專利5677171。在文獻(xiàn)中進(jìn)一步描繪了Hudziak等所討論的抗ErbB2抗體，所述文獻(xiàn)為Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990)；Kotts等，In Vitro 26(3)59A(1990)；Sarup等，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)17272-82(1991)；Shepard等，臨床免疫學(xué)雜志11(3)117-127(1991)；Kumar等，分子細(xì)胞生物學(xué)11(2)979-986(1991)；Lewis等，CancerImmunol.Immunother.37255-263(1993)；Pietras等，癌基因91829-1838(1994)；Vitetta等，癌癥研究545301-5309(1994)；Sliwkowski等，生物化學(xué)雜志269(20)14661-14665(1994)；Scott等，生物化學(xué)雜志26614300-5(1991)；D’souza等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊917202-7206(1994)；Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996)；和Schaefer等，癌基因151385-1394(1997)。
鼠抗ErbB2抗體4D5的重組人源化抗體(huMAb4D5-8，rhuMAbEHR2或HERCEPTIN；美國(guó)專利號(hào)5821337)對(duì)已經(jīng)接受過(guò)廣泛抗癌治療的ErbB2過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者可進(jìn)行有效臨床治療(Baselga等，J.Clin.Oncol.14737-744(1996))。HERCEPTIN在1998年9月25日獲得了食品和藥品管理局的市場(chǎng)準(zhǔn)入批準(zhǔn)，用于治療過(guò)度表達(dá)ErbB2蛋白的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者。
具有各種特點(diǎn)的其它抗ErbB2抗體在下述文獻(xiàn)中敘述，Tagliabue等，國(guó)際癌癥雜志47933-937(1991)；McKenzie等，癌基因4543-548(1989)；Maier等，癌癥研究515361-5369(1991)；Bacus等，分子致癌作用3350-362(1990)；Stancovski等，PNAS(USA)888691-8695(1991)；Bacus等，癌癥研究522580-2589(1992)；Xu等，國(guó)際癌癥研究53401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk等，癌癥研究522771-2776(1992)；Hancock等，癌癥研究514575-4580(1991)；Shawver等，癌癥研究541367-1373(1994)；Arteaga等，癌癥研究543758-3765(1994)；Harwerth等，生物化學(xué)雜志26715160-15167(1992)；美國(guó)專利號(hào)5783186；和Klapper等，癌基因142099-2109(1997)。
同源性篩選導(dǎo)致了其它兩個(gè)ErbB受體家族成員的鑒定ErbB3(美國(guó)專利5183884和5480968以及Kraus等，PNAS(USA)869193-9197(1989))和ErbB4(歐洲專利申請(qǐng)599274；Plowman等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，901746-1750(1993)；和Plowman等，自然，366473-475(1993))。所有這些受體在至少部分乳腺癌細(xì)胞系上表現(xiàn)為表達(dá)增加。
ErbB受體通常以各種組合方式存在于細(xì)胞中，而且認(rèn)為異二聚體化增加了對(duì)各種ErbB配體的細(xì)胞應(yīng)答的多樣性(Earp等，乳腺癌研究和治療35115-132(1995))。EGFR可被六種不同的配體結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)，雙調(diào)蛋白(amphiregulin)，肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)，betacellulin和表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)(Groenen等，生長(zhǎng)因子11235-257(1994))。由單基因的選擇性剪接產(chǎn)生的heregulin蛋白家族是ErbB3和ErbB4的配體。該heregulin家族包括α、β和γ-heregulins(Holmes等，科學(xué)，2561205-1210(1992)；美國(guó)專利5641869；和Schaefer等，癌基因151385-1394(1997))；neu分化因子(NDFs)，神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGFs)；乙酰膽堿誘導(dǎo)活性(ARIA)；以及感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF)。關(guān)于其綜述見(jiàn)Groenen等，生長(zhǎng)因子11235-257(1994)；Lemke，G分子和細(xì)胞神經(jīng)學(xué)，7247-262(1996)和Lee等，Pharm.Rev.4751-85(1995)。最近鑒定了另外三個(gè)ErbB配體neuregulin-2(NRG-2)，據(jù)報(bào)道其與ErbB3或ErbB4結(jié)合(Chang等，自然387509-512(1997)和Garraway等，自然387512-516(1997))；與ErbB4結(jié)合的neuregulin-3(Zhang等，PNAS(USA)94(18)9562-7(1997))；和與ErbB4結(jié)合的neuregulin-4(Harari等，癌基因182681-89(1999))。HB-EGF、betacellulin和表皮調(diào)節(jié)素也與ErbB4結(jié)合。
雖然EGF和TGFα不結(jié)合ErbB2，但EGF刺激EGFR和ErbB2形成異二聚體，其活化EGFR并導(dǎo)致異二聚體中ErbB2的轉(zhuǎn)磷酸化作用。二聚體化和/或轉(zhuǎn)磷酸化作用可活化ErbB2酪氨酸激酶。見(jiàn)Earp等，出處同上。同樣，當(dāng)ErbB3與ErbB2共表達(dá)時(shí)，形成活性信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，并且針對(duì)ErbB2的抗體能破壞這種復(fù)合物(Sliwkowski等，生物化學(xué)雜志，269(20)14661-14665(1994))。另外，當(dāng)與ErbB2共表達(dá)時(shí)，ErbB3對(duì)heregulin(HRG)的親和力增加到更高的親和力狀態(tài)。關(guān)于ErbB2-ErbB3蛋白復(fù)合物，另見(jiàn)Levi等，神經(jīng)學(xué)雜志151329-1340(1995)；Morrissey等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊921431-1435(1995)；和Lewis等，癌癥研究，561457-1465(1996)。同ErbB3相似，ErbB4可與ErbB2形成活性信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物(Garraway和Cantley，細(xì)胞785-8(1994))。
發(fā)明概述首先，本發(fā)明提供了治療人體腫瘤的方法，包括向人體給藥治療有效量的與ErbB2結(jié)合的抗體，其中所述腫瘤表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)。
本文涉及利用與ErbB2結(jié)合的抗體治療所述癌癥時(shí)與EGFR-靶向藥物相比的各種優(yōu)點(diǎn)。尤其是在肝和皮膚中EGFR高度表達(dá)，這給活性藥物提供了與EGFR結(jié)合的廣泛部位。另外，對(duì)于其它靶向EGFR的藥物如嵌合抗EGFR抗體C225以及與EGFR結(jié)合的小分子藥物ZD1839，已經(jīng)觀察到皮膚毒性。預(yù)計(jì)結(jié)合ErbB2的抗體具有比這些藥物更好的安全性。
當(dāng)本文中用于治療的抗體能阻斷ErbB受體的配體活化作用和/或具有單克隆抗體2C4的生物學(xué)特點(diǎn)時(shí)，可實(shí)現(xiàn)更多的優(yōu)點(diǎn)。例如靶向EGFR的藥物僅干擾EGFR，但本文中具體目的抗體(例如2C4，包括其人源化變體和/或其親和力成熟的變體)將干擾EGFR/ErbB2、ErbB3/ErbB4和ErbB2/ErbB3異二聚體。另外，本文中結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體將與靶向EGFR的藥物互補(bǔ)，而此時(shí)靶向EGFR的藥物相互之間并不互補(bǔ)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療人體癌癥的方法，其中所述癌癥的特點(diǎn)不是ErbB2受體的過(guò)度表達(dá)，所述方法包括向人體給藥治療有效量的與ErbB2結(jié)合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。
另外，本發(fā)明提供了治療人體中激素非依賴性癌癥的方法，包括向人體給藥治療有效量的、結(jié)合ErbB2受體并阻斷ErbB受體之配體活化作用的抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療人體癌癥的方法，包括向人體給藥治療有效量的(a)結(jié)合ErbB2并抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的第一種抗體；和(b)結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二種抗體。
本發(fā)明還提供了治療人體癌癥的方法，其中所述癌癥選自結(jié)腸、直腸和結(jié)腸直腸的癌癥，包括給人體給藥治療有效量的結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于上述方法的產(chǎn)品(在其它物品之中)。例如，本發(fā)明提供了包括容器和其中所組合物的產(chǎn)品，其中所述組合物包括結(jié)合ErbB2的抗體，該產(chǎn)品進(jìn)一步包括包裝插頁(yè)(a package insert)，其說(shuō)明所述組合物能用來(lái)治療表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的癌癥。
本發(fā)明另外還涉及包括容器和其中所含組合物的產(chǎn)品，其中所述組合物包括結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，該產(chǎn)品進(jìn)一步包括包裝插頁(yè)，其說(shuō)明所述組合物能用來(lái)治療癌癥，其中所述癌癥的特點(diǎn)不是ErbB2受體過(guò)度表達(dá)。
本發(fā)明還涉及包括容器和其中所含組合物的產(chǎn)品，其中所述組合物包括結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，該產(chǎn)品進(jìn)一步包括包裝插頁(yè)，其說(shuō)明所述組合物能用來(lái)治療激素非依賴性癌癥。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供的產(chǎn)品包括(a)裝有組合物的第一個(gè)容器，其中所述組合物包括結(jié)合ErbB2并抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的第一種抗體；和(b)裝有組合物的第二個(gè)容器，其中所述組合物包括結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二種抗體。
本發(fā)明提供了包括容器和其中所含組合物的另一產(chǎn)品，其中所述組合物包括結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，并且該產(chǎn)品進(jìn)一步包括包裝插頁(yè)，其說(shuō)明所述組合物能用來(lái)治療選自結(jié)腸癌、直腸癌和結(jié)腸直腸癌的癌癥。
本發(fā)明另外還提供了結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的人源化抗體；包括該人源化抗體和可藥用載體的組合物；包括與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)的人源化抗體的免疫偶聯(lián)物。
而且，本發(fā)明提供了分離的編碼該人源化抗體的核酸；包含該核酸的載體；包含所述核酸或載體的宿主細(xì)胞；以及制備所述人源化抗體的方法，包括培養(yǎng)含所述核酸的宿主細(xì)胞，使所述核酸表達(dá)，并任選進(jìn)一步包括從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物(例如所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基)中回收該人源化抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有與ErbB2結(jié)合的抗體的免疫偶聯(lián)物，該抗體與一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子偶聯(lián)，還涉及在人體中利用所述偶聯(lián)物治療表達(dá)ErbB2的癌，例如ErbB2過(guò)度表達(dá)的癌。偶聯(lián)物中的抗體優(yōu)選單克隆抗體4D5，例如人源化4D5(并且優(yōu)選huMAb4D5-8(HERCEPTIN))；或者優(yōu)選單克隆抗體2C4，例如人源化2C4。免疫偶聯(lián)物中的抗體可以是完整的抗體(例如完整的IgG1抗體)或者是抗體片段(例如Fab、F(ab)2、二價(jià)抗體(diabody)等)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B描述了在ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)中殘基22-645(包括信號(hào)序列的氨基酸序列，見(jiàn)圖1和SEQ ID NO13所示)的表位作圖，它是通過(guò)截短突變分析和定點(diǎn)誘變的方法確定(Nakamura等，病毒學(xué)雜志(67(10)6179-6191)(1993)；和Renz等，細(xì)胞生物學(xué)雜志，125(6)1395-1406(1994))。各種ErbB2-ECD截短突變體體或點(diǎn)突變體是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從cDNA產(chǎn)生。ErbB2突變體在哺乳動(dòng)物的表達(dá)質(zhì)粒中表達(dá)為gD融合蛋白。這種表達(dá)質(zhì)粒使用了巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和SV40終止序列以及位于cDNA插入片段下游的聚腺苷酸信號(hào)。用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染一天后，將細(xì)胞在無(wú)甲硫氨酸和半胱氨酸的低糖DMEM培養(yǎng)基中通過(guò)代謝(metabolically)標(biāo)記過(guò)夜，所述DMEM培養(yǎng)基中含1％經(jīng)透析的胎牛血清和25μCi35S甲硫氨酸以及25μCi35S半胱氨酸。收獲上清，并向上清中加入抗ErbB2單克隆抗體或?qū)φ湛贵w，4℃培育2-4、時(shí)。沉淀復(fù)合物，在10-20％Iricine SDS梯度凝膠上用100V電壓進(jìn)行電泳。將該凝膠電印跡到膜上并通過(guò)放射自顯影進(jìn)行分析。如圖1B所示，抗ErbB2抗體7C2、7F3、2C4、7D3、3E8、4D5、2H11和3H4結(jié)合各種ErbB2 ECD表位。
圖2A和2B表明抗ErbB2單克隆抗體2C4和7F3對(duì)MCF7細(xì)胞的rHRGβ1活化作用的影響。圖2A表明2C4或7F3抑制HRG刺激酪氨酸磷酸化的劑量-應(yīng)答曲線。圖2B表明2C4或7F3抑制125I標(biāo)記的rHRGβ1177-244與MCF7細(xì)胞結(jié)合的劑量-應(yīng)答曲線。
圖3描述了抗ErbB2單克隆抗體2C4或7F3抑制125I標(biāo)記的特異性rHRGβ1177-244與一組人腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合。對(duì)照單克隆抗體是不阻斷rHRG結(jié)合的同種型匹配的鼠單克隆抗體。在100nM rHRGβ1存在的條件下通過(guò)平行溫育確定125I標(biāo)記的非特異性rHRGβ1177-244的結(jié)合。125I標(biāo)記的非特異性rHRGβ1177-244的結(jié)合小于所有檢測(cè)的細(xì)胞系的總結(jié)合的1％。
圖4A和圖4B表明單克隆抗體2C4和4D5對(duì)MDA-MB-175(圖4A)和SK-BR-3(圖4B)細(xì)胞的增殖的影響。將MDA-MB-175和SK-BR-3細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板中，并使其粘附2小時(shí)。在含1％血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入抗ErbB2抗體或僅加入培養(yǎng)基，將細(xì)胞在37℃中培養(yǎng)2小時(shí)。隨后加入rHRGβ1(1nM)或僅加入培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞4天。洗滌單層細(xì)胞并用0.5％結(jié)晶紫染色/固定。在540nm處檢測(cè)吸光度來(lái)確定細(xì)胞的增殖。
圖5A和5B表明在以低/正常水平表達(dá)ErbB2的MCF7細(xì)胞(圖5A)和高水平表達(dá)ErbB2的SK-BR-3細(xì)胞(圖5B)中，單克隆抗體2C4，HERCEPTIN抗體或抗EGFR抗體對(duì)ErbB2與ErbB3的heregulin(HRG)依賴性結(jié)合的影響，見(jiàn)下述實(shí)施例2。
圖6A和圖6B比較了完整的鼠單克隆抗體2C4(mu 2C4)和嵌合型2C4Fab片段的活性。圖6A表明嵌合型2C4 Fab或完整的鼠單克隆抗體2C4對(duì)125I-HRG與MCF7細(xì)胞結(jié)合的抑制。將MCF7細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板中(1×105細(xì)胞/孔)并培養(yǎng)2天致約85％細(xì)胞匯合。按Lewis等(癌癥研究561457-1465(1996))所述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖6B描述了對(duì)MCF7細(xì)胞中對(duì)rHRGβ1活化p180酪氨酸磷酸化的作用的抑制，按Lewis等(癌癥研究561457-1465(1996))所述方法進(jìn)行。
圖7A和圖7B描述了對(duì)下述序列的排列對(duì)比(alignment)，即小鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變區(qū)(VL)(圖7A)和重鏈可變區(qū)(VH)(圖7B)氨基酸序列(分別見(jiàn)SEQ ID NOs 1和2)；人源化2C4抗體574的VL和VH區(qū)(分別見(jiàn)SEQID Nos 3和4)，以及人VL和VH的共有框架(humκ1，輕鏈κ亞群I；humIII，重鏈亞群III)(分別見(jiàn)SEQ ID Nos 5和6)。星號(hào)表明人源化2C4抗體574和鼠單克隆抗體2C4之間或人源化2C4抗體574和人的框架之間的差異?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)用括號(hào)標(biāo)出。
圖8A-C表明按實(shí)施例3的ELISA法檢測(cè)的嵌合型Fab 2C4(Fab.vl)和幾種人源化2C4變體與ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的結(jié)合。
圖9是單克隆抗體2C4的VL和VH的帶狀圖，其中對(duì)白色的CDR骨架作標(biāo)記(L1、L2、L3、H1、H2、H3)。還給出了人源化期間用誘變法評(píng)估的VH側(cè)鏈(參見(jiàn)實(shí)施例3，表2)。
圖10描述了單克隆抗體2C4或HERCEPTIN對(duì)EGF、TGF-α或HRG介導(dǎo)的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化作用的影響。
圖11是表明抗ErbB2抗體(單獨(dú)或聯(lián)合)對(duì)Calu3肺腺癌異種移植瘤(3+ErbB2過(guò)度表達(dá))的作用的條圖。注治療在第24天終止。
圖12描述了重組人源化單克隆抗體2C4(rhuMAb 2C4)或HERCEPTIN對(duì)MDA-175細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，用Alamar Blue檢測(cè)法測(cè)定。
圖13表明rhuMAb 2C4抗MCF7異種移植物的效果。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述I.定義“ErbB受體”是受體蛋白酪氨酸激酶，屬于ErbB受體家族并且包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4受體和在將來(lái)被鑒定的此家族其它成員。ErbB受體通常包括可結(jié)合ErbB配體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和含幾個(gè)可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號(hào)結(jié)構(gòu)域。ErbB受體可以是“天然序列”ErbB受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選該ErbB受體是天然序列人ErbB受體。
術(shù)語(yǔ)“ErbB1”、“表皮生長(zhǎng)因子受體”和“EGFR”在本文中可互換應(yīng)用，是指如Carpenter等(Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987))公開的EGFR，包括其天然突變型(例如Humphrey等(PNAS(USA)874207-4211(1990))所述缺失突變型EGFR)。erbB1是指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因。
詞語(yǔ)“ErbB2”和“HER2”在本文中可互換應(yīng)用，是指如Semba等(PNAS(USA)826497-6501(1985))和Yamamoto等(自然319230-234(1986))所述的HER2蛋白(Genebank登記號(hào)X03363)。術(shù)語(yǔ)“erbB2”是指編碼人ErbB2的基因，而“neu”是指編碼大鼠p185neu的基因。優(yōu)選的ErbB2是具有天然序列的人ErbB2。
“ErbB3”和“HER3”是指如美國(guó)專利5183884和5480968以及Kraus等(PNAS(USA)869193-9197(1989))公開的受體多肽。
本文中“ErbB4”和“HER4”是指在下述文獻(xiàn)中公開的受體多肽，如歐洲專利申請(qǐng)599274、Plowman等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，901746-1750(1993)、和Plowman等，自然，366473-475(1993)，包括其同種型，如在1999年4月22公開的WO99/19488中所述。
“ErbB配體”是指結(jié)合和/或活化ErbB受體的多肽。本文中特定目的ErbB配體是天然序列的人ErbB配體，例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Savage等，生物學(xué)化學(xué)雜志2477612-7621(1972))；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-α)(Marquardt等，科學(xué)2231079-1082(1984))；雙調(diào)蛋白，也稱為神經(jīng)鞘瘤(Schwanoma)或角質(zhì)細(xì)胞自分泌生長(zhǎng)因子(Shoyab等，科學(xué)2431074-1076(1989)；Kimura等，自然348257-260(1990)；Cook等，分子細(xì)胞生物學(xué)112547-2557(1991))；betacellulin(Shing等，科學(xué)2591604-1607(1993)；和Sasada等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1901173(1993))；肝素結(jié)合型表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)(Higashiyama等，科學(xué)251936-939(1991))；表皮調(diào)節(jié)素(Toyoda等，生物學(xué)化學(xué)雜志2707495-7500(1995)；和Komurasaki等，癌基因152841-2848(1997))；heregulin(見(jiàn)下述)；neuregulin-2(NRG-2)(Garraway等，自然387512-516(1997))；neuregulin-3(NRG-3)(Zhang等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊949562-9567(1997))；neuregulin-4(NRG-4)(Harari等，癌基因182681-89(1999))或cripto(CR-1)(Kannan等，生物學(xué)化學(xué)雜志272(6)3330-3335(1997))。結(jié)合EGFR的ErbB配體包括EGF，TGF-α，amphiregulin，betacellulin，HB-EGF和表皮調(diào)節(jié)素。結(jié)合ErbB 3的ErbB配體包括hereglin。能結(jié)合ErbB4的ErbB配體包括betacellulin、表皮調(diào)節(jié)素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和heregulin。
“Heregulin”(HRG)在本文中是指如美國(guó)專利5641869或Marchionni等(自然，362312-318(1993))公開的heregulin基因編碼的多肽。heregulin的實(shí)例包括heregulin-α、heregulin-β1、heregulin-β2和heregulin-β3(Holmes等，科學(xué)2561205-1210(1992)；和美國(guó)專利5641869)；neu分化因子(NDE)(Peles等，細(xì)胞69205-216(1992))；乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)(Falls等，細(xì)胞72801-815(1993))；神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF)(Marchionni等，自然，362312-318(1993))；感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生的因子(SMDF)(Ho等，生物學(xué)化學(xué)雜志27014523-14532(1995))；γ-heregulin(Schaefer等，癌基因151385-1394(1997))。該術(shù)語(yǔ)包括天然序列HRG多肽的生物學(xué)活性片段和/或其氨基酸序列變體，例如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段(如HRGβ1117-244)。
本文中“ErbB異寡聚體”是指包括至少兩種不同ErbB受體的非共價(jià)結(jié)合型寡聚體。當(dāng)表達(dá)兩種或多種ErbB受體的細(xì)胞暴露于ErbB配體時(shí)，可形成這樣的復(fù)合物，其可通過(guò)免疫沉淀法分離并可通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析，例如Sliwkowski等(生物學(xué)化學(xué)雜志269(20)14661-14665(1994))所述。這類ErbB異寡聚體的實(shí)例包括EGFR-ErbB2、ErbB2-ErbB3和ErbB3-ErbB4復(fù)合物。而且，所述ErbB異寡聚體可包括兩種或多種與不同ErbB受體(例如ErbB3、ErbB4或EGFR)組合的ErbB2受體。在該異寡聚體中可包括其它蛋白如細(xì)胞因子受體亞單位(如gp130)。
“ErbB受體的配體活化作用”是指由與含目的ErbB受體的ErbB異寡聚體結(jié)合的ErbB配體所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)(例如由ErbB受體的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域使ErbB受體或底物多肽中酪氨酸殘基磷酸化所引起的信號(hào)傳導(dǎo))。這通常涉及ErbB配體與ErbB異寡聚體的結(jié)合，該結(jié)合可活化異寡聚體中一個(gè)或多個(gè)ErbB受體的激酶結(jié)構(gòu)域，并且因此導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)ErbB受體中酪氨酸殘基的磷酸化，和/或其它底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化。ErbB受體活化可利用各種酪氨酸磷酸化試驗(yàn)定量。
“天然序列”多肽是指其氨基酸序列與天然來(lái)源多肽(例如ErbB受體或ErbB配體)相同的多肽。此天然序列多肽可從自然中分離，或者可通過(guò)重組或合成方法制備。因此，天然序列多肽可具有天然發(fā)生的人多肽、鼠多肽或其它哺乳動(dòng)物物種來(lái)源多肽的氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列變體”是指其氨基酸序列與天然序列多肽有一定程度的差異的多肽。通常，氨基酸序列變體與天然ErbB配體的至少一個(gè)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與天然ErbB受體的至少一個(gè)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，有至少約70％的同源性，優(yōu)選所述同源性至少約80％，更優(yōu)選至少約90％。所述氨基酸序列變體在天然氨基酸序列中某些位點(diǎn)上具有取代、缺失和/或插入。
“同源性”定義為在將序列排列對(duì)比并引入缺口(如果需要)而得到同源性的最大百分率之后，氨基酸序列變體中相同殘基的百分率。用于排列的方法和計(jì)算機(jī)程序在本領(lǐng)域眾所周知。一種這樣的計(jì)算機(jī)程序是由Genentech，Inc.享有主權(quán)的“Align 2”，它和用戶文件于1991年12月10日提交至美國(guó)版權(quán)局(Washington，DC 20559)。
本文中術(shù)語(yǔ)“抗體”是指最廣義上的抗體，具體包括完整的單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要其顯示所需生物學(xué)活性。
本文中術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指來(lái)自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個(gè)抗體均相同。單克隆抗體具有高度的特異性，針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。而且，與包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體是針對(duì)抗原上的單個(gè)表位。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們可被合成并不受其它抗體的污染。修飾詞“單克隆”表明該抗體的特點(diǎn)，即其來(lái)自基本上同質(zhì)的抗體群，不解釋為需通過(guò)任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的單克隆抗體可通過(guò)由Kohler等(自然，256495(1975))首先描述的雜交瘤法進(jìn)行制備，或者可通過(guò)重組DNA法進(jìn)行制備(例如見(jiàn)美國(guó)專利4816567)。“單克隆抗體”還可利用例如Clackson等(自然，352624-628(1991))和Marks等(分子生物學(xué)雜志，222581-597(1991))所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離。
本文中單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特殊物種或?qū)儆谔厥饪贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，但所述鏈的剩余部分的序列與源自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性)的相應(yīng)序列相同或同源(美國(guó)專利4816567；和Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，816851-6855(1984))。本文中目的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類化”抗體，其包括源自非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如Old World Monkey，Ape等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選包括其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二價(jià)抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
“完整”抗體是包括抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)CH1、CH2和CH3的抗體。所述恒定區(qū)可以是天然序列恒定區(qū)(例如人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。優(yōu)選完整抗體具有一種或多種效應(yīng)功能。
抗體的“效應(yīng)功能”是指那些可歸因于抗體Fc段(天然序列Fc段或氨基酸序列變體Fc段)的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)功能的實(shí)例包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(如B細(xì)胞受體；BCR)等的下調(diào)。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將完整抗體分成不同的“類”。主要有5類完整抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些抗體可進(jìn)一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。免疫球蛋白不同類的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象眾所周知。
“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”和“ADCC”是指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒細(xì)胞(例如自然殺傷(NK)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗體，隨后引起該靶細(xì)胞裂解。介導(dǎo)ADCC作用的主要細(xì)胞NK細(xì)胞僅表達(dá)FcγRIII，而單核細(xì)胞則表達(dá)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。關(guān)于造血細(xì)胞上FcR表達(dá)的總結(jié)見(jiàn)Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92(1991)的464頁(yè)上的表三。為了評(píng)價(jià)目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC檢測(cè)，例如美國(guó)專利5500362或5821337中所述。用于這類檢測(cè)的有效效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?或另外)，可在體內(nèi)，例如在Clynes等(PNAS(USA)，95652-656(1998))所述的動(dòng)物模型中，評(píng)估目的分子的ADCC活性。
“人類效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)功能的白細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞至少表達(dá)FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)功能。介導(dǎo)ADCC作用的人類白細(xì)胞的實(shí)例包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細(xì)胞，單核細(xì)胞，細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。所述效應(yīng)細(xì)胞可從其天然來(lái)源中分離，例如從本文所述血液或PBMC中分離。
術(shù)語(yǔ)“Fc受體”或“FcR”用來(lái)描述與抗體Fc段結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的受體(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類(包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接型)。FcγRII受體包括具有相似的氨基酸序列的FcγRIIA(“活化受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，其主要區(qū)別在于其細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)域。活化受體FcγRIIA在其細(xì)胞漿結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞漿結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸為基礎(chǔ)的抑制基序(ITIM)。(見(jiàn)綜述M.in Daeron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的綜述見(jiàn)Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)；Capel等，免疫學(xué)方法425-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)。本文中術(shù)語(yǔ)“FcR”函蓋其它FcR，包括那些在將來(lái)將被鑒定的FcR。該術(shù)語(yǔ)還包括負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移到胎兒的新生期受體FcRn(Guyer等，免疫學(xué)雜志117587(1976)和Kim等，免疫學(xué)雜志24249(1994))。
“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用”或“CDC”是指在補(bǔ)體存在的條件下分子裂解靶的能力。補(bǔ)體系統(tǒng)的第一個(gè)組分(C1q)與結(jié)合相關(guān)(cognate)抗原的分子(例如抗體)的結(jié)合可起始補(bǔ)體激活途徑。為了評(píng)價(jià)補(bǔ)體活化作用，可進(jìn)行CDC檢測(cè)，如Gazzano-Santoro等(免疫學(xué)方法雜志202163(1996))所述。
“天然抗體”通常是約150000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕鏈(L)和兩個(gè)相同的重鏈(H)組成。每個(gè)輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間的二硫鍵數(shù)目并不相同。每個(gè)重鏈和輕鏈中還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每個(gè)重鏈在其一個(gè)末端有可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每個(gè)輕鏈在其一個(gè)末端有可變區(qū)(VL)，而另一端是恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)相對(duì)應(yīng)(align)，而輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)相對(duì)應(yīng)。特殊的氨基酸殘基被認(rèn)為在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語(yǔ)“可變”是指可變區(qū)某些部分的序列在抗體之間有很大差異，它們可在各個(gè)抗體對(duì)其特殊抗原的結(jié)合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性不是均勻的分布于整個(gè)抗體的可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個(gè)稱為超變區(qū)的節(jié)段中。可變區(qū)中保守性較高的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個(gè)FR，主要采取β折疊構(gòu)象，被三個(gè)超變區(qū)相連接，形成環(huán)狀連接，而在一些情況中形成β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。各個(gè)鏈的超變區(qū)通過(guò)FR緊密的靠近在一起，并且與其它鏈的超變區(qū)一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出各種效應(yīng)功能，例如在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)中抗體的參與。
術(shù)語(yǔ)“超變區(qū)”在本文中是指抗體上負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的氨基酸序列。所述超變區(qū)通常包括“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))和/或那些“超變環(huán)”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物學(xué)雜志196901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基是那些除了本文所定義的超變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
木瓜蛋白酶消化抗體可產(chǎn)生兩個(gè)相同的各帶有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段)和殘余的“Fc”片段，F(xiàn)c段的名稱反應(yīng)了其易于結(jié)晶的能力。經(jīng)胃蛋白酶處理可產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍然能交聯(lián)抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”段是含有完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)由緊密地非共價(jià)連接的一個(gè)重鏈可變區(qū)與一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在這個(gè)構(gòu)象中每個(gè)可變區(qū)的三個(gè)超變區(qū)相互作用，在VH-VL二聚體表面限定一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。這六個(gè)超變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或Fv上僅含有二個(gè)抗原特異性高變區(qū)的那一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，但與完整的結(jié)合位點(diǎn)相比其親和力較低。
Fab段還包括輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)(CH1)。Fab’與Fab的差別在于Fab’在重鏈CH1的羧基末端多出幾個(gè)殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定區(qū)半胱氨酸殘基中至少有一個(gè)游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段在最初產(chǎn)生為Fab’片段對(duì)，在它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)是眾所周知的。
脊椎動(dòng)物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可以是兩種完全不同的型(κ和λ)之一，型別區(qū)分的依據(jù)是其恒定區(qū)氨基酸序列。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈上。優(yōu)選Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含一個(gè)多肽接頭，它能使scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見(jiàn)Pluckthun在《單克隆抗體的藥理學(xué)》，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(yè)(1994)。抗ErbB2抗體scFv片段見(jiàn)WO93/16185、美國(guó)專利5571894和美國(guó)專利5587458中所述。
術(shù)語(yǔ)“二價(jià)抗體(diabodies)”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的一個(gè)重鏈可變區(qū)(VH)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域無(wú)法配對(duì)，不得不與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，906444-6448(1993)中有對(duì)二價(jià)抗體的更詳細(xì)描述。
非人類(例如嚙齒類動(dòng)物)抗體的“人源化”型是嵌合抗體，其包括最小限度的源自非人類免疫球蛋白的序列。在很大程度上，人源化抗體是人類的免疫球蛋白(接受體抗體)，其中接受體的超變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人類靈長(zhǎng)類等非人類物種的(供體抗體)超變區(qū)殘基所取代。在一些實(shí)例中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在接受體抗體或供體抗體中不存在的殘基。這些修飾旨在進(jìn)一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(gè)(通常包括兩個(gè))可變區(qū)的全部，其中超變環(huán)的全部或基本上全部對(duì)應(yīng)于非人類免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。詳見(jiàn)Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
人源化抗ErbB2抗體包括美國(guó)專利5821337(引入作參考)的表3中所述的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN)；人源化520C9(WO93/21319)和如下所述的人源化2C4抗體。
“分離的”抗體是已從其天然環(huán)境的組成中鑒定、分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該抗體的純度應(yīng)達(dá)到(1)經(jīng)Lowery法確定的抗體重量的95％以上，最優(yōu)選所述重量的99％以上，(2)足以獲得用旋轉(zhuǎn)杯狀(spinning cup)序列分析儀所測(cè)至少15個(gè)殘基的N端或內(nèi)部氨基酸序列，(3)通過(guò)還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色、優(yōu)選銀染所證實(shí)的同質(zhì)性。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)樵摽贵w的自然環(huán)境中的至少一種組分已不存在。一般情況下分離的抗體可通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。
“結(jié)合”目的抗原(例如ErbB2抗原)的抗體是能以足夠的親和力結(jié)合該抗原，而使該抗體在靶向表達(dá)該抗原的細(xì)胞中作為有效的治療藥物那些抗體。在所述抗體為結(jié)合ErbB2的抗體時(shí)，與其它ErbB受體相比，它通常優(yōu)選結(jié)合ErbB2，并且它可以是與EGFR、ErbB3或ErbB4等其它蛋白沒(méi)有顯著的交叉相互作用的抗體。在這類實(shí)施方案中，當(dāng)用熒光活化細(xì)胞分揀術(shù)(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)等方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，該抗體與這些非ErbB2蛋白的結(jié)合(例如與內(nèi)源性受體的細(xì)胞表面結(jié)合)程度將小于10％。有時(shí)，抗ErbB2抗體與大鼠neu蛋白不發(fā)生顯著的交叉相互作用，例如Schecter等，自然312513(1984)和Drebin等，自然312545-548(1984)中所述。
“阻斷”ErbB受體的配體活化作用的抗體是降低或防止上述這種活化作用的抗體，其中該抗體能以遠(yuǎn)比單克隆抗體4D5更為有效地(例如與單克隆抗體7F3或2C4或其Fab片段一樣有效，優(yōu)選與單克隆抗體2C4或其Fab片段一樣有效)阻斷ErbB受體的配體活化作用。例如，阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體可以是在阻斷ErbB異寡聚體形成的方面比4D5的有效性約高50-100％的抗體。對(duì)ErbB受體的配體活化作用的阻斷可通過(guò)任何方式發(fā)生，例如通過(guò)干擾配體與ErbB受體的結(jié)合、ErbB復(fù)合物的形成、ErbB復(fù)合物中ErbB受體的酪氨酸激酶活性和/或ErbB受體的酪氨酸激酶殘基的磷酸化。阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體實(shí)例包括單克隆抗體2C4和7F3(其阻斷ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4異寡聚體的HRG活化作用；和EGFR/ErbB2異寡聚體的EGF、TGF-α、amphiregulin、HB-EGF和/或表皮調(diào)節(jié)素的活化作用)；和L26、L96和L288抗體(Klapper等，癌基因142099-2109(1997))，其阻斷EGF和NDF與表達(dá)EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4的T47D細(xì)胞的結(jié)合。
具有所指抗體(例如稱為2C4的單克隆抗體)的“生物學(xué)特性”的抗體，是指具有所指抗體的一種或多種生物學(xué)特性的抗體，這些特性使此抗體區(qū)別于結(jié)合相同抗原(例如ErbB2)的其它抗體。例如，具有2C4的生物學(xué)特性的抗體可阻斷含ErbB2和ErbB3或ErbB4的ErbB異寡聚體被HRG活化的作用；阻斷ErbB受體(包括EGFR和ErbB2)被EGF、TGF-α、HB-EGF、表皮調(diào)節(jié)素和/或amphiregulin活化的作用；阻斷MAPK被EGF、TGF-α和/或HRG介導(dǎo)活化的作用；和/或與ErbB2的胞外結(jié)構(gòu)域中可被2C4結(jié)合的表位結(jié)合(例如其阻斷單克隆抗體2C4與ErbB2的結(jié)合)。
除非另外指明，詞語(yǔ)“單克隆抗體2C4”是指具有下述實(shí)施例中鼠2C4抗體(或衍生自該2C4抗體)的抗原結(jié)合殘基的抗體。例如，該單克隆抗體2C4可以是鼠單克隆抗體2C4或其具有鼠單克隆抗體2C4的抗原結(jié)合氨基酸殘基的變體，例如人源化抗體2C4。人源化2C4抗體的實(shí)例見(jiàn)下述實(shí)施例3。除非另外指明，在本文中詞語(yǔ)“rhuMAb 2C4”是指含有分別示于SEQ ID No.3和4的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)序列，并且這些序列已與任選由中國(guó)倉(cāng)鼠卵(CHO)細(xì)胞表達(dá)的人的輕鏈和重鏈IgG1(非A同種異型)恒定區(qū)融合的那些抗體。
除非另外指明，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體4D5”指具有鼠4D5(ATCC CRL 10463)抗體(或衍生自4D5抗體)的抗原結(jié)合殘基的抗體。例如，該單克隆抗體4D5可以是鼠單克隆抗體4D5或其具有鼠單克隆抗體4D5的抗原結(jié)合氨基酸殘基的變體，例如人源化抗體4D5。4D5抗體實(shí)例包括如美國(guó)專利5,821,337中所述的huMAb 4D5-1、huMAb 4D5-2、huMAb 4D5-3、huMAb 4D5-4、huMAb 4D5-5、huMAb 4D5-6、huMAb 4D5-7和huMAb 4D5-8(HERCEPTIN)，其中huMAb4D5-8(HERCEPTIN)是優(yōu)選的人源化4D5抗體。
本文中“生長(zhǎng)抑制劑”是指在體內(nèi)或體外抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，尤其抑制表達(dá)ErbB的癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低S期ErbB表達(dá)細(xì)胞百分比的藥物。生長(zhǎng)抑制劑的實(shí)例包括阻斷細(xì)胞周期(在除S期以外的某個(gè)階段)進(jìn)展的藥物，例如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥物。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春花類(長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)，紫杉烷(taxane)和topo II抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊甙(etoposide)和博來(lái)霉素等。那些使G1期停滯的藥物還連帶(spill over)使S期停滯，例如DNA烷化劑象他莫昔芬、強(qiáng)的松、達(dá)卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、順鉑、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。詳見(jiàn)《癌癥的分子基礎(chǔ)》Mendelsohn和Israel編，第一章，Murakami等的題為“細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、癌基因和抗腫瘤藥”的文章(WB SaundersPhiladephia，1995)，尤其見(jiàn)13頁(yè)。
“生長(zhǎng)抑制性”抗體實(shí)例是與ErbB2結(jié)合并抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的那些抗體。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2抗體在約0.5-30μl/ml的濃度下可使細(xì)胞培養(yǎng)中SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制20％以上，優(yōu)選50％以上(例如從約50％到約100％)，其中的生長(zhǎng)抑制是使SK-BR-3細(xì)胞暴露于所述抗體6天后檢測(cè)的(見(jiàn)1997年10月14日公布的美國(guó)專利5677171)。SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)詳見(jiàn)該專利以及下文。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制性抗體是單克隆抗體4D5，例如人源化4D5。
“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡”的抗體是使活細(xì)胞失去活性的抗體。所述細(xì)胞通常是表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞，尤其是過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞為癌細(xì)胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰腺或膀胱的細(xì)胞。在體外，所述細(xì)胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞。在體外的細(xì)胞死亡可在無(wú)補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行檢測(cè)，以便與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡進(jìn)行區(qū)分。因此，可使用熱滅活的血清(即在無(wú)補(bǔ)體的條件下)并在無(wú)免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行細(xì)胞死亡檢測(cè)。為了檢測(cè)抗體能否誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可通過(guò)評(píng)價(jià)相對(duì)于未處理細(xì)胞，對(duì)propidium iodide(PI)、臺(tái)盼藍(lán)(見(jiàn)Moore等，細(xì)胞技術(shù)171-11(1995))或7AAD的吸收來(lái)評(píng)估膜完整性的喪失。優(yōu)選的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)抗體是那些在BT474細(xì)胞的PI攝入試驗(yàn)中誘導(dǎo)PI攝入的抗體(見(jiàn)下述)。
“誘導(dǎo)凋亡”的抗體是指那些可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的抗體，所述凋亡可通過(guò)annexin V的結(jié)合，DNA片段化，細(xì)胞皺縮，內(nèi)織網(wǎng)膨脹，細(xì)胞碎裂，和/或膜泡(稱為凋亡小體)的形成確定。所述細(xì)胞通常是過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞。優(yōu)選所述細(xì)胞為癌細(xì)胞，例如乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰腺或膀胱的細(xì)胞。在體外，所述細(xì)胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu 3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞?？捎酶鞣N方法檢測(cè)與凋亡相關(guān)的細(xì)胞事件。例如，磷脂酰絲氨酸(PS)易位可通過(guò)annexin結(jié)合來(lái)測(cè)定；DNA片段化可通過(guò)DNA序列梯(laddering)來(lái)評(píng)估；與DNA片段化相伴的核/染色體濃縮可通過(guò)亞二倍體細(xì)胞中的任何增加來(lái)評(píng)估。優(yōu)選凋亡誘導(dǎo)抗體是在BT474細(xì)胞的annexin結(jié)合試驗(yàn)中，導(dǎo)致對(duì)annexin的結(jié)合為未處理細(xì)胞的約2-50倍，優(yōu)選約5-50倍，最優(yōu)選約10-50倍的那些抗體(見(jiàn)下述)。有時(shí)前凋亡性(pro-apoptotic)抗體是進(jìn)一步阻斷ErbB受體的ErbB配體活化作用的抗體(例如7F3抗體)，即所述抗體與單克隆抗體2C4有共同的生物學(xué)特點(diǎn)。在其它情況中，所述抗體是不明顯阻斷ErbB受體的ErbB配體活化作用的抗體(例如7C2抗體)。而且，該抗體可以是與7C2相似的抗體，其在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，不引起S期細(xì)胞的百分比大幅下降(例如與對(duì)照相比僅引起這些細(xì)胞的百分比下降約0-10％的抗體)。
“表位2C4”是ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中與抗體2C4結(jié)合的區(qū)域。為了篩選與2C4表位結(jié)合的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷試驗(yàn)，例如《抗體》，實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Harlow和David Lane編(1998)所述方法?；蛘撸蛇M(jìn)行表位作圖來(lái)評(píng)定抗體是否與ErbB2的2C4表位結(jié)合(例如ErbB2上從約殘基22到殘基584的區(qū)域中的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，包括這兩個(gè)端點(diǎn)殘基，見(jiàn)圖1A-B)。
“表位4D5”是ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中與抗體4D5(ATCC CRL 10463)結(jié)合的區(qū)域。該表位靠近ErbB2的跨膜結(jié)構(gòu)域。為了篩選與4D5表位結(jié)合的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷試驗(yàn)，例如《抗體》，實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Harlow和David Lane編(1998)所述方法。或者，可進(jìn)行表位作圖來(lái)評(píng)定抗體是否與ErbB2的4D5表位結(jié)合(例如ErbB2上從約殘基529到殘基625的區(qū)域中的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，包括這兩個(gè)端點(diǎn)殘基，見(jiàn)圖1A-B)。
“表位3H4”是ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中與抗體3H4結(jié)合的區(qū)域。該表位包括ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中從約541到約599(包括這兩個(gè)端點(diǎn)殘基)的殘基，見(jiàn)圖1A-B。
“表位7C2/7F3”是與7C2和/或7F3抗體(均在ATCC保存，見(jiàn)下述)結(jié)合的ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域N末端區(qū)域。為了篩選與7C2/7F3表位結(jié)合的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷試驗(yàn)，例如《抗體》，實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Harlow和David Lane編(1998)所述方法。或者，可進(jìn)行表位作圖來(lái)評(píng)定抗體是否與ErbB2的7C2/7F3表位結(jié)合(例如ErbB2上從約殘基22到殘基53的區(qū)域中的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，見(jiàn)圖1A-B)。
“治療”即指治療性處理也指預(yù)防性措施。需要治療者包括已患病者以及需要對(duì)疾病進(jìn)行預(yù)防者。因此，將要接受本文所述治療哺乳動(dòng)物可能被診斷為已患病或?qū)λ黾膊∫赘小?br> 需要治療的“哺乳動(dòng)物”是指歸為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園里的動(dòng)物、參與運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的動(dòng)物或?qū)櫸锶绻贰ⅠR、貓、牛等。優(yōu)選所述哺乳動(dòng)物為人類。
“疾病”是將從抗BrbB2抗體的治療中受益的任何情況。這包括慢性和急性疾病，包括哺乳動(dòng)物易感的特定疾病的病理狀況。在此將被治療的疾病的非限定實(shí)例包括良性和惡性腫瘤；白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星型細(xì)胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間質(zhì)和囊胚腔的疾病；炎性、血管原性和免疫性疾病。
術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指有效治療哺乳動(dòng)物疾病的藥物的量。如果是治療癌癥，則藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞的數(shù)量；減少腫瘤的大?。灰种?即減慢至一定程度，優(yōu)選終止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到外周器官中；抑制(即減慢至一定程度，優(yōu)選終止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上，抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或在一定程度上，緩解與癌癥相關(guān)的一或多種癥狀。至于所述藥物阻止生長(zhǎng)和/或殺傷現(xiàn)存癌細(xì)胞的程度，可以是抑制細(xì)胞和/或具有細(xì)胞毒性。至于腫瘤治療，可通過(guò)例如評(píng)估疾病進(jìn)展時(shí)間(TTP)和/或確定應(yīng)答率(RR)來(lái)測(cè)定其效力。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌性質(zhì)的”是指或描述哺乳動(dòng)物中以細(xì)胞生長(zhǎng)失控為典型特點(diǎn)的病理狀態(tài)。癌癥的實(shí)例包括但不限定于癌(carcinoma)，淋巴瘤，母細(xì)胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。更具體而言，這些癌包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀上皮癌)，腹膜癌，肝細(xì)胞癌(hepatocellular cancer)，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤(hepatoma)，乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepaticcrcinoma)，肛門癌，陰莖癌以及頭頸癌。
“表達(dá)ErbB的癌”含有于細(xì)胞表面攜帶ErbB蛋白的細(xì)胞?！氨磉_(dá)ErbB的癌”在其細(xì)胞表面產(chǎn)生足夠水平的ErbB2，而使抗ErbB2抗體能與其結(jié)合并對(duì)所述癌癥產(chǎn)生治療作用。
“以ErbB受體過(guò)度活化為特點(diǎn)”的癌是這樣的癌，其中癌細(xì)胞中的ErbB受體活化程度顯著高于相同組織類型的非癌性細(xì)胞中該受體的活化水平。此過(guò)度活化可起因于癌細(xì)胞中ErbB受體的過(guò)度表達(dá)和/或有效活化ErbB受體的ErbB配體高于正常水平。此過(guò)度活化可引起癌細(xì)胞的惡性狀態(tài)，和/或被癌細(xì)胞的惡性狀態(tài)引起。在一些實(shí)施方案中，可對(duì)所述癌癥進(jìn)行診斷性或預(yù)后性檢測(cè)，來(lái)確定導(dǎo)致此ErbB受體過(guò)度活化的ErbB受體擴(kuò)增和/或過(guò)度表達(dá)是否存在?；蛘?或另外)對(duì)所述癌癥進(jìn)行診斷性或預(yù)后性檢測(cè)，來(lái)確定促使此受體過(guò)度活化的ErbB配體擴(kuò)增和/或過(guò)度表達(dá)是否存在。在這些癌的一個(gè)亞群中，所述受體的過(guò)度活化可由自分泌刺激途徑引起。
在“自分泌”刺激途徑中，自我刺激的發(fā)生是因?yàn)樗霭┌Y細(xì)胞即產(chǎn)生ErbB配體又產(chǎn)生其相關(guān)的ErbB受體。例如，所述癌癥可表達(dá)或過(guò)度表達(dá)EGFR而且還表達(dá)或過(guò)度表達(dá)EGFR配體(例如EGF、TGF-α、或HB-EGF)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥可表達(dá)或過(guò)度表達(dá)ErbB2而且還表達(dá)或過(guò)度表達(dá)heregulin(如γ-HGR)。
“過(guò)度表達(dá)”ErbB受體的癌是在其細(xì)胞表面上的ErbB受體(例如ErbB2)水平顯著高于相同組織類型的非癌性細(xì)胞的那些癌。此過(guò)度表達(dá)可由基因擴(kuò)增或增加的轉(zhuǎn)錄或翻譯而引起。ErbB受體的過(guò)度表達(dá)可在通過(guò)評(píng)估細(xì)胞表面ErbB蛋白水平的增加(例如通過(guò)免疫組化試驗(yàn)；IHC)而進(jìn)行的診斷性或預(yù)后性檢測(cè)中確定?；蛘?或另外)，細(xì)胞中ErbB核酸的水平可通過(guò)如原位熒光雜交(FISH；見(jiàn)1998年10月公開的WO98/45479)，Southern印跡或?qū)崟r(shí)定量PCR(RT-PCR)等聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定。也可通過(guò)檢測(cè)血漿等生物體液中的脫落抗原(例如ErbB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)來(lái)研究ErbB受體過(guò)度表達(dá)(例如見(jiàn)1990年6月12日公布的美國(guó)專利4933294；1991年4月18日公開的WO91/05264；1995年3月28日公布的美國(guó)專利5401638；和Sias等，免疫學(xué)方法雜志13273-80(1990))。除了上述試驗(yàn)，熟練的技術(shù)人員還可利用各種體內(nèi)試驗(yàn)。例如，可將患者體內(nèi)的細(xì)胞暴露于已任選用可檢測(cè)的標(biāo)記物(例如放射性同位素)標(biāo)記的抗體，然后通過(guò)例如體表放射活性掃描，或通過(guò)對(duì)在暴露于抗體之前從患者體內(nèi)取的活體組織進(jìn)行分析來(lái)評(píng)估患者細(xì)胞與抗體的結(jié)合。
相反，“不以ErbB2受體過(guò)度表達(dá)為特點(diǎn)”的癌在診斷性檢測(cè)中，與其相同組織類型的非癌性細(xì)胞相比，表達(dá)的ErbB2受體水平不高于正常水平。
“過(guò)度表達(dá)”ErbB配體的癌是產(chǎn)生的ErbB配體水平顯著高于相同組織類型的非癌性細(xì)胞的那些癌。此過(guò)度表達(dá)可由基因擴(kuò)增或增加的轉(zhuǎn)錄或翻譯而引起。通過(guò)檢測(cè)患者(例如腫瘤活體標(biāo)本)中該配體(或其編碼核酸)的水平，或通過(guò)診斷性檢測(cè)如IHC、FISH、southern印跡、PCR或上述體內(nèi)試驗(yàn)等，可確診ErbB配體過(guò)度表達(dá)。
“激素非依賴性”癌是其不依賴于與該癌癥中細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合的激素的存在而增殖的那些癌癥。這些癌癥不因?qū)嵤┠芙档湍[瘤內(nèi)或其附近的激素濃度的藥理學(xué)或手術(shù)方案而出現(xiàn)臨床消退。激素非依賴性癌的實(shí)例包括雄激素非依賴性前列腺癌，雌激素非依賴性乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌。這些癌可能始于激素依賴性腫瘤，然后在抗激素治療后由激素敏感期而發(fā)展為激素耐受性腫瘤。
本文中術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒藥物”是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化療藥物，毒素如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體。
“化療藥物”是在腫瘤治療中使用的化學(xué)化合物?；熕幬飳?shí)例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)；環(huán)磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa)；氮丙啶和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亞胺嗪(triethylenemelamine)，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博來(lái)霉素，放線菌素C(cactinomycin)，加利車霉素(calicheamicin)，carabicin，洋紅霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D，柔紅菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達(dá)比星(idarubicin)，發(fā)波霉素(marcellomycin)，絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin)，殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex)，凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物氟達(dá)拉濱(fludarabine)，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素類如二甲睪酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，環(huán)硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑如frolinic acid；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；噴司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼樹酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春堿酰胺；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(紫杉烷)，如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和docetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長(zhǎng)春花堿；鉑；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿；長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制劑如氟他氨(flutamide)，尼魯米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽，酸或衍生物。
本文中術(shù)語(yǔ)“靶向EGFR的藥物”是指與EGFR結(jié)合并任選抑制EGFR活化的治療藥物。這些藥劑的實(shí)例包括與EGFR結(jié)合的抗體和小分子。與EGFR結(jié)合的抗體實(shí)例包括Mab 579(ATCC CRL HB8506)、MAb 455(ATCCCRL HB 8507)、Mab 225(ATCC CRL HB 8508)、Mab 528(ATCC CRL HB8509)(見(jiàn)美國(guó)專利4943533，Mendelsohn等)及其變體，例如嵌合型225(C225)和重塑型人225(H225)(見(jiàn)WO96/40210，Imclone Systems Inc.)；結(jié)合EGFR II型突變體的抗體(美國(guó)專利5212290)；美國(guó)專利5891996中所述與EGFR結(jié)合的人源化抗體和嵌合抗體；和與EGFR結(jié)合的人抗體(見(jiàn)WO98/50433，Abgenix)。所述抗EGFR抗體可與細(xì)胞毒藥劑偶聯(lián)，從而產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物(見(jiàn)例如EP 659,439A2，Merck Patent GmbH)。與EGFR結(jié)合的小分子的實(shí)例包括ZD 1839(Astra Zeneca)、CP-358774(OSI/Pfizer)和AG 1478。
“抗血管生成藥劑”是指在一定程度上阻斷或干擾血管發(fā)育的化合物。例如，抗血管生成因子可以是與參與促進(jìn)血管生成的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的小分子或抗體。本文中優(yōu)選的抗血管生成因子是與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)結(jié)合的抗體。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是一般性術(shù)語(yǔ)，指由一個(gè)細(xì)胞群釋放的對(duì)另一個(gè)細(xì)胞群起細(xì)胞間介質(zhì)作用的蛋白。這些細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素，如人生長(zhǎng)激素，N-甲二磺酰人生長(zhǎng)激素，和牛生長(zhǎng)激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；mullerian-抑制物；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；苯丙酸諾龍；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-β；血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)；粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括天然蛋白或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等效物。
本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“前體藥物”是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對(duì)于親本藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較小且可酶促活化或被轉(zhuǎn)換成更具活性的親本形式。例見(jiàn)Wilman，“癌癥化療中的前體藥物”Biochemical Society Transaction，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“前體藥物一種藥物定向運(yùn)送的化學(xué)方法”定向藥物運(yùn)送，Borchardt等(編)，pp.247-267，Humana press(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括，但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內(nèi)酰胺的前體藥物，任選含有取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選含有取代的苯基乙酰胺的前體藥物，5-氟胞嘧啶和可轉(zhuǎn)化為更具細(xì)胞毒活性的游離藥物的其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明所用前體藥物形式的細(xì)胞毒藥物包括，但不限于上述化療藥物。
“脂質(zhì)體”是由能向哺乳動(dòng)物有效運(yùn)送藥物(如本文公開的抗ErbB2抗體，和，任選，一種化療藥物)的各類脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子囊泡。脂質(zhì)體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜的脂質(zhì)排列相似。
所用的術(shù)語(yǔ)“包裝插頁(yè)”是指通常包括在治療產(chǎn)品的商業(yè)包裝中，含有與這些治療產(chǎn)品的使用有關(guān)的說(shuō)明，用法，劑量，給藥，禁忌和/或警示等的說(shuō)明書。
“心臟保護(hù)劑”是能預(yù)防或減少與向患者給藥(如蒽環(huán)霉素抗生素和/或抗ErbB2抗體)相關(guān)的心肌功能障礙(即心肌病和/或充血性心臟衰竭)的化合物或組合物。心臟保護(hù)劑可，例如阻斷或減少自由基介導(dǎo)的心臟毒性作用和/或預(yù)防或減少氧化應(yīng)激損傷。本定義包括的心臟保護(hù)劑的實(shí)例包括鐵螯合劑右丙亞胺(dexrazoxane)(ICRF-187)(Seifert等，Annals of Pharmacotherapy281063-1072(1994))；降脂藥和/或抗氧化劑，如丙丁酚(probucol)(Singal等，J.Mol.Cell.Cardiol.271055-1063(1995))；氨磷汀(氨基硫醇2-[(3-氨丙基)氨基]乙烷硫醇-二氫磷酸酯，也稱為WR-2721，其脫磷酸化的細(xì)胞吸收型稱為WR-1065)和S-3-(3-甲基氨基丙基氨基)丙基硫代磷酸(WR-151327)，見(jiàn)Green等，癌癥研究54738-741(1994)；地高辛(Bristow，M.R.在Bristow，M.R.主編的《藥物誘導(dǎo)的心臟病》中，紐約Elsevier 191-215(1980))；β阻斷劑如美托洛爾(Hjalmarson等，藥物47增刊431-9(1994)；和Shaddy等，美國(guó)心臟雜志129197-9(1995))；維生素E；抗壞血酸(維生素-C)；自由基清除劑，如齊墩果酸、烏蘇酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；spin trapping化合物，如α-苯基-叔丁基硝酮(PBN)；(Paracchini等，抗癌研究131607-1612(1993))；selenoorganic化合物，如P251(Elbesen)等等。
“分離的”核酸分子是從抗體核酸的天然來(lái)源中通常與其結(jié)合的至少一種雜質(zhì)核酸分子中鑒定并分離的核酸分子。分離的核酸分子不同于其天然形式或組合(setting)。因此分離的核酸分子區(qū)別于其在天然細(xì)胞中的存在形式。然而，分離的核酸分子包括通常能表達(dá)該抗體的細(xì)胞中所含核酸分子，例如在此細(xì)胞中所述核酸分子的染色體定位與其在天然細(xì)胞中的定位不相同。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”指在特定宿主生物中使可操作連接的編碼序列表達(dá)所需的DNA序列。適于原核生物的調(diào)控序列可包括如啟動(dòng)子，任選操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核生物細(xì)胞利用啟動(dòng)子，聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
當(dāng)一種核酸與另一種核酸序列處于功能相關(guān)的位置時(shí)，該核酸與該另一種核酸“可操作相連”。例如如果一種多肽表達(dá)為參與該多肽的分泌的前體蛋白，則將前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與該多肽的DNA可操作相連；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子當(dāng)能影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)可與該編碼序列可操作相連；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)當(dāng)其位置能促進(jìn)翻譯時(shí)可與編碼序列可操作相連。通?！翱刹僮飨噙B”指被連接的DNA序列是相鄰的，而且，如果是分泌前導(dǎo)序列，則相鄰且為閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必是相鄰的。連接可通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)相連而實(shí)現(xiàn)。如果不存在這樣的位點(diǎn)，可根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
本文中，詞語(yǔ)“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)”可互換應(yīng)用，而且所有這些名稱均包括子代。因此，單詞“轉(zhuǎn)化體”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代主體細(xì)胞和從其衍生的培養(yǎng)物，不必考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)明白由于有意或無(wú)意的突變，所有子代的DNA含量可能不完全相同。具有與原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所篩選的功能或生物學(xué)活性相同的功能或生物學(xué)活性的突變子代也包括在內(nèi)。名稱不同之處，將在文中指明。
II.抗ErbB2抗體的制備下面是關(guān)于本發(fā)明所用抗體的制備技術(shù)實(shí)例的敘述。用于制備抗體的ErbB2抗原可以是例如ErbB2的可溶型細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或其含所需表位的一部分?；蛘?，可用在其表面表達(dá)ErbB2的那些細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)化為過(guò)度表達(dá)ErbB2的NIH-3T3細(xì)胞；或SK-BR-3細(xì)胞等癌細(xì)胞系，見(jiàn)Srancovski等，PNAS(USA)888691-8695(1991))來(lái)制備抗體。ErbB2的可用于制備抗體的其它形式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過(guò)多次給動(dòng)物皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而產(chǎn)生。將所述相關(guān)抗原與針對(duì)所免疫的物種具有免疫原性的蛋白(如匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)用雙功能試劑或衍生試劑，如馬來(lái)酰亞氨苯甲?；虼牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基結(jié)合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基，進(jìn)行偶聯(lián)是有效的。
用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動(dòng)物，方法是，將100μg或5μg蛋白或偶聯(lián)物(分別針對(duì)兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點(diǎn)皮內(nèi)注射該溶液。1個(gè)月后，多位點(diǎn)皮內(nèi)注射起始量的1/5-1/10的肽或與弗氏完全佐劑的偶聯(lián)物來(lái)加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物采血，測(cè)定血清中的抗體效價(jià)。對(duì)動(dòng)物的加強(qiáng)免疫直到效價(jià)達(dá)到平臺(tái)期為止。優(yōu)選給動(dòng)物加強(qiáng)注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過(guò)不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物還可以是重組細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體來(lái)自基本均一的抗體群，即該群體中的每個(gè)抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞“單克隆”指所述抗體的并非不同抗體混合物的特性。
例如，單克隆抗體可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或用重組DNA方法制備(美國(guó)專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適合的宿主動(dòng)物如倉(cāng)鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細(xì)胞。另外，可體外免疫淋巴細(xì)胞。然后用適當(dāng)融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
將如此制備的雜交瘤細(xì)胞接種至適當(dāng)培養(yǎng)基中并培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細(xì)胞的生長(zhǎng)。
優(yōu)選骨髓瘤細(xì)胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細(xì)胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell DistreibutionCenter，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細(xì)胞和由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞。也有報(bào)道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細(xì)胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志1333001(1984)；Brodeur等，單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))可在含有生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中分析直接針對(duì)所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)，如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)來(lái)分析。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析來(lái)測(cè)定。
一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，將這些克隆通過(guò)有限稀釋法進(jìn)一步克隆并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(Academic Press，1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可作為腹水中腫瘤的形式在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)。
由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)免疫球蛋白純化方法如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離。
編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測(cè)序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是這類DNA的優(yōu)選來(lái)源。DNA分離后，可將其插入表達(dá)載體中，然后用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，以便在重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述見(jiàn)Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
在另一實(shí)施方案中，可從用McCafferty等，自然，348552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫(kù)中分離抗體或抗體片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人的抗體。后來(lái)的文獻(xiàn)描述了通過(guò)鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術(shù)10779-783(1992))，以及用于構(gòu)建大規(guī)模噬菌體文庫(kù)的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來(lái)分離克隆抗體。
DNA也可通過(guò)用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取代小鼠同源序列來(lái)修飾(美國(guó)專利4,816,567；Morrison等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)816851(1984))，或通過(guò)將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)的可變區(qū)，形成二價(jià)嵌合抗體，其中一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于一種抗原而另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異于另一種抗原。
(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已有關(guān)于人源化非人類抗體的制備方法的描述。優(yōu)選人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個(gè)源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為“引進(jìn)的”殘基，它們通常來(lái)自“引進(jìn)的”可變區(qū)。人源化過(guò)程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科學(xué)，2391534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來(lái)進(jìn)行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利4,816,567)，其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。
對(duì)用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)(包括重鏈和輕鏈)的選擇，對(duì)降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂“最適應(yīng)”方法，針對(duì)已知人類可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物學(xué)雜志，196901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，894285(1992)；Presta等，免疫學(xué)雜志，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后保留了對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過(guò)用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物來(lái)制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過(guò)這種方法，可從受者和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對(duì)靶抗原的親和力增加?？傊?，高變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
下述的實(shí)施例3敘述了結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的人源化抗ErbB2抗體實(shí)例的制備。本文中特定目的人源化抗體基本上與小鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地阻斷MAPK的由EGF、TGF-α和/或HRG介導(dǎo)的活化作用，和/或與小鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效地結(jié)合ErbB2。例如，此處的人源化抗體可包括引入人重鏈可變區(qū)的非人類超變區(qū)殘基，并且可進(jìn)一步包括在選自69H、71H和73H(使用在Kabat等，具有免疫學(xué)意義的蛋白的序列，第5版.Public Health Serive.National Institute of Health，Bethesda，MD(1991)中提出的編號(hào)系統(tǒng))的位點(diǎn)上的框架區(qū)(FR)取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗體在69H，71H和73H的兩個(gè)或所有位置包含F(xiàn)R取代。
本文中目的人源化抗體的一個(gè)實(shí)例包括重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)殘基GFTFTDYTMX，其中X優(yōu)選D或S(SEQ ID NO7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ IDNO9)，任選包括這些CDR殘基的氨基酸修飾，例如所述修飾基本上維持或提高該抗體的親和力。例如，目的抗體變體在上述重鏈可變區(qū)CDR序列中可具有約1-7或5個(gè)氨基酸取代。通過(guò)如下所述親和力成熟可制備這樣的抗體變體。最優(yōu)選的人源化抗體包括SEQ ID NO4中的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
除了例如在先段落的那些重鏈可變區(qū)CDR殘基之外，人源化抗體可包括輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)殘基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO10)；SASYX1X2X3，其中X1優(yōu)選R或L，X2優(yōu)選Y或E，X3優(yōu)選T或S(SEQ IDNO11)；和/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO12)。這樣的人源化抗體任選包括上述CDR殘基的氨基酸修飾，例如所述修飾基本上維持或提高該抗體的親和力。例如，目的抗體的變體在上述輕鏈可變區(qū)CDR序列中可具有約1-7或5個(gè)氨基酸取代。通過(guò)如下所述親和力成熟可制備這樣的抗體變體。最優(yōu)選的人源化抗體包括SEQ ID NO3中的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
本申請(qǐng)還考慮了親和力成熟的結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如包括輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)序列(分別見(jiàn)SEQ ID NO 3和4)的抗體(即變體574)。所述親和力成熟的抗體優(yōu)選以高于鼠2C4或變體574的親和力與ErbB2受體結(jié)合(例如用ErbB2-細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)ELISA法檢測(cè)時(shí)，親和力提高約2或4倍到約100-1000倍)。用于取代的重鏈可變區(qū)CDR殘基實(shí)例包括H28、H30、H34、H35、H64、H96和H99，或者這些殘基的兩個(gè)或多個(gè)(例如2、3、4、5、6或者7個(gè)殘基)的組合?？杀桓淖兊妮p鏈可變區(qū)CDR殘基包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97或這些殘基的兩個(gè)或多個(gè)(例如2到3、、4、5直到10個(gè)殘基)的組合。
本申請(qǐng)還考慮了人源化抗體或親和力成熟的抗體的各種形式。例如，所述人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是抗體片段，如Fab，其可任選與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)以制備免疫偶聯(lián)物?；蛘撸鋈嗽椿贵w或親和力成熟的抗體可以是完整的抗體，例如完整的IgG1抗體。
(iv)人類抗體除了進(jìn)行人源化以外還可制備人類抗體。例如現(xiàn)在已能產(chǎn)生如下轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)，它們通過(guò)免疫能產(chǎn)生人類抗體的所有成分而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。例如，有報(bào)道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這類種系突變小鼠中將導(dǎo)致因抗原攻擊而誘導(dǎo)人類的抗體產(chǎn)生。見(jiàn)Jakobovits等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，902551(1993)；Jakobovits等，自然，362255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.733(1993)；和美國(guó)專利5591669，5589369和5545807。
或者，可用噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，自然348552-553(1990))從未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成而體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)此技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆在與絲狀噬菌體(如M13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因相同的框架內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點(diǎn)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致對(duì)顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼基因進(jìn)行選擇。因此，噬菌體模仿了B細(xì)胞的部分特點(diǎn)。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；這些綜述見(jiàn)Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新觀點(diǎn)(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)?？墒褂肰基因片段的多個(gè)來(lái)源進(jìn)行噬菌體展示。Clackson等，自然，352624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來(lái)源的V基因的隨機(jī)組合小文庫(kù)中分離了抗-惡唑酮抗體的一個(gè)多樣性陣列?？苫救鏜arks等，分子生物學(xué)雜志222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述構(gòu)建未經(jīng)免疫的人類供者V基因的所有組成，并分離針對(duì)抗原多樣性陣列(包括自身抗原)的抗體。亦參見(jiàn)美國(guó)專利5565332和5573905。
人類抗體也可通過(guò)體外活化的B細(xì)胞而產(chǎn)生(見(jiàn)美國(guó)專利5,567,610和5,229,275)。
人類抗ErbB2抗體在1998年6月30日公布的美國(guó)專利5772997和1997年1月3日公開的WO97/00271中敘述。
(v)抗體片段已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過(guò)對(duì)完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見(jiàn)Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科學(xué)，22981(1985))。但現(xiàn)在可直接通過(guò)重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫(kù)分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab’-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)中分離F(ab’)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見(jiàn)WO93/16185；美國(guó)專利5,571,894；和美國(guó)專利5,587,458。抗體片段也可以是“線性化抗體”，如美國(guó)專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對(duì)至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。如雙特異性抗體可以與ErbB2蛋白的兩種不同表位結(jié)合。其它這種抗體可將ErbB2結(jié)合位點(diǎn)與針對(duì)EGFR、ErbB3和/或ErbB4的結(jié)合位點(diǎn)組合?；蛘撸蓪⒖笶rbB2臂與結(jié)合白細(xì)胞上引發(fā)分子的臂結(jié)合，從而集中針對(duì)ErbB2表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞防御機(jī)制，所述引發(fā)分子如T細(xì)胞受體分子(CD2或CD3)，或IgG Fc受體(FcγR)如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒制劑定位至表達(dá)ErbB2的細(xì)胞。這些抗體具有ErbB2結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒制劑(例如皂草素，抗INF-α，長(zhǎng)春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。雙特異性抗體可制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab’)2雙特異性抗體)。
WO 96/16673敘述了雙特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗體，而在美國(guó)專利5837234中公開了雙特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗體。雙特異性抗ErbB2/Fcα抗體見(jiàn)WO98/02463。美國(guó)專利5821337中敘述了雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。
制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。完整雙特異性抗體的傳統(tǒng)制備方法是基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中這兩條鏈具有不同特異性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機(jī)分配，這些雜交瘤(細(xì)胞雜交瘤(quadroma))可能產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。對(duì)所述正確分子的純化(通常通過(guò)親和層析步驟來(lái)進(jìn)行)非常復(fù)雜，且產(chǎn)量很低。類似的方法見(jiàn)WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依據(jù)另一種方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)的至少一部分、CH2及CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)出現(xiàn)在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時(shí)，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染至適當(dāng)宿主生物。這使得在使用非等比的三種多肽鏈進(jìn)行構(gòu)建的實(shí)施方案中，能較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達(dá)而獲得高產(chǎn)時(shí)或所述比例無(wú)特別意義時(shí)，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達(dá)載體。
在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。已發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因?yàn)橹挥性撾p特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于WO94/04690中。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見(jiàn)Suresh等，酶學(xué)方法，121210(1986)。
根據(jù)美國(guó)專利5,731,168所述的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的異源二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)“溝”可通過(guò)將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二抗體分子的界面上形成。這使得異二聚體的產(chǎn)量比不想要的終產(chǎn)物如同型二聚體的高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，這類抗體可用于將免疫細(xì)胞導(dǎo)向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利4676980)，也可用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯(lián)抗體可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)慕宦?lián)方法制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域已知，可在美國(guó)專利4676980號(hào)中獲得。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已有文獻(xiàn)。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接制備。Brennan等，科學(xué)22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的巰基，并阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段被轉(zhuǎn)化為硫硝基苯甲酸鹽(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab′-硫醇，再與等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固相化中所用的試劑。
近期的進(jìn)展促進(jìn)了Fab′-SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。Shalaby等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，175217-225(1992)中描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab′)2分子的產(chǎn)生。每一Fab′片段分別從大腸桿菌中分泌出來(lái)，體外直接化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體。如此制備的雙特異性抗體能與過(guò)度表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞結(jié)合，還能引發(fā)人類細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞對(duì)人乳腺腫瘤細(xì)胞的裂解活性。
直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelny等，免疫學(xué)雜志，148(5)1547-1553(1992))。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過(guò)基因融合而連接。使抗體的同型二聚體在鉸鏈區(qū)被還原成單體，然后被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用于制備抗體同型二聚體。由Hollinger等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，906444-6448(1993))描述的“二價(jià)抗體”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過(guò)接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)。因此，同一片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。此外還報(bào)道了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體的策略。見(jiàn)Gruber等，免疫學(xué)雜志，1525368(1994)。
還考慮了二價(jià)以上的抗體。如可制備三特異性抗體。Tutt等，免疫學(xué)雜志，14760(1991)。
(vii)其它氨基酸序列修飾本申請(qǐng)考慮了本文所述抗ErbB2抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能需要改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特點(diǎn)。抗ErbB2抗體的氨基酸序列變體可通過(guò)在抗ErbB2抗體核酸中引入適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓蛲ㄟ^(guò)肽合成制備。這類修飾包括例如抗ErbB2抗體的氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失、和/或插入和/或取代?？蛇M(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合以獲得最終的構(gòu)建體，只要最終的構(gòu)建體具有所需的特性。所述氨基酸變化還可改變抗ErbB2抗體的翻譯后加工過(guò)程，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。
一種鑒別抗ErbB2抗體中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells，科學(xué)2441081-1085(1989)所述的“丙氨酸掃描誘變”。這里，鑒定一個(gè)殘基或一組靶殘基(例如，帶電的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電的氨基酸取代(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與ErbB2抗原的相互作用。那些證實(shí)對(duì)取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過(guò)在取代點(diǎn)引入進(jìn)一步的或其他的變體而改進(jìn)。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但突變本身不必是預(yù)定的。例如，為分析在指定位點(diǎn)處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域?qū)嵭斜彼釖呙杌螂S機(jī)誘變，并篩選所表達(dá)的具有預(yù)期活性的抗ErbB2抗體變體。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長(zhǎng)度從一個(gè)殘基至包括100個(gè)或更多殘基的多肽)，以及序列內(nèi)單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端甲硫氨酰殘基的抗ErbB2抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的該抗體?？笶rbB2抗體分子的其它插入變體包括使抗ErbB2抗體的N-或C-末端與能增加該抗體的血清半衰期的酶或多肽融合。
另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使抗ErbB2抗體分子中至少一個(gè)氨基酸殘基被不同殘基取代。最有興趣進(jìn)行取代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，也可以考慮FR的改變。保守取代見(jiàn)表1的“優(yōu)選取代”欄。如果這些取代引起生物學(xué)活性的改變，則可引入表1中“取代舉例”欄的更實(shí)質(zhì)性改變，或進(jìn)一步在下文的氨基酸分類中所述的更實(shí)質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。
表1
對(duì)所述抗體的生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修改可通過(guò)選擇性取代來(lái)完成，所述取代的效應(yīng)在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層結(jié)構(gòu)或螺旋構(gòu)象，(b)該分子靶位點(diǎn)的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸
(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。
不參與維持抗ErbB2抗體的正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基也可被取代，通常被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可在該抗體中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性(特別當(dāng)該抗體為抗體片段如FV片段時(shí))。
取代變體的特別優(yōu)選類型包括取代親本抗體高變區(qū)的一或多個(gè)殘基。通常，所選用于進(jìn)一步開發(fā)的變體相對(duì)于其親本抗體應(yīng)具有改進(jìn)的生物學(xué)活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個(gè)方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使高變區(qū)的幾個(gè)位點(diǎn)(如6-7個(gè)位點(diǎn))突變以便在每一位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，其為與每個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點(diǎn)，可通過(guò)丙氨酸掃描誘變來(lái)鑒定對(duì)抗原結(jié)合作出主要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基。此外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以確定抗原與抗體之間的接觸點(diǎn)也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進(jìn)行取代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對(duì)它們?nèi)窟M(jìn)行篩選，選出在一或多個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)勢(shì)特性的抗體以便進(jìn)一步開發(fā)。
所述抗體的另一種氨基酸變體改變了該抗體原來(lái)的糖基化模式。所謂改變就是去掉該抗體中的一或多個(gè)碳水化合物部分，和/或添加一或多個(gè)原本不存在于該抗體中的糖基化位點(diǎn)。
抗體的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈酶促相連的識(shí)別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。
在抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列，使其包含一或多個(gè)上述三肽序列而實(shí)現(xiàn)(在添加N-連接糖基化位點(diǎn)的情況下)。這種改變也可通過(guò)在原始抗體的序列中添加或取代一或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)(在添加O-連接的情況下)。
編碼抗ErbB2抗體的氨基酸序列變體的核酸分子由本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過(guò)對(duì)抗ErbB2抗體之早期制備的變體或非變體形式進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變，PCR誘變和盒式誘變來(lái)制備。
也可預(yù)期修飾該抗體的效應(yīng)物功能，例如使該抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)增強(qiáng)。這可以通過(guò)在抗體FC區(qū)引入一或多個(gè)氨基酸取代而獲得。此外，可在FC區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同型二聚體抗體可提高內(nèi)在化能力和/或增強(qiáng)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用和ADCC。見(jiàn)Caron等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫學(xué)雜志1482918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同型二聚體抗體也可用Wolffe等，癌癥研究532560-2565(1993)所述異源雙功能交聯(lián)劑制備。或者，可通過(guò)工程改造產(chǎn)生具有雙FC區(qū)并因此具有增強(qiáng)的補(bǔ)體裂解效應(yīng)及ADCC能力的抗體。見(jiàn)Stevenson等，抗癌藥物的設(shè)計(jì)(Anti-Cancer drug design)3219-230(1989)。
為了延長(zhǎng)該抗體的血清半衰期，可在該抗體(尤其抗體片段)中摻入一個(gè)補(bǔ)救受體結(jié)合表位，如美國(guó)專利5,739,277所述。本文中術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。
(viii)篩選具有所需特性的抗體制備抗體的技術(shù)如上述?？筛鶕?jù)需要進(jìn)一步篩選具有特定生物學(xué)特性的抗體。
為了確定阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，可測(cè)定該抗體阻斷ErbB配體與表達(dá)ErbB受體(例如與另一ErbB受體結(jié)合，該受體與目的ErbB受體形成ErbB異寡聚體)的細(xì)胞結(jié)合的能力?？蓪⑻烊槐磉_(dá)或通過(guò)轉(zhuǎn)染而表達(dá)ErbB異寡聚體中ErbB受體的細(xì)胞與所述抗體進(jìn)行溫育，然后將其暴露于標(biāo)記的ErbB配體。之后可估測(cè)抗ErbB2抗體阻斷ErbB異寡聚體中ErbB受體的配體結(jié)合的能力。
例如，抗ErbB2抗體抑制HRG與MCF7乳腺癌細(xì)胞系的結(jié)合的作用可基本上按實(shí)施例1所述方法，利用冰浴24孔培養(yǎng)板中的單層MCF7培養(yǎng)物來(lái)進(jìn)行。向每孔中加入抗ErbB2單克隆抗體，并溫育30分鐘。然后加入125I標(biāo)記的rHRGβ1177-224(25pm)，并繼續(xù)溫育4-16小時(shí)。可繪制劑量應(yīng)答曲線并計(jì)算目的抗體的IC50值。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體在此檢測(cè)中抑制HRG與MCF細(xì)胞的結(jié)合的IC50值約為50nM或更低，優(yōu)選10nM或更低。當(dāng)所述抗體為抗體片段如Fab段時(shí)，該檢測(cè)中抑制HRG與MCF7細(xì)胞的結(jié)合的IC50值可為例如約100nM或更低，更優(yōu)選50nM或更低。
或者(或另外)，可檢測(cè)抗ErbB2抗體阻斷ErbB異寡聚體中ErbB受體的ErbB配體活化型酪氨酸磷酸化作用的能力。例如，可將內(nèi)源性表達(dá)ErbB受體或通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)它們的細(xì)胞與所述抗體溫育，然后利用抗磷酸酪氨酸單克隆抗體(其任選與可檢測(cè)的標(biāo)記物偶聯(lián))，檢測(cè)ErbB配體依賴性酪氨酸磷酸化活性。美國(guó)專利5766863中所述的激酶受體活化試驗(yàn)也可用于測(cè)定ErbB受體活化作用，并可用抗體阻斷該活化作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可基本如實(shí)施例1所述篩選能抑制MCF7細(xì)胞中p180酪氨酸磷酸化之HRG刺激作用的抗體。例如，將MCF7細(xì)胞鋪于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入ErbB2的單克隆抗體，室溫溫育30分鐘；然后每孔加入rHRGβ1177-224致終濃度0.2nM，繼續(xù)溫育8分鐘。從各個(gè)孔中吸出培養(yǎng)基，加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS，25mM DTT和25Mm Tris-HCl，pH6.8)終止反應(yīng)。將每份樣品(25μl)在4-12％梯度凝膠(Novex)上進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。使抗磷酸酪氨酸免疫印跡膜顯色，通過(guò)反射比密度測(cè)定法(reflectance densitometry)定量處于Mr-180000位置的主要反應(yīng)帶的密度。所選抗體優(yōu)選能將p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激作用在此試驗(yàn)中顯著抑制為對(duì)照的約0-35％?？筛鶕?jù)反射密度測(cè)定法確定的對(duì)p180酪氨酸磷酸化之HRG刺激的抑制作用繪制劑量應(yīng)答曲線，并計(jì)算目的抗體的IC50值。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體在此檢測(cè)中抑制p180酪氨酸磷酸化之HRG刺激的IC50值約為50nM或更低，優(yōu)選10nM或更低。在所述抗體為抗體片段如Fab段時(shí)，在此檢測(cè)中抑制p180酪氨酸磷酸化之HRG刺激的IC50值可為例如約100nM或更低，更優(yōu)選50nM或更低。
也可估測(cè)所述抗體對(duì)MDA-MB-175細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，例如基本上按Schaefer等，癌基因151385-1394(1997)中所述。根據(jù)該項(xiàng)試驗(yàn)，MDA-MB-175細(xì)胞可用抗ErbB2單克隆抗體(10μl/ml)處理4天，再用結(jié)晶紫染色。與抗ErbB2抗體一起溫育對(duì)此細(xì)胞系顯示出類似于單克隆抗體2C4的生長(zhǎng)抑制作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，外源性HRG不能顯著逆轉(zhuǎn)此抑制作用。優(yōu)選所述抗體在外源性HRG存在和不存在的條件下，均能以高于單克隆抗體4D5(并任選高于單克隆抗體7F3)的水平抑制MDA-MB-175細(xì)胞的增殖。
在一個(gè)實(shí)施方案中，抗ErbB2目的抗體在MCF7和SK-BR-3細(xì)胞中均可阻斷ErbB2與ErbB3的heregulin依賴性結(jié)合，如實(shí)施例2中所述免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)所測(cè)，其效力遠(yuǎn)高于單克隆抗體4D5，優(yōu)選遠(yuǎn)高于單克隆抗體7F3。
為了鑒定生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2抗體，可篩選能抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所選生長(zhǎng)抑制性抗體在約0.5-30μg/ml的抗體濃度下能使細(xì)胞培養(yǎng)中SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制約20-100％，優(yōu)選被抑制50-100％。為了鑒定這樣的抗體，可實(shí)施美國(guó)專利5677171中所述的SK-BR-3試驗(yàn)。根據(jù)該項(xiàng)試驗(yàn)，將SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)在F12與DMEM(添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素、鏈霉素)以1∶1混合的培養(yǎng)基中。將20000個(gè)SK-BR-3細(xì)胞置于35mm培養(yǎng)皿中(2mls/35mm培養(yǎng)皿)。每皿加入0.5-30μg/ml抗ErbB2抗體。6天之后，利用電子COULTERTM細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，并與未經(jīng)處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。那些能將SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制約20-100％或50-100％的抗體被選為生長(zhǎng)抑制性抗體。
為了篩選誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體，可評(píng)價(jià)相對(duì)于對(duì)照的膜完整性喪失，其可由例如PI、臺(tái)盼藍(lán)或7AAD攝入來(lái)指示。優(yōu)選的試驗(yàn)是利用BT474細(xì)胞進(jìn)行的PI攝入試驗(yàn)。根據(jù)該試驗(yàn)，將BT474細(xì)胞(可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)獲得)培養(yǎng)在含10％熱滅活的FBS(Hyclone)和2mML-谷氨酰胺的Dulbeco’s改良型Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)Ham’sF-12(50∶50)中。(因此，該檢測(cè)是在無(wú)補(bǔ)體和免疫效應(yīng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行)。將BT474細(xì)胞以3×106/皿的濃度接種至100×20mm的培養(yǎng)皿中，并使其粘附過(guò)夜。然后棄去培養(yǎng)基，僅用新鮮培養(yǎng)基或用含10μg/ml適當(dāng)單克隆抗體的培養(yǎng)基取代。細(xì)胞以3天為一周期進(jìn)行培養(yǎng)。每次處理后，單層細(xì)胞用PBS洗滌，并用胰酶消化使其脫附。然后將細(xì)胞在4℃以1200rpm離心5分鐘，將沉淀重懸于3ml冰冷的Ca2+結(jié)合緩沖液(10mM Hepes，pH7.4，140mMNaCl，2.5mM CaCl2)中，再分裝到35mm濾器封蓋的12×75試管中(每管1ml，每處理組3管)以去除細(xì)胞團(tuán)塊。然后向試管中加入PI(10μg/ml)。樣品利用FACSCANTM流式細(xì)胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(BectonDickinson)分析?？蓪⒛切┱T導(dǎo)統(tǒng)計(jì)顯著水平的細(xì)胞死亡(如PI攝入法所測(cè))的抗體選為誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體。
為了篩選凋亡誘導(dǎo)抗體，可利用BT474細(xì)胞進(jìn)行annexin結(jié)合試驗(yàn)。將BT474細(xì)胞按上段所述接種并培養(yǎng)。然后棄去培養(yǎng)基，僅用新鮮培養(yǎng)基或用含10μg/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基取代。細(xì)胞以3天為一周期進(jìn)行培養(yǎng)后，將單層用PBS洗滌，并用胰酶消化使其脫附。然后如上文細(xì)胞死亡試驗(yàn)所述將細(xì)胞離心，重懸于Ca2+結(jié)合緩沖液中，并分裝到試管中。向試管中加入標(biāo)記的annexin(例如annexin V-FTIC)(1μg/ml)。利用FACSCANTM流式細(xì)胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)分析樣品。在用PI攝入法檢測(cè)時(shí)，可將那些誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)顯著水平的annexin結(jié)合(如PI攝入法所測(cè))的抗體選為凋亡誘導(dǎo)抗體。
除了annexin結(jié)合試驗(yàn)，可利用BT474細(xì)胞進(jìn)行DNA染色試驗(yàn)。為此，將已如前兩段所述用目的抗體處理過(guò)的BT474細(xì)胞與9μg/ml HOECHST33342TM于37℃溫育2小時(shí)，然后在EPICS ELITETM流式細(xì)胞儀(CoulterCorporation)上用MODFITLTTM軟件(Verity Software House)進(jìn)行分析。引起凋亡細(xì)胞百分率改變(比未處理細(xì)胞高兩倍或更多(優(yōu)選高3倍或更多)(直到100％的凋亡細(xì)胞))的抗體可用此試驗(yàn)篩選為前凋亡抗體。
為了篩選能與結(jié)合目的抗體之ErbB2上某一表位結(jié)合的抗體，可如《抗體，實(shí)驗(yàn)室指南》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Ed Harlow和David Lane(1998)所述進(jìn)行常規(guī)交叉阻斷試驗(yàn)?；蛘?或另外)，可通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)進(jìn)行表位作圖(見(jiàn)，例如本文中圖1A和1B)。
(ix)免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，其中含有與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)的抗體，所述細(xì)胞毒藥物如化療藥物、毒素(例如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素等。
可有效用于制備這類免疫偶聯(lián)物的化療藥物如上述。本文還涉及抗體與一或多種小分子毒素，如加利車霉素，美登素(美國(guó)專利5,208,020)，單端孢霉烯(trichothene)，CC1065的偶聯(lián)物。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使抗體與一或多個(gè)美登素分子偶聯(lián)(如每個(gè)抗體分子與約1-10個(gè)美登素分子偶聯(lián))。美登素可轉(zhuǎn)化成May-SS-Me，然后還原成May-SH3，并與修飾過(guò)的抗體反應(yīng)(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))產(chǎn)生美登木素生物堿-抗體偶聯(lián)物。
另外，抗體可以與一或多個(gè)加利車霉素分子結(jié)合。加利車霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括，但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG以及θ1I(Hinmam等，癌癥研究533336-3342(1993)和Lode等，癌癥研究582925-2928(1998))。
可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑，白樹毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。例見(jiàn)1993年10月28日公開的WO93/21232。
本發(fā)明還涉及一種免疫偶聯(lián)物，其由抗體與具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶如脫氧核糖核酸酶；DNase)偶聯(lián)。
多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的抗體，實(shí)例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。
抗體與細(xì)胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過(guò)多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來(lái)連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如亞氨基己二酸二甲酯鹽酸鹽)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對(duì)-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對(duì)-重氮苯甲?；?-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學(xué)2381098(1987)所述制備。C14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見(jiàn)WO94/11026。這種接頭可能是有利于細(xì)胞毒藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放的“可斷開的接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二甲基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52127-131(1992))。
或者，可通過(guò)重組技術(shù)或肽合成來(lái)獲得抗體與細(xì)胞毒制劑的融合蛋白。
在另一實(shí)施方案中，抗體可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的“受體”(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)，將該抗體-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細(xì)胞毒制劑(如放射性核苷酸)的“配體”(如抗生物素蛋白)。
(x)抗體依賴性酶介導(dǎo)的前體藥物治療(ADEPT)本發(fā)明的抗體還可與前體藥物活化酶相結(jié)合，然后用于ADEPT，所述活化酶可以將前體藥物(如肽基化療劑，見(jiàn)WO81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。見(jiàn)WO88/07378和美國(guó)專利4,975,278。
這些用于ADEPT的偶聯(lián)物中的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉(zhuǎn)化為活性更強(qiáng)的細(xì)胞毒形式的任何酶。
本發(fā)明的方法中用到的酶包括，但不限于，能將含磷酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；將無(wú)毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；能將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；能將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物裂解酶類如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；能將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；能在藥物中的氨基氮處分別用苯氧乙酰基或苯乙?；D(zhuǎn)化而使藥物游離的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘?，可用本領(lǐng)域稱為“抗體酶”的具有酶活性的抗體，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(見(jiàn)Massey，自然328457-458(1987))?？扇绫疚乃鲋苽淇贵w-抗體酶偶聯(lián)物以便將抗體酶運(yùn)送至腫瘤細(xì)胞群。
本發(fā)明的酶可通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如上述異源雙功能交聯(lián)試劑的使用而與抗體共價(jià)結(jié)合。或者，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的DNA重組技術(shù)(如Neuberger等，自然，312604-608(1984))構(gòu)建含至少本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白，所述抗體與本發(fā)明酶的至少一個(gè)功能活性部分連接。
(xi)其它抗體修飾本文還涉及對(duì)抗體的其它修飾。例如，可以使抗體與一種非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物交聯(lián)。還可將抗體包被于微囊(可通過(guò)凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備，如分別制成羥甲基纖維素或明膠微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate)))、膠體藥物傳遞系統(tǒng)(如脂質(zhì)體、白蛋白小球體、微乳膠、納米顆粒和納米膠囊)或巨乳膠(macroemulsions)。這些技術(shù)見(jiàn)Remingtons’s Pharmaceutical Sciences，16版，Oslo，A.，Ed.(1980)。
本文公開的抗-ErbB2抗體還可配成免疫脂質(zhì)體。含抗體的脂質(zhì)體可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法制備，如Epstein等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)823688(1985)；Hwang等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)774030(1980)；美國(guó)專利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公開的WO97/38731。在美國(guó)專利5,013,566中公開了循環(huán)時(shí)間已增加了的脂質(zhì)體。
特別有效的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。脂質(zhì)體通過(guò)一定孔徑大小的濾膜擠壓可獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab’片段可如Martin等，生物學(xué)化學(xué)雜志，257286-288(1982)所述，經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)?？扇芜x在所述脂質(zhì)體中包含一種化療藥物。見(jiàn)Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
III.載體、宿主細(xì)胞和重組方法本發(fā)明還提供了分離的編碼人源化抗ErbB2抗體的核酸、含所述核酸的載體和宿主細(xì)胞、制備所述抗體的重組技術(shù)。
為了對(duì)抗體進(jìn)行重組制備，分離其編碼核酸并插入到可復(fù)制載體中，來(lái)進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。利用傳統(tǒng)方法(例如利用能與編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的基因特異性結(jié)合的探針)，可容易的分離并測(cè)序編碼所述抗體的DNA。許多載體可應(yīng)用。載體組分通常包括但不限于一個(gè)或多個(gè)下述組分信號(hào)序列，復(fù)制起始點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
(i)信號(hào)序列組分本發(fā)明的抗ErbB2抗體不僅可直接重組制備，而且還可制備成與異源多肽的融合多肽，優(yōu)選所述異源多肽為信號(hào)序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點(diǎn)的其它多肽。優(yōu)選的異源信號(hào)序列是被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即通過(guò)信號(hào)肽酶裂解)的信號(hào)序列。對(duì)于不能識(shí)別并加工天然抗ErbB2抗體信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，用選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)區(qū)的原核信號(hào)序列取代所述天然信號(hào)序列。對(duì)于酵母分泌，可用例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)區(qū)、α因子前導(dǎo)區(qū)(包括糖酵母屬和克魯維酵母屬的α因子前導(dǎo)區(qū))、酸性磷酸酶前導(dǎo)區(qū)、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)區(qū)或WO90/13646中所述信號(hào)序列等取代上述天然信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)時(shí)，可使用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及如單純皰疹gD信號(hào)序列等病毒分泌前導(dǎo)區(qū)。
將這些前導(dǎo)區(qū)DNA在閱讀框架內(nèi)與編碼抗ErbB2抗體的DNA連接。
(ii)復(fù)制起始點(diǎn)組分表達(dá)載體和克隆載體中均含有能使載體在一或多種所選宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，此序列是能使載體獨(dú)立于宿主染色體DNA而進(jìn)行復(fù)制的序列，它包括復(fù)制起始點(diǎn)或自主復(fù)制序列。在多種細(xì)菌、酵母和病毒中，這樣的序列眾所周知。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起始點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起始點(diǎn)適合于酵母，而各種病毒(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)復(fù)制起始點(diǎn)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。通常，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制組分的復(fù)制起始點(diǎn)(只有SV40起始點(diǎn)常用，因?yàn)樗性缙趩?dòng)子)。
(iii)篩選基因組分表達(dá)載體和克隆載體可包含篩選基因(也稱為可篩選標(biāo)記)。典型的篩選基因編碼蛋白，該蛋白(a)提供對(duì)抗生素或其它毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素等的抗性，(b)彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷，或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不能得到的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如編碼芽孢桿菌屬D-丙氨酸消旋酶的基因。
篩選方案的一個(gè)實(shí)例是利用藥物阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生能賦予藥物抗性的蛋白，從而在篩選過(guò)程中存活。這樣的顯性篩選實(shí)例使用新霉素、霉酚酸和潮霉素。
另一種適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的可篩選標(biāo)記實(shí)例是那些能對(duì)可吸收抗ErbB2抗體核酸的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行鑒定的標(biāo)記，例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白I和II(優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等等。
例如，首先通過(guò)在含氨甲喋呤(Mtx)(DHFR的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體，鑒定被DHFR篩選基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。當(dāng)使用野生型DHFR時(shí)，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是DHFR活性缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
或者，通過(guò)在含針對(duì)可篩選標(biāo)記的氨基糖苷抗生素(例如卡那霉素、新霉素或G418)等篩選藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，可篩選用編碼抗ErbB2抗體、野生型DHFR蛋白和另一個(gè)可篩選標(biāo)記(如氨基糖苷3’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH))的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。見(jiàn)美國(guó)專利4965199。
適用于酵母的適當(dāng)篩選基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb等，自然，28239(1979))。trpl基因?yàn)椴荒茉谏彼嶂猩L(zhǎng)的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了篩選標(biāo)記。Jones，Genetics，8512(1977)。酵母宿主細(xì)胞基因組中trp損傷的存在，為通過(guò)在無(wú)色氨酸的條件下的培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行檢測(cè)提供了有效的環(huán)境。同樣，Leu2缺陷的酵母株(ATCC 20622或38626)被含有Leu2基因的已知質(zhì)粒彌補(bǔ)。
另外，可將源自1.6μm環(huán)狀質(zhì)粒pKD1的載體用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母屬的酵母。另有關(guān)于用乳酸克魯維酵母大規(guī)模制備重組牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)的報(bào)道。Van den Berg.Bio/Technology，8135(1990)。用于通過(guò)克魯維酵母工業(yè)菌株分泌成熟的重組人血清白蛋白的穩(wěn)定型多拷貝表達(dá)載體也被發(fā)現(xiàn)。Fleer等，Bio/Technology 9968-975(1991)。
(iv)啟動(dòng)子組分表達(dá)載體和克隆載體通常含有可被宿主生物識(shí)別并與抗ErbB2抗體核酸可操作相連的啟動(dòng)子。適合于在原核宿主中應(yīng)用的啟動(dòng)子包括phoA啟動(dòng)子，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)和雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。然而，其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是適合的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還含有Shine-Dalgamo(S.D.)序列，它與編碼抗ErbB2抗體的DNA可操作連接。
用于真核生物的啟動(dòng)子序列是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25-30個(gè)堿基處具有一個(gè)富含AT的區(qū)域。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游70-80個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3’末端是AATAAA序列，它是用于在編碼序列3’末端添加poly A尾的信號(hào)。所有這些序列均被適當(dāng)?shù)夭迦氲秸婧吮磉_(dá)載體。
適于在酵母宿主中應(yīng)用的啟動(dòng)序列實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。
其它的酵母啟動(dòng)子，即那些能通過(guò)生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下述基因的啟動(dòng)子區(qū)，即乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73657中進(jìn)一步敘述了用于酵母表達(dá)系統(tǒng)的適當(dāng)載體和啟動(dòng)子。酵母增強(qiáng)子與酵母啟動(dòng)子一起使用更有利。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，由載體轉(zhuǎn)錄抗ErbB2抗體可受下述啟動(dòng)子調(diào)控，所述啟動(dòng)子來(lái)自病毒基因組(如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選猴病毒40(SV40))啟動(dòng)子，或來(lái)自肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子等異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，或來(lái)自熱休克啟動(dòng)子，只要這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可方便地以SV40限制性片段的形式獲得，它還包括SV40病毒的復(fù)制起始點(diǎn)。人巨細(xì)胞病毒的即早期啟動(dòng)子方便地以Hind IIIE限制性片段的形式獲得。在美國(guó)專利4419446中公開了在哺乳動(dòng)物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體的表達(dá)系統(tǒng)。在美國(guó)專利4601978中敘述了對(duì)這個(gè)系統(tǒng)改進(jìn)。另見(jiàn)Reyes等，自然297598-601(1982)中關(guān)于在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子控制下在小鼠細(xì)胞中表達(dá)人β干擾素cDNA?；蛘撸瑒谑先饬霾《鹃L(zhǎng)末端重復(fù)序列可作為啟動(dòng)子使用。
(v)增強(qiáng)子元件組分在載體中插入增強(qiáng)子序列通常可增加編碼本發(fā)明抗ErbB2抗體的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)知道很多哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列。然而人們通常使用真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在其復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的SV40增強(qiáng)子(bp100-270)，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在其復(fù)制起始點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。另見(jiàn)Yaniv，自然29717-18(1982)中所述的用于活化真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。所述增強(qiáng)子可以剪接入抗ErbB2抗體編碼序列的5’或3’端，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5’端。
(vi)轉(zhuǎn)錄終止組分用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體，還包括對(duì)轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)所必須的序列。這些序列通常來(lái)自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含核苷酸片段，其轉(zhuǎn)錄為編碼抗ErbB2抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中的聚腺苷酸化片段。一種有效的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸區(qū)。見(jiàn)WO94/11026及其所公開的表達(dá)載體。
(vii)宿主細(xì)胞的篩選和轉(zhuǎn)化用于克隆或表達(dá)本發(fā)明載體中DNA的合適的宿主細(xì)胞是上述原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。用于此目的的適合的原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌等真細(xì)菌，如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的埃希菌屬(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文菌屬、克雷白菌屬、變形菌桿屬、沙門菌屬(例如鼠傷寒沙門菌)、沙雷菌屬(粘質(zhì)沙雷菌)和志賀菌屬等，以及芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(例如1989年4月12日出版的DD266710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬的銅綠菌假單胞菌，及鏈霉菌。優(yōu)選大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31446)，份聲明大腸桿菌B、大腸桿菌X177(ATCC31537)和大腸桿菌W3110(ATCC27325)等其它菌株也適合。這些實(shí)例是用于說(shuō)明而不是限制于此。
除了原核生物，絲狀真菌或酵母等真核微生物也是適于使編碼抗ErbB2抗體的載體克隆或表達(dá)的宿主。釀酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最為常用。然而，多種其它屬、種和株也是可公開得到的并可用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母屬，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16045)、成克曼氏克魯維酵母(K.wickeramll)(ATCC24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP402226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183070)；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP244234)；粗糙鏈孢霉；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium以及曲霉屬如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉等。
用于表達(dá)糖基化抗體的適合宿主細(xì)胞來(lái)自多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的容許型昆蟲宿主細(xì)胞，所述宿主包括草地夜蛾(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、Drosophila melanogaster(果蠅)和家蠶蛾等。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株可以公開地獲得，例如加利福尼亞Y級(jí)夜蛾(autographa california)NPV的L-1變體和家蠶蛾NPV的Bm-5株，并且這些病毒可以在此用作為根據(jù)本發(fā)明的病毒，尤其是用于草地夜蛾細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
棉花、玉米、土豆、大豆、牽牛花、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。
然而，關(guān)注最多的是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞已經(jīng)成為常規(guī)方法。有效哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的實(shí)例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細(xì)胞系(293細(xì)胞或亞克隆培養(yǎng)成懸浮培養(yǎng)液的293細(xì)胞，Graham等，普通病毒新雜志(J.GenVirol.)3659(1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊774216(1980))；小鼠足細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細(xì)胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI細(xì)胞(Mather等，紐約科學(xué)院年鑒(Annals N.Y.Acad.Sci.)38344-68(1982))；MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(Hep G2)。
宿主細(xì)胞用上述用于抗ErbB2抗體制備的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化，并在改進(jìn)型傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)改進(jìn)已適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。
(viii)培養(yǎng)宿主細(xì)胞用于制備本發(fā)明的抗ErbB2抗體的宿主細(xì)胞可在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham’s F10(Sigma)、最小基本培養(yǎng)基((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良型Eagle氏培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)均適合于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。另外，在Ham等，酶學(xué)方法5844(1979)；Barnes等，生物化學(xué)年鑒102255(1980)；美國(guó)專利4767704、4657866、4927762、4560655或5122469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國(guó)專利Re.30985中所述任何培養(yǎng)基可作為所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。任何所述培養(yǎng)基可在需要時(shí)補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸)、緩沖液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷嘧啶)、抗生素(例如遺傳霉素(GENTAMYCINTM))、痕量元素(定義為通常以微摩爾級(jí)終濃度出現(xiàn)的無(wú)機(jī)化合物)、葡萄糖或一種等價(jià)能源。還包括任何其它必須補(bǔ)充物，其相應(yīng)濃度為本領(lǐng)域已知。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是現(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用于表達(dá)型宿主細(xì)胞的那些，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)此很熟悉。
(ix) 抗ErbB2抗體的純化當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，抗體可以在細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)空間中產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述抗體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，第一步通過(guò)離心或超濾除去顆粒狀碎片，即宿主細(xì)胞或其裂解片段。Carter等，生物/技術(shù)10163-167(1992)中敘述了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中的抗體的方法。簡(jiǎn)言之，在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的條件下融解細(xì)胞團(tuán)超過(guò)30分鐘。通過(guò)離心可以將細(xì)胞碎片除去。在抗體分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白濃縮濾膜(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單位)濃縮此類表達(dá)系統(tǒng)的上清。在任何上述步驟中可以包括抑制蛋白裂解的PMSF等蛋白酶抑制劑，并且可以包括抑制外來(lái)污染物生長(zhǎng)的抗生素。
從所述細(xì)胞中制備的抗體組合物可利用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析等方法純化，優(yōu)選親和層析。蛋白A作為親和配體的適合性取決于該抗體上任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(Lindmark等，免疫學(xué)方法雜志，621-13(1983))。蛋白G被建議用于所有的小鼠同種型和人γ3(Guss等，EMBO J.51567-1575(1986))。與親和配體結(jié)合的基質(zhì)最常用瓊脂糖，但也可利用其它基質(zhì)。具有機(jī)械穩(wěn)定性的基質(zhì)如控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等，比瓊脂糖允許更快的流速且耗時(shí)更短。在所述抗體包括CH3結(jié)構(gòu)域的情況中，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker，PhilliPBSurg，NJ)有利于純化。根據(jù)待回收的抗體，還可以應(yīng)用其它蛋白純化技術(shù)，例如在離子交換柱上的分級(jí)分離、乙醇沉淀、反向HPLC、硅層析、在陽(yáng)離子或陰離子交換樹脂層析(例如聚天冬氨酸柱)上進(jìn)行的肝素SEPHAROSETM層析、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。
在任何最初純化步驟之后，利用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，可以對(duì)包括所述目的抗體和污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，優(yōu)選在低鹽濃度條件下進(jìn)行(例如大約0-0.25M鹽濃度)。
IV.藥物制劑形式根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的藥用制劑通過(guò)將具有所需純度的抗體與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷氏藥學(xué)(Remington’s PharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以凍干劑或含水劑的形式保存?？伤幱幂d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對(duì)受者無(wú)毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫TM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801敘述了優(yōu)選的凍干型抗ErbB2抗體劑型，在此引入本文作為參考。
所述制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補(bǔ)活性但相互無(wú)負(fù)面影響的那些。例如，可能需要在一種制劑中進(jìn)一步提供與EGFR、ErbB2(例如結(jié)合ErbB2上不同表位的抗體)、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)結(jié)合的抗體?；蛘?或另外)，所述組合物可進(jìn)一步包括化療藥、細(xì)胞毒性藥、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)抑制劑、抗激素藥、EGFR-靶向藥、抗血管生成藥、和/或心臟保護(hù)劑。這些分子以對(duì)所需目的有效的總量在組合中適當(dāng)?shù)卮嬖凇?br> 活性成分也可容納在通過(guò)凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備的微膠囊中，如分別在膠體性質(zhì)的藥物運(yùn)送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)或大乳劑(macroemulsions)的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(異丁烯酸甲酯)微膠囊。這些技術(shù)見(jiàn)雷氏藥學(xué)，第16版Osol，A.編(1980)。
也可制備控釋制劑?？蒯屩苿┑倪m當(dāng)實(shí)例包括含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠囊?？蒯屩苿?shí)例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國(guó)專利3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。
用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)除菌濾膜過(guò)濾而輕易實(shí)現(xiàn)。
V.用抗ErbB2抗體進(jìn)行的治療根據(jù)本發(fā)明，可將抗ErbB2抗體用于治療各種疾病。疾病實(shí)例包括良性或惡性腫瘤；白血病和淋巴的惡性疾?。黄渌膊?，如神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦、腺體、巨噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)、囊胚腔、炎癥性、血管生成性和免疫性的疾病。
通常，所治疾病是癌癥。在此所治癌癥的實(shí)例包括但不限于癌(carcinoma)，淋巴瘤，母細(xì)胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴的惡性病。這些癌的更具體實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)直腸癌，直結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepatic carcinoma)，肛門癌，陰莖癌以及頭頸癌。
所述癌癥通常含有ErbB2表達(dá)細(xì)胞，從而使本文所述抗ErbB2抗體能與癌結(jié)合。雖然所述癌癥的特點(diǎn)是ErbB2受體過(guò)度表達(dá)，但本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了對(duì)不被認(rèn)為是ErbB2過(guò)度表達(dá)的癌的治療方法。為了測(cè)定癌中的ErbB2表達(dá)，可應(yīng)用各種診斷性/預(yù)后性檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，ErbB2過(guò)度表達(dá)可通過(guò)IHC(例如利用HERCEPTEST(Dako))進(jìn)行檢測(cè)。可對(duì)腫瘤活檢的石蠟包埋組織切片進(jìn)行IHC檢測(cè)，ErbB蛋白染色強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)如下分值0沒(méi)有觀察到染色，或在少于10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到膜染色。
分值1+在多于10％的腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到微弱/勉強(qiáng)看得見(jiàn)的膜染色。所述細(xì)胞僅有膜的一部分被染色。
分值2+在多于10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到從弱到中等強(qiáng)度的完全膜染色。
分值3+在多于10％的腫瘤細(xì)胞中觀察到從中度到很強(qiáng)的完全膜染色。
可將ErbB2過(guò)度表達(dá)評(píng)估分值為0或1+的那些腫瘤鑒定為并未過(guò)度表達(dá)ErbB2，而將分值為2+或3+的那些腫瘤鑒定為過(guò)度表達(dá)ErbB2。
或者(或另外)，可在甲醛固定且石蠟包埋的腫瘤組織上進(jìn)行例如INFORMTM(購(gòu)自Ventana，Arizona)或PATHVISIONTM(Vysis，Illinois)等FISH檢測(cè)，確定腫瘤中ErbB2過(guò)度表達(dá)的程度(如果有)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是表達(dá)(并且可能過(guò)度表達(dá))EGFR的癌?？杀磉_(dá)/過(guò)度表達(dá)EGFR的癌實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)，肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)，腹膜癌，肝細(xì)胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(livercancer)，膀胱癌，肝細(xì)胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)直腸癌，直結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepaticcarcinoma)，肛門癌，陰莖癌以及頭頸癌。
在此所治療的癌可以是以ErbB受體(例如EGFR)的過(guò)度活化為特點(diǎn)的癌。此過(guò)度活化的原因可能是ErbB受體或ErbB配體的過(guò)度表達(dá)或產(chǎn)量增加。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行診斷性或預(yù)后性檢測(cè)，以確定患者的癌是否是以ErbB受體過(guò)度活化為特點(diǎn)。例如，可檢測(cè)所述癌癥中ErbB基因的擴(kuò)增和/或ErbB受體的過(guò)度表達(dá)?？蓽y(cè)定這種擴(kuò)增/過(guò)度表達(dá)的各種試驗(yàn)為本領(lǐng)域現(xiàn)有，包括IHC、FISH和上述脫落抗原試驗(yàn)?；蛘?或另外)，可根據(jù)已知方法檢測(cè)腫瘤中的或與腫瘤相關(guān)的TGF-α等ErbB配體的水平。這些試驗(yàn)可檢測(cè)待檢樣品中的蛋白或其編碼核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用免疫組化法(IHC)可檢測(cè)腫瘤中ErbB配體的水平；見(jiàn)例如Scher等，臨床癌癥研究1545-550(1995)?；蛘?或另外)，可通過(guò)例如FISH、southern印跡或PCR技術(shù)，等評(píng)估待檢樣品中編碼ErbB配體的核酸的水平。
而且，ErbB受體或ErbB配體的過(guò)度表達(dá)或擴(kuò)增可利用體內(nèi)診斷試驗(yàn)評(píng)估，如給藥能與待檢分子結(jié)合并帶有可檢測(cè)標(biāo)記(如放射性同位素)的分子，并從外部對(duì)患者進(jìn)行掃描以定位該標(biāo)記。
在所治療癌癥是激素非依賴性癌的情況中，可利用上述各種試驗(yàn)評(píng)估腫瘤中激素(如雄激素)和/或其同源受體的表達(dá)?；蛘?或另外)，可以因?yàn)榛颊邔?duì)抗激素治療不再產(chǎn)生應(yīng)答而將其診斷為患有激素非依賴性癌。
在某些實(shí)施方案中，將包括與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)的抗ErbB2抗體的免疫偶聯(lián)物給藥至患者。優(yōu)選所述免疫偶聯(lián)物和/或與它結(jié)合的ErbB2蛋白被細(xì)胞攝入(internalize)，導(dǎo)致在殺傷與它結(jié)合的癌細(xì)胞時(shí)增加免疫偶聯(lián)物的治療效果。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒藥物在癌細(xì)胞中靶向或干擾核酸。此細(xì)胞毒藥物的實(shí)例包括美登素、加利車霉素、核糖核酸酶和DNA內(nèi)切核酸酶。
抗ErbB2抗體或免疫偶聯(lián)物可用已知方法向人類患者給藥，如靜脈給藥(例如作為大丸劑給藥或通過(guò)持續(xù)輸注一段時(shí)間而給藥)等，通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑給藥。優(yōu)選將抗體靜脈內(nèi)或皮下給藥。
其它治療方案也可與抗ErbB2抗體的給藥聯(lián)合進(jìn)行。這種聯(lián)合給藥包括用分別不同的制劑或單個(gè)藥物制劑共同給藥，以及以任何次序連續(xù)給藥，其中優(yōu)選有一段時(shí)間為兩種(或所有)活性藥物同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)活性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用兩種不同的抗ErbB2抗體對(duì)所述患者進(jìn)行治療。例如，可用阻斷ErbB受體的配體活化作用的第一種抗ErbB2抗體或具有單克隆抗體2C4的生物學(xué)特點(diǎn)的抗體，以及能抑制生長(zhǎng)的第二種抗ErbB2抗體(例如HERCEPTIN)或能誘導(dǎo)ErbB2過(guò)度表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗ErbB2抗體(例如7C2、7F3或其人源化變體)，對(duì)患者進(jìn)行治療。優(yōu)選這種聯(lián)合治療引起協(xié)同治療效果。例如，可用HERCEPTIN治療患者，之后，例如當(dāng)該患者對(duì)HERCEPTIN治療沒(méi)有應(yīng)答的情況下，用rhuMAb 2C4進(jìn)行治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者首先用rhuMAb 2C4治療，之后接受HERCEPTIN治療。在另外的實(shí)施方案中，同時(shí)用rhuMAb 2C4和HERCEPTIN對(duì)患者進(jìn)行治療。
可能還需要將抗ErbB2抗體(或多種抗ErbB2抗體)的給藥與針對(duì)另一種腫瘤相關(guān)抗原的抗體的給藥聯(lián)合。在這種情況中，所述另一種抗體可與例如EGFR、ErbB3、ErbB4或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療涉及將抗ErbB2抗體(或多種抗ErbB2抗體)與一或多種化療藥或生長(zhǎng)抑制藥聯(lián)合給藥，包括組合不同的化療藥共同給藥。優(yōu)選的化療藥包括紫杉烷(如紫杉醇(paclitaxel)和紫杉萜(docetaxel))和/或蒽環(huán)類抗生素。這些化療藥的制劑和給藥方案可根據(jù)廠商的說(shuō)明進(jìn)行，或根據(jù)熟練醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)確定。這類化療的制劑和給藥分案亦參見(jiàn)Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams和Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
可將抗激素化合物(例如他莫昔芬等抗雌激素化合物；奧那司酮(onapristone)等抗黃體酮藥物(EP 6168 12)；或氟他胺等抗雄激素)以這些分子的已知?jiǎng)┝颗c所述抗體組合給藥。當(dāng)所治療的癌是激素非依賴性癌時(shí)，所述患者可先接受抗激素治療，在所述癌癥變?yōu)榧に胤且蕾囆园┲?，可向該患者給藥抗ErbB2抗體(和任選的本文所述其它藥物)。
有時(shí)，向患者同時(shí)給藥心臟保護(hù)劑(以阻止或減少與該治療相關(guān)的心肌功能障礙)或一個(gè)或多種細(xì)胞因子，可能也是有益的。還可同時(shí)給藥靶向EGFR的藥物或抗血管生成劑。除了上述治療方案外，可對(duì)患者進(jìn)行切除癌的手術(shù)和/或放療。
本文所述抗ErbB2抗體還可與如上文定義部分所述的那些EGFR靶向藥物聯(lián)合，產(chǎn)生互補(bǔ)而強(qiáng)效的協(xié)同治療效果。
如上述共給藥的任何藥物的適當(dāng)劑量是目前應(yīng)用的劑量，而且由于所述藥物和抗ErbB2抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)可降低使用劑量。
進(jìn)行疾病的預(yù)防或治療時(shí)，抗體的適當(dāng)劑量依賴于所治疾病的類型(如上所述)，疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程，抗體給藥的目的是預(yù)防還是治療，先前的治療，患者的臨床病史和對(duì)抗體的應(yīng)答，以及主治醫(yī)生的判斷?？贵w可一次或分多次向患者給藥。無(wú)論是例如一次或多次分別給藥，還是連續(xù)輸注給藥，向患者給藥的起始候選劑量是約1μg/kg-15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體，其取決于疾病的類型或嚴(yán)重程度。典型的每日給藥劑量范圍是從1μg/kg到100mg/kg或更多，取決于上述因素。重復(fù)給藥數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，視具體情況而將治療持續(xù)至出現(xiàn)對(duì)疾病癥狀的所需抑制為止?？贵w的優(yōu)選劑量范圍是約0.05mg-10mg/kg。因而，可以以約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)向患者給藥一或多劑。所述劑量可間歇給與，如每周一次或每三周一次，(例如使患者接受約2-20劑(如6劑)抗ErbB2抗體)?？梢砸暂^大劑量起始給藥，然后以較小劑量給藥一或多劑。劑量方案的實(shí)例包括給藥劑量約4mg/kg的抗ErbE2抗體起始，之后給藥約2mg/kg的每周持續(xù)劑量。但其它劑量方案也有效。此治療的進(jìn)展可通過(guò)傳統(tǒng)的技術(shù)和檢測(cè)容易地監(jiān)控。
除了向患者給藥抗體蛋白，本申請(qǐng)考慮了通過(guò)基因治療而給藥抗體。編碼抗體的核酸的這種給藥方式包含在術(shù)語(yǔ)“給藥治療有效量的抗體”中。見(jiàn)例如1996年3月14日公布的WO96/07321，其中涉及利用基因治療來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗體。
有兩種主要途徑使所述核酸(任選包括在載體中)進(jìn)入患者的細(xì)胞中體內(nèi)和回體(ex vivo)。在體內(nèi)運(yùn)輸中，直接向患者注射所述核酸，通常在需要所述抗體的部位注射。在回體治療中，取出患者的細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些離體的細(xì)胞中，然后將改良的細(xì)胞直接回輸給患者或?qū)⑵浒辉诙嗫啄ぶ幸浦仓粱颊唧w內(nèi)(見(jiàn)例如美國(guó)專利4892538和5283187)。有許多技術(shù)可用于將核酸引入活細(xì)胞中。根據(jù)所述核酸是在體外轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)細(xì)胞中，還是在體內(nèi)轉(zhuǎn)移入目的宿主細(xì)胞中，所應(yīng)用的技術(shù)不同。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)包括脂質(zhì)體的使用，電穿孔，顯微注射，細(xì)胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸鈣沉淀法等?；虻幕伢w傳遞常用的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(例如腺病毒、單純皰疹病毒I型或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的有效脂質(zhì)體是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在一些情況中，需要提供核酸來(lái)源，及靶向靶細(xì)胞的藥劑，例如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞具有特異性的抗體、靶細(xì)胞上受體的配體等等。在使用脂質(zhì)體的情況中，與內(nèi)吞作用相關(guān)型表面膜蛋白結(jié)合的蛋白可用于靶向和/或促進(jìn)攝取，例如對(duì)特殊細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)中內(nèi)在化的蛋白的抗體，靶向細(xì)胞內(nèi)部位并延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白。受體介導(dǎo)的胞飲作用的技術(shù)參見(jiàn)Wu等，生物學(xué)化學(xué)雜志2624429-4432(1987)；Wagner等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊873410-3414(1990)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因治療方案的綜述見(jiàn)Anderson等，科學(xué)256808-813(1992)。另見(jiàn)WO93/25673，在此引入本文作為參考。
VI.產(chǎn)品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了含用于治療上述疾病的物質(zhì)的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括一個(gè)容器和位于該容器表面的或與該容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。適當(dāng)?shù)娜萜饔衅孔?，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器可內(nèi)含一種能有效治療目標(biāo)疾病或紊亂的組合物，并具有無(wú)菌存取口(例如該容器可以是靜脈注射袋或帶有能通過(guò)皮下注射針穿刺的塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性藥劑是抗ErbB2抗體。所述標(biāo)簽或包裝插頁(yè)說(shuō)明，所述組合物可用于治療指定的疾病(例如癌)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽和包裝插頁(yè)說(shuō)明，內(nèi)含與ErbB2結(jié)合的抗體的所述組合物可用于治療能表達(dá)選自表皮生長(zhǎng)因子(EGFR)、ErbB3和ErbB4(優(yōu)選表達(dá)EGFR)的ErbB受體的癌癥。另外，標(biāo)簽或包裝插頁(yè)可說(shuō)明，所要治療的患者是患有以ErbB受體(選自EGFR、ErbB3或ErbB4)過(guò)度活化為特點(diǎn)的癌的患者。例如，所述癌癥可以是過(guò)度表達(dá)一種這類受體或過(guò)度表達(dá)ErbB配體(例如TGF-α)的癌。所述標(biāo)簽和包裝插頁(yè)還可說(shuō)明，所述組合物可用于治療不以ErbB受體過(guò)度表達(dá)為特征的癌癥。例如，當(dāng)HERCEPTIN的包裝插頁(yè)說(shuō)明該抗體可用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者(其腫瘤過(guò)度表達(dá)ErbB2蛋白)時(shí)，本發(fā)明的包裝插頁(yè)可能說(shuō)明，上述抗體或組合物可用于治療癌癥而不必考慮ErbB2抗體過(guò)度表達(dá)的程度。在其它實(shí)施方案中，所述包裝插頁(yè)可能說(shuō)明，所述抗體或組合物可用于治療乳腺癌(例如轉(zhuǎn)移性乳腺癌)；激素非依賴性癌；前列腺癌(例如雄激素非依賴性前列腺癌)；肺癌(例如小細(xì)胞肺癌)；結(jié)腸、直腸或結(jié)直腸癌；或本文所述的任何疾病。而且，所述產(chǎn)品可包括(a)其中裝有組合物的第一個(gè)容器，所述組合物含有能結(jié)合ErbB2并抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌生長(zhǎng)的第一抗體；和(b)其中裝有組合物的第二個(gè)容器，所述組合物含有能結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二抗體。本發(fā)明的此實(shí)施方案中的產(chǎn)品可進(jìn)一步包括包裝插頁(yè)，其說(shuō)明第一和第二抗體組合物可用于治療癌癥。而且，該包裝插頁(yè)可指導(dǎo)所述組合物(包括結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體)的使用者將用抗體進(jìn)行的治療與前面段落中所述的任何輔助治療(例如，化療藥，EGFR靶向藥，抗血管生成藥，抗激素化合物，心臟保護(hù)劑和/或細(xì)胞因子)進(jìn)行組合。或者(或另外)，所述產(chǎn)品可進(jìn)一步包括第二個(gè)(或第三個(gè))容器，其中含可藥用的緩沖液，例如用于注射的抑細(xì)菌水(BWFI)，磷酸鹽緩沖液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。還可包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的其它材料，如其它緩沖液、稀釋劑，濾器，針頭和注射器。
VII.抗ErbB2抗體的非治療性應(yīng)用本發(fā)明的抗體(例如人源化抗ErbB2抗體)具有進(jìn)一步的非治療性應(yīng)用。
例如，所述抗體可用作親和純化試劑。在這個(gè)過(guò)程中，可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)將抗體固定在Sephadex樹脂或?yàn)V紙等固相上。使固相化抗體與要純化的含ErbB蛋白(或其片段)的樣品接觸，之后用適當(dāng)溶劑洗滌支持相，使得基本除去樣品中除了與固相化抗體結(jié)合的ErbB2蛋白外的所有其它物質(zhì)。最后，用另一種適當(dāng)溶液(例如甘氨酸緩沖液，pH 5.0)洗滌支持相，使ErbB2蛋白從抗體中釋放。
抗ErbB2抗體可用于ErbB2蛋白的診斷檢測(cè)，例如檢測(cè)其在特異性細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)。
對(duì)于診斷性應(yīng)用，通常用可檢測(cè)的組分標(biāo)記抗體。多種標(biāo)記物可用，它們總體上分為下述幾類(a)放射性同位素，例如35S、14C、125I、3H和131I。利用例如在免疫學(xué)最新方案(Current Protocols in Immunology)，卷1和2，Coligen等編，Wiley-interscience，紐約，New York Pubs.(1991)中所述方法，用放射性同位素對(duì)所述抗體進(jìn)行標(biāo)記，并且可以利用閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)放射活性。
(b)可以應(yīng)用熒光標(biāo)記，例如稀土元素螯合物(銪螯合物)或熒光素及其衍生物，例如羅丹明及其衍生物、丹磺酰、麗絲胺、藻紅蛋白和得克薩斯紅?？梢岳美缭诿庖邔W(xué)最新方案，出處同上，中所述技術(shù)，將所述熒光標(biāo)記物與所述抗體連接。利用熒光計(jì)定量熒光。
(c)可以應(yīng)用各種酶-底物標(biāo)記，在美國(guó)專利號(hào)4275149中提供了對(duì)其中一些的綜述。所述酶通常催化發(fā)色底物的化學(xué)變化，可以利用各種技術(shù)測(cè)定這些變化。例如，所述酶可以催化底物的顏色變化，其可以被分光光度計(jì)所檢測(cè)?；蛘撸雒缚梢愿淖兊孜锏臒晒饣蚧瘜W(xué)發(fā)光。用于定量熒光改變的技術(shù)見(jiàn)上面的敘述?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)激發(fā)電子，然后發(fā)出可以被檢測(cè)(例如，用化學(xué)發(fā)光儀)或給熒光受體提供能量的光。酶標(biāo)記的實(shí)例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶或細(xì)菌螢光素酶，美國(guó)專利號(hào)4737456)、螢光素、2，3-二氫二氮雜萘二酮、蘋果酸酯脫氫酶、脲酶、辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)等過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶等。在O’Sullivan等，制備酶免疫分析所用酶-抗體偶聯(lián)物的方法，酶學(xué)方法，(J.Langone和H.Van Vunakis編)，Academic press，紐約，73147-166(1981)中敘述了將酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)。
酶-底物組合的實(shí)例包括(i)辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)，氫過(guò)氧化物酶為底物，由氫過(guò)氧化物酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺氫氯化物(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)，以對(duì)硝基苯磷酸鹽為發(fā)色底物；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)，有發(fā)色底物(例如對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或發(fā)熒光底物4-甲基傘形基(umbelliferyl)-β-D-半乳糖苷酶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以應(yīng)用其它多種酶-底物組合。其綜述見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4275149和4318980。
有時(shí)，標(biāo)記物與抗體間接連接。技術(shù)人員知道用于此的各種技術(shù)。例如，可使多肽與生物素偶聯(lián)，并使上述三類標(biāo)記物之任一與抗生物素蛋白結(jié)合，反之亦然。生物素與抗生物素蛋白選擇性結(jié)合，使標(biāo)記物能以這種方式間接與抗體偶聯(lián)。或者，為使標(biāo)記物與抗體間接連接，將抗體與小分子半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)，并將上述不同類型標(biāo)記物之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。如此可實(shí)現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接偶聯(lián)。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，抗體不需要標(biāo)記，其存在可利用與該抗體結(jié)合的標(biāo)記抗體檢測(cè)。
本發(fā)明抗體可用于任何已知的試驗(yàn)方法，如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、直接和間接夾心試驗(yàn)，及免疫沉淀試驗(yàn)。Zola，單克隆抗體技術(shù)指南，147-158頁(yè)(CRCPress，Inc.1987)。
在免疫組化方法中，腫瘤樣品可以是新鮮或冰凍樣品，或可包埋于石蠟中并用福爾馬林等防腐劑固定。
所述抗體還可以用于體內(nèi)診斷試驗(yàn)。通常用放射性核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)標(biāo)記所述抗體，以便該抗原或其表達(dá)細(xì)胞可利用免疫閃爍成像術(shù)定位。為方便起見(jiàn)，本發(fā)明的抗體可以以試劑盒(即裝有預(yù)計(jì)量的試劑組合物和進(jìn)行診斷性檢測(cè)的說(shuō)明)的形式提供。在用酶對(duì)所述抗體進(jìn)行標(biāo)記的情況中，該試劑盒包括酶所需要的底物和輔助因子(如提供可檢測(cè)的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。另外，其它的附加物包括例如穩(wěn)定劑、緩沖液(例如封閉緩沖液或裂解緩沖液)等等。各種試劑的相對(duì)量可廣泛變化，以提供使檢測(cè)的敏感性基本上最佳的試劑濃度。所述試劑尤其可以以干粉(通常為凍干劑)的形式提供，其包含賦形劑，使得其溶解后可提供具有適當(dāng)濃度的試劑溶液。
VIII.材料的保藏下述雜交瘤細(xì)胞已保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，美國(guó)(ATCC)抗體命名ATCC編號(hào) 保藏日7C2 ATCC HB-12215 1996年10月17日7F3 ATCC HB-12216 1996年10月17日4D5 ATCC CRL 10463 1990年5月24日2C4 ATCC HB-12697 1999年4月8日本發(fā)明的進(jìn)一步細(xì)節(jié)通過(guò)下述非限定性實(shí)施例舉例說(shuō)明。所有引文在此引入本文作為參考。
實(shí)施例1單克隆抗體2C4的制備和鑒定按Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990)中所述方法，制備與ErbB2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合的鼠單克隆抗體2C4、7F3和4D5。簡(jiǎn)言之，用含25mM EDTA的磷酸鹽緩沖液(PBS)收獲按Hudziak等(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊847158-7163(1987))所述方法制備的NIH 3T3/HER2-3400細(xì)胞(約表達(dá)1×105ErbB2分子/細(xì)胞)，并用其免疫BALB/c小鼠。在第0、2、5和7周給小鼠腹腔注射107個(gè)細(xì)胞(于0.5ml PBS中)。在第9和13周給帶有特定抗血清(其可與32P-標(biāo)記的ErbB2免疫共沉淀)的小鼠腹腔注射麥胚凝集素-Sepharose(WGA)純化的ErbB2膜提取物。之后靜脈注射0.1ml ErbB2制劑，并將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系X63-Ag8.653融合。
通過(guò)ELISA和放射性免疫沉淀法，篩選雜交瘤細(xì)胞上清液的ErbB2結(jié)合。
用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)(Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990))，確定與單克隆抗體4D5、7F3和2C4結(jié)合的ErbB2表位。通過(guò)利用PANDEXTM掃描儀定量完整細(xì)胞上的直接熒光，對(duì)抗體進(jìn)行交叉阻斷研究。用已建立的方法(Wosfsy等，細(xì)胞免疫學(xué)中的篩選方法，287頁(yè)，Mishel和Schiigi(編)SanFrancisco；W.J.Freeman Co.(1980))，將每種單克隆抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)。用胰蛋白酶消化匯合的單層NIH 3T3/HER2-3400細(xì)胞，并洗滌一次，然后重懸于含0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％NaN3的冷PBS中，濃度為1.75×106細(xì)胞/ml。加入終濃度為1％的乳膠顆粒(IDC，Portland，OR)，以降低PANDEXTM平板膜的阻塞。向PANDEXTM平板孔中加入20μl細(xì)胞懸液和20μl純化的單克隆抗體(100μg/ml-0.1μg/ml)，在冰上孵育30分鐘。向每孔中加入20μl預(yù)先稀釋的FITC-標(biāo)記的單克隆抗體，在冰上孵育30分鐘，洗滌后，用PANDEXTM定量熒光。與無(wú)關(guān)單克隆抗體對(duì)照相比，如果每個(gè)抗體阻斷50％或更多的另一抗體的結(jié)合，那么這些單克隆抗體被認(rèn)為共享一個(gè)表位。在本實(shí)驗(yàn)中，單克隆抗體4D5、7F3和2C4分別帶有表位I、G/F和F。
用乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3(見(jiàn)Hudziak等，分子細(xì)胞生物學(xué)9(3)1165-1172(1989))可評(píng)估單克隆抗體4D5、7F3和2C4的生長(zhǎng)抑制特性。簡(jiǎn)言之，用0.25％(體積比)胰蛋白酶消化使SK-BR-3細(xì)胞脫附，并重懸于完全培養(yǎng)基，濃度為4×105細(xì)胞每毫升。將100μl(4×104細(xì)胞)等份試樣的細(xì)胞懸液接種于96孔微稀釋板中，使細(xì)胞粘附，然后只加入100μl培養(yǎng)基或加入含單克隆抗體(終濃度5μg/ml)的培養(yǎng)基。72小時(shí)之后，用PBS(pH7.5)洗滌平板兩次，用結(jié)晶紫(溶于甲醇，濃度為0.5％)染色，然后按Sugarman等，科學(xué)230943-945(1985)中所述方法分析相對(duì)細(xì)胞增殖。相比于單克隆抗體4D5的約56％的抑制率，單克隆抗體2C4和7F3分別抑制SK-BR-3的相對(duì)細(xì)胞增殖約20％和38％。
估測(cè)單克隆抗體2C4、4D5和7F3對(duì)MCF7的全細(xì)胞裂解物中Mr180000范圍內(nèi)的蛋白的HRG活化酪氨酸磷酸化進(jìn)行抑制的能力(Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996))。已經(jīng)報(bào)道MCF7表達(dá)所有已知的ErbB受體，但其表達(dá)水平較低。因?yàn)镋rbB2、ErbB3和ErbB4具有幾乎相同的分子大小，所以當(dāng)用Western雜交法估測(cè)全細(xì)胞裂解物時(shí)，鑒別哪種蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化是不可能的。
然而這些細(xì)胞是酪氨酸磷酸化檢測(cè)的理想細(xì)胞，因?yàn)樵谒褂玫臋z測(cè)條件下，在無(wú)外源性HRG加入時(shí)，在Mr180000范圍內(nèi)，它們呈現(xiàn)低水平到不可檢測(cè)水平的酪氨酸磷酸化蛋白。
將MCF7細(xì)胞接種于24孔平板中，向每孔中加入抗ErbB2單克隆抗體，在室溫下孵育30分鐘；然后向每孔加入rHRGβ1177-244，終濃度為0.2nM，然后持續(xù)孵育8分鐘。從各個(gè)孔中小心地吸出培養(yǎng)基，加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS，25mM DTT，和25mM Tris-Hcl，pH6.8)終止反應(yīng)。將每份樣品在4-12％梯度膠(Vovex)上進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。使抗磷酸酪氨酸(4G10，來(lái)源于UBI，濃度為1μg/ml)免疫雜交顯色，并按先前報(bào)道的反射密度測(cè)定法(Holmes等，科學(xué)2561205-1210(1992)；Sliwkowski等，生物學(xué)化學(xué)雜志26914661-14665)，定量Mr-180000位置處主要反應(yīng)帶的強(qiáng)度。
單克隆抗體2C4、7F3和4D5顯著地抑制Mr180000的蛋白的HRG誘導(dǎo)型酪氨酸磷酸化信號(hào)的產(chǎn)生。在無(wú)HGR的條件下，這些抗體不能激活Mr180000范圍內(nèi)的蛋白的酪氨酸磷酸化。另外，這些抗體不與EGFR(Fendly等，癌癥研究501550-1558(1990))、ErbB3或ErbB4發(fā)生交叉反應(yīng)?？贵w2C4和7F3顯著地抑制對(duì)p180酪氨酸磷酸化的HRG活化作用，使其小于對(duì)照的25％。單克隆抗體4D5能阻斷50％酪氨酸磷酸化的HRG活化。圖2A表明用反射密度測(cè)定法測(cè)定的2C4或7F3抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG活化的劑量應(yīng)答曲線。用4參數(shù)吻合法(fit)估測(cè)這些抑制曲線，得2C4和7F3的IC50值分別為2.8±0.7nM和29.0±4.1nM。
用冰上24孔板中的單層培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施抗ErbB2抗體對(duì)HRG與MCF7乳腺癌細(xì)胞結(jié)合的抑制(Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996))。向每孔中加入ErbB2單克隆抗體，并孵育30分鐘。加入125I標(biāo)記的rHRGβ177- 244(25pm)，繼續(xù)孵育4-16小時(shí)。圖2B給出了2C4或7F3抑制HRG與MCF7細(xì)胞結(jié)合的劑量應(yīng)答曲線。在125I標(biāo)記的rHRGβ1177-244存在的條件下，將不同濃度的2C4或7F3與MCF7細(xì)胞進(jìn)行孵育，抑制曲線見(jiàn)圖2B。分析這些資料，得到2C4和7F3的IC50值分別為2.4±0.3nM和19.0±7.3nM。2C4和7F3的最大抑制率為約74％，其與酪氨酸磷酸化的數(shù)據(jù)相符。
為了確定在MCF7細(xì)胞上觀察到的抗ErbB2抗體的效應(yīng)是否是普遍現(xiàn)象，將人腫瘤細(xì)胞系與2C4或7F3共同孵育，并檢測(cè)125I標(biāo)記的rHRG β1177-244特異性結(jié)合的程度(Lewis等，癌癥研究561457-1465(1996))。研究結(jié)果見(jiàn)圖3。除了已經(jīng)報(bào)道的少量表達(dá)或不表達(dá)ErbB2的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468之外，121I標(biāo)記型rHRG β1177-244的結(jié)合在所有細(xì)胞系中均可被2C4或7F3顯著抑制。報(bào)道表明其余的細(xì)胞系均表達(dá)ErbB2，在這些細(xì)胞系中ErbB2表達(dá)水平差別很大。實(shí)際上，在所檢測(cè)的細(xì)胞系中ErbB2表達(dá)程度的差異超過(guò)2個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，BT-20、MCF7和Caov3表達(dá)約104 ErbB2受體/細(xì)胞，而BT-474和SK-BR-3表達(dá)約106ErbB2受體/細(xì)胞。由這些細(xì)胞中ErbB2表達(dá)程度的較大差異及上述資料，推斷ErbB2和ErbB3或ErbB4之間的相互作用本身是高親和力的相互作用，其發(fā)生在胞漿膜的表面。
在外源rHRGβ1存在或不存在的條件下，估測(cè)了單克隆抗體2C4和4D5對(duì)MDA-MB-175和SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(Achaefer等，癌基因151385-1394(1997))。MDA-MB-175細(xì)胞中ErbB2水平比正常乳腺上皮細(xì)胞中的水平高4-6倍，并且ErbB2-ErbB4受體在MDA-MB-175細(xì)胞中被組成性磷酸化。用抗ErbB2單克隆抗體2C4和4D5(10μg/ml)處理MDA-MB-175細(xì)胞4天。在結(jié)晶紫染色檢測(cè)中，與2C4保溫表現(xiàn)出很強(qiáng)的對(duì)此細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用(圖4A)。外源性HRG不能顯著地逆轉(zhuǎn)此抑制。在另一方面，2C4顯示對(duì)ErbB2過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞系SK-BR-3沒(méi)有抑制作用(圖4B)。在外源性HRG存在或不存在的條件下，單克隆抗體2C4能抑制MDA-MB-175細(xì)胞的增殖，其程度大于單克隆抗體4D5的抑制程度。4D5對(duì)細(xì)胞增殖的抑制依賴于ErbB2的表達(dá)水平(Lewis等，Cancer Immunol.Immunother.37255-263(1993))。在SK-BR-3細(xì)胞中檢測(cè)到的最大抑制率為66％(圖4B)。但是此作用可被外源HRG克服。
實(shí)施例2單克隆抗體2C4阻斷ErbB2與ErbB3的HRG依賴性結(jié)合用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ErbB3與ErbB2結(jié)合的能力。將1.0×106MCF7或SK-BR-3細(xì)胞接種在6孔組織培養(yǎng)板中并使其粘附過(guò)夜，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(FBS)和10mM HEPES(pH 7.2)的5050DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基(生長(zhǎng)培養(yǎng)基)。在實(shí)驗(yàn)開始前，將所述細(xì)胞在無(wú)血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)2小時(shí)。
用PBS簡(jiǎn)單地洗滌所述細(xì)胞，然后用100nM所指抗體(在含10mMHEPES的0.2％w/v牛血清白蛋白(BSA)RPMI培養(yǎng)基(pH 7.2)(結(jié)合緩沖液)中稀釋)或只用結(jié)合緩沖液(對(duì)照)孵育所述細(xì)胞。室溫下1小時(shí)之后，向一半的孔中加入HRG，終濃度為5nM(+)。向其它孔中加入相似體積的結(jié)合緩沖液(-)。持續(xù)孵育近10分鐘。
吸出上清，在含0.2mM PMSF、10μg/ml亮抑酶肽和10TU/ml抑酶肽的RPMI、10mM HEPES、pH7.2、1.0％v/v TRITON X-100TM、1.0％w/v CHAPS(裂解緩沖液)中裂解細(xì)胞。離心去除裂解物中不溶性物質(zhì)。
用與親和凝膠(Affi-Prep10，Bio-Rad)共價(jià)偶聯(lián)的單克隆抗體使ErbB2免疫沉淀。該抗體(Ab-3，Oncogene Sciences)識(shí)別胞漿區(qū)表位。向每份裂解物中加入含約8.5μg固定抗體的10μl凝膠混懸液，進(jìn)行免疫沉淀，使樣品在室溫下混合2小時(shí)。然后通過(guò)離心收集凝膠。用裂解緩沖液逐批洗滌凝膠3次，去除未結(jié)合物質(zhì)。然后加入SDS樣品緩沖液，并將樣品在沸水浴中簡(jiǎn)單加熱。
將上清在4-12％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。通過(guò)用針對(duì)ErbB3的胞漿區(qū)表位的多克隆抗體(c-17，Santa Cruz Biotech)檢測(cè)這些印跡膜，估測(cè)ErbB3的存在。用化學(xué)發(fā)光底物(ECL，Amersham)使這些印跡膜顯色。
如圖5A和圖5B(分別為MCF和SK-BR-3細(xì)胞)中對(duì)照泳道結(jié)果所示，只有當(dāng)用HRG活化細(xì)胞時(shí)，ErbB2免疫沉淀中才存在ErbB3。如果首先用單克隆抗體2C4孵育細(xì)胞，那么ErbB3信號(hào)在MCF7細(xì)胞中消失(圖5A泳道2C4+)，或在SK-BR-3細(xì)胞中明顯下降(圖5B泳道2C4+)。如圖5A-B所示，在MCF7和SK-BR-3細(xì)胞中，單克隆抗體2C4基本上比HERCEPTIN更有效地阻斷ErbB3與ErbB2的heregulin依賴性結(jié)合。用HERCETIN預(yù)溫育可降低MCF7裂解物中的ErbB3信號(hào)，但對(duì)SK-BR-3裂解物中ErbB3共沉淀的量幾乎沒(méi)有或完全沒(méi)有影響。用針對(duì)EGF受體(Ab-1，OncogeneSciences)的抗體預(yù)溫育，對(duì)ErbB3在這兩種細(xì)胞中與ErbB2免疫共沉淀的能力沒(méi)有影響。
實(shí)施例3
人源化2C4抗體首先將鼠單克隆抗體2C4的可變區(qū)克隆到允許產(chǎn)生小鼠/人嵌合Fab片段的載體中。用Stratagene RNA提取試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書，從雜交瘤細(xì)胞中分離總RNA。用RT-PCR法擴(kuò)增可變區(qū)，凝膠純化，插入到含人κ恒定區(qū)和CH1區(qū)的pUC119衍生質(zhì)粒中，如先前所述(Carter等，PNAS(USA)894285(1992)；美國(guó)專利5821337)。用得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌16C9，用于表達(dá)Fab片段。按先前所述方法(Werther等，免疫學(xué)雜志1574986-4995(1996)；Presta等，癌癥研究574593-4599(1997))，進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和純化Fab片段。
對(duì)純化的嵌合2C4 Fab段和鼠親本抗體2C4抑制125I-HRG與MCF7細(xì)胞結(jié)合的能力及其在MCF7細(xì)胞中抑制p180酪氨酸磷酸化的rHRG活化的能力進(jìn)行比較。如圖6A中所示，在破壞人乳腺癌細(xì)胞系MCF7上高親和力ErbB2-ErbB3結(jié)合位點(diǎn)的形成時(shí)，該嵌合2C4 Fab段非常有效。完整鼠抗體2C4的IC50值為4.0±0.4nM，而Fab段的IC50值為7.7±1.1nM。如圖6B所示，單價(jià)嵌合抗體2C4 Fab段在破壞HRG依賴性ErbB2-ErbB3活化作用中非常有效。完整鼠單克隆抗體2C4的IC50值為6.0±2nM，而Fab段的IC50值為15.0±2nM。
嵌合克隆的DNA測(cè)序使得可鑒定CDR殘基(Kabat等，免疫相關(guān)蛋白的序列，5thPublic Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD(1991))(圖7A和B)。按先前所述方法(Presta等，癌癥研究574593-4599(1997))，利用寡核苷酸定點(diǎn)誘變，將所有6個(gè)CDR區(qū)域引入質(zhì)粒VX4上的完整人框架(VLκ亞基I和VH亞基III)中。按上述方法表達(dá)并純化“CDR-交換(swap)”后的蛋白。進(jìn)行結(jié)合研究來(lái)比較所述兩種蛋白。簡(jiǎn)言之，用溶于50mM碳酸緩沖液(pH9.6)中的1微克每毫升的ErbB2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD；按WO90/14357中所述方法制備)包被NUNC MAXISORPTM平板，4℃過(guò)夜，然后用ELISA稀釋劑(0.5％BSA，0.05聚山梨酸酯(polysorbate)20，PBS)在室溫下封閉1小時(shí)。將溶于ELISA稀釋劑中的一系列樣品稀釋液在平板上溫育2小時(shí)。洗滌之后，用生物素化鼠抗人κ抗體(ICN634771)，隨后用鏈親和素偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化酶(Sigma)檢測(cè)結(jié)合的Fab片段，以3，3’，5，5’，-四甲基聯(lián)苯胺(Kirkegaar和Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)作為底物。測(cè)定450nm處吸收值。如圖8A所示，在CDR-交換的人Fab片段的構(gòu)建體上，所有的結(jié)合均缺失。
為了恢復(fù)人源化Fab段的結(jié)合，利用源自CDR-交換的DNA作為模板構(gòu)建突變體。利用計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的模型(圖9)，設(shè)計(jì)這些突變，使改變后可能影響CDR構(gòu)象或抗體-抗原界面的人框架區(qū)殘基改變?yōu)樗鼈兊氖笤磳?duì)應(yīng)物。突變體見(jiàn)表2。
表2人源化2C4FR突變的設(shè)計(jì)
各種突變體的結(jié)合曲線見(jiàn)圖8A-C。人源化Fab段574(帶有ArgH71Val、AspH73Arg和IleH69Leu的改變)表明恢復(fù)了原始嵌合2C4 Fab段的結(jié)合。為了進(jìn)一步精煉或增加人源化抗體的結(jié)合，可修飾其它的FR和/或CDR殘基(如L2、L54、L55、L56、H35和/或H48)(例如如下取代IleL2Thr；ArgL54Leu；TyrL55Glu；ThrL56Ser；AspH35Ser；和ValH48Ile)?；蛘?或另外)，為了改善或精煉所述人源化抗體的親和力和/或其它生物學(xué)活性，可對(duì)其進(jìn)行親和力成熟(見(jiàn)上述)。
利用噬菌體展示方法，進(jìn)行人源化2C4抗體574的親和力成熟。簡(jiǎn)言之，將人源化2C4.574 Fab克隆到噬菌體展示載體中，作為geneIII融合蛋白。當(dāng)通過(guò)與M13KO7輔助噬菌體感染而誘導(dǎo)噬菌體顆粒時(shí)，該融合蛋白允許Fab在噬菌體尾纖維蛋白geneIII的N末端上展示(Baca等，生物學(xué)化學(xué)雜志27210678(1997))。
對(duì)上面鑒定的6個(gè)CDR中的每個(gè)CDR，單獨(dú)構(gòu)建文庫(kù)。在這些文庫(kù)中，利用含“NNS”’的寡核苷酸(oligo)作為密碼子，使CDR中用計(jì)算機(jī)模型確定為在與ErbB2結(jié)合中可能具有重要作用的氨基酸隨機(jī)化。然后針對(duì)包被在NUNC MAXISORPTM板上的ErbB2 ECD(用溶于含0.2％土溫20(MPBST)的PBS中的3％干牛奶代替所有的封閉液)篩選文庫(kù)。為了篩選親和力高于2C4.574的噬菌體，在第3、4和5輪篩選中，在洗滌期間加入可溶性ErbB2 ECD或可溶性Fab 2C4.574作為競(jìng)爭(zhēng)劑。洗滌時(shí)間延長(zhǎng)到室溫1小時(shí)。
5輪篩選之后，用噬菌體-ELISA法再一次分析單個(gè)克隆。在Costar 96-孔U形底組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)單個(gè)克隆，通過(guò)加入輔助噬菌體誘導(dǎo)該噬菌體。過(guò)夜培養(yǎng)之后，將大腸桿菌聚集成團(tuán)，并將含噬菌體的上清轉(zhuǎn)入96孔板而使所述噬菌體用MPBST在室溫下封閉1小時(shí)。按上述方法將ErbB2 ECD包被的NUNC MAXISORPTM板也用MBPST封閉。將封閉的噬菌體在平板上溫育2小時(shí)。洗滌之后，用在MPBST中1∶5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)型抗M13單克隆抗體(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.27-9421-01)檢測(cè)結(jié)合的噬菌體。以3，3’，5，5’，-四甲基聯(lián)苯胺作為底物。測(cè)定450nm處吸收值。
對(duì)每個(gè)文庫(kù)中給出最強(qiáng)信號(hào)的48個(gè)克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。將序列出現(xiàn)頻率最高的那些克隆亞克隆到上述允許表達(dá)可溶性Fab的載體中。對(duì)這些Fabs進(jìn)行誘導(dǎo)、蛋白純化，用上述的ELISA法分析純化的Fab的結(jié)合，并將該結(jié)合與起始的人源化2C4.574抗體的結(jié)合進(jìn)行比較。
在確定了單個(gè)CDR中目的突變之后，構(gòu)建另外的突變，其為這些突變的各種組合，并按上述方法進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)于574改善了結(jié)合力的突變體見(jiàn)表3。
表3來(lái)源于2C4.574親和力成熟的突變體的命名突變體名稱相對(duì)于574的改變突變體/574*H3.A1 serH99trp，metH34leu0.380L2.F5 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu 0.087H1.3.B3 thrH28gln，thrH30ser，metH34leu 0.572L3.G6 tyrL92pro，ileL93lys，metH34leu 0.569L3.G11tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly，metH34leu 0.561L3.29 tyrL92phe，tyrL96asn，metH34leu 0.552L3.36 tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro，metH34leu 0.215654 serL50trp，metH34leu0.176655 metH34ser 0.542659 serL50trp，metH34ser0.076L2.F5.H3.A1 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，serH99trp 0.175L3G6.H3.A1tyrL92pro，ileL93lys，metH34leu，serH99trp 0.218H1.3.B3.H3.A1 thrH28gln，thrH30ser，metH34leu，serH99trp 0.306L3.G11.H3.A1 tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly，metH34leu，serH99trp 0.248654.H3.A1 serL50trp，metH34leu，serH99trp 0.133654.L3.G6 serL50trp，metH34leu，tyrL92pro，ileL93lys 0.213654.L3.29 serL50trp，metH34leu，tyrL92phe，tyrL96asn 0.236654.L3.36 serL50trp，metH35leu，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro 0.141*在ErbB2-ECD ELISA中，給出標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間OD值所需要的突變體總量與給出標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間OD值所需要的574的總量之間的比率。數(shù)字小于1.0表明突變體比574更好地結(jié)合ErbB2。
已構(gòu)建了下述突變體，并且目前進(jìn)行評(píng)估659.L3.G6 serL50trp，metH34ser，tyrL92pro，ileL93lys659.L3.G11 serL50trp，metH34ser，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94gly659.L3.29 serL50trp，metH34ser，tyrL92phe，tyrL96asn659.L3.36 serL50trp，metH34ser，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96proL2F5.L3G6 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92pro，ileL93lysL2F5.L3G11 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94glyL2F5.L29 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92phe，tyrL96asnL2F5.L36 serL50trp，tyrL53gly，metH34leu，tyrL92phe，tyrL94leu.tyrL96proL2F5.L3G6.655 serL50trp，tyrL53gly，metH35ser，tyrL92pro，ileL93lysL2F5.L3G11.655 serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92ser，ileL93arg，tyrL94glyL2F5.L29.655 serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92phe，tyrL96asnL2F5.L36.655 serL50trp，tyrL53gly，metH34ser，tyrL92phe，tyrL94leu，tyrL96pro
下述突變體(由同源性掃描提示得到)目前正在被構(gòu)建678 thrH30ala679 thrH30ser680 lysH64arg681 leuH96val682 thrL97ala683 thrL97ser684 tyrL96phe685 tyrL96ala686 tyrL91phe687 thrL56ala688 glnL28ala689 glnL28glu在H34上優(yōu)選的氨基酸是甲硫氨酸。如果發(fā)現(xiàn)在此位置被氧化，可變?yōu)榱涟彼帷?br> 發(fā)現(xiàn)AsnH52和asnH53對(duì)于結(jié)合是強(qiáng)烈優(yōu)選的氨基酸。將這些殘基變?yōu)楸彼峄蛱於彼峥娠@著降低結(jié)合。
已制備包括人源化抗體574的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)和人IgG1重鏈恒定區(qū)的完整抗體(見(jiàn)美國(guó)專利5821337)。用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)制備所述完整抗體。該分子在本文中被稱為rhuMAb 2C4。
實(shí)施例4單克隆抗體2C4阻斷EGF、TGF-α或HRG介導(dǎo)的MAPK活化作用許多生長(zhǎng)因子受體通過(guò)促分裂原介導(dǎo)的蛋白激酶(MAPK)途徑傳遞信號(hào)。這些雙特異性激酶是信號(hào)傳導(dǎo)途徑中最終觸發(fā)腫瘤細(xì)胞分裂的關(guān)鍵終點(diǎn)之一。按下述方法估測(cè)單克隆抗體2C4或HERCEPTIN抑制MAPK的EGF、TGF-α或HRG活化作用的能力。
將MCF細(xì)胞(105細(xì)胞/孔)置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的含血清培養(yǎng)基中。第二天，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，并向各個(gè)孔中加入含0.1％血清的新鮮培養(yǎng)基。在下一天重復(fù)此過(guò)程，并在檢測(cè)之前，用無(wú)血清的結(jié)合緩沖液取代所述培養(yǎng)基(Jones等，生物學(xué)化學(xué)雜志27311667-74(1998)；Schaefer等，生物學(xué)化學(xué)雜志274859-66(1999))。使細(xì)胞在室溫下平衡，然后用0.5ml 200nMHERCEPTIN或單克隆抗體2C4溫育30分鐘。之后將細(xì)胞用1nM EGF、1nMTGF-α或0.2nM HRG處理15分鐘。吸出細(xì)胞培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，然后加入0.2ml含1％DTT的SDS-PAGE樣品緩沖液。按先前所述方法(Jones等，生物學(xué)化學(xué)雜志27311667-74(1998))，利用抗活性MAPK抗體(Promega)通過(guò)Western雜交估測(cè)MAPK活性。
如圖10所示，單克隆抗體2C4顯著地阻斷MAPK的EGF、TGF-α或HRG介導(dǎo)型活化作用，其程度大于HERCEPTIN。這些數(shù)據(jù)表明單克隆抗體2C4與ErbB2上用于結(jié)合EGFR或ErbB3的表面結(jié)合，因而阻止了信號(hào)傳遞受體復(fù)合物的形成。
單克隆抗體2C4還表明抑制heregulin(HGR)依賴性Akt活化作用。PI3激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化對(duì)于細(xì)胞存活是重要的(Carraway等，生物學(xué)化學(xué)雜志2707111-6(1995))。在腫瘤細(xì)胞中，PI3激酶活化在浸潤(rùn)表型中發(fā)揮作用(Tan等，癌癥研究591620-1625(1999))。存活途徑主要由絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT介導(dǎo)(Bos等，Trends Biochem Sci.20441-442(1995))。ErbB2和ErbB3或EGFR之間形成的復(fù)合物能分別應(yīng)答heregulin或EGF而起始這些途徑(Olayioye等，分子和細(xì)胞生物學(xué)185042-51(1998)；Karunagaran等，EMBO雜志15254-264(1996)；Krymskaya等，美國(guó)生理學(xué)雜志276L 246-55(1999))。用2C4溫育MCF7乳腺癌細(xì)胞可抑制heregulin介導(dǎo)的AKT活化作用。而且，加入2C4可進(jìn)一步降低在無(wú)heregulin加入的條件下存在的AKT活化的基本水平。這些數(shù)據(jù)表明2C4可抑制PI3激酶的ErbB配體活化，并且此抑制可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物毒性作用的更高的敏感性，可證實(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性增加。
因而，單克隆抗體2C4通過(guò)兩個(gè)主要信號(hào)傳遞途徑-MAP激酶(主要增殖途徑)和PI3激酶(主要存活/抗凋亡途徑)，抑制配體起始的ErbB信號(hào)傳導(dǎo)。
實(shí)施例5單克隆抗體2C4和HERCEPTIN在體內(nèi)的組合將用肺腺癌細(xì)胞系Calu-3建立的異體移植物模型，用于估測(cè)抗HER2單克隆抗體(單獨(dú)或聯(lián)合)抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。將0.1ml 2.0×106細(xì)胞接種于雌性NCR裸鼠皮下。每周測(cè)量腫瘤兩次，并且在腫瘤結(jié)節(jié)體積達(dá)到100mm3時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分為7個(gè)治療組。所述治療組是(a)對(duì)照單克隆抗體，MAb 1766；(b)HERCEPTIN，10mg/kg；
(c)單克隆抗體7C2，10mg/kg；(d)單克隆抗體2C4，10mg/kg；(e)HERCEPTIN和7C2，各10mg/kg；(f)HERCEPTIN和2C4，各10mg/kg；(g)單克隆抗體2C4和7C4，各10mg/kg。
每周對(duì)動(dòng)物處理兩次，直到第24天。每周測(cè)量腫瘤體積兩次，直到第38天。
如圖11中條圖所示，用2C4或HERCEPTIN治療Calu-3荷瘤小鼠，可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。HERCEPTIN和2C4或HERCEPTIN和7C2組合治療效果好于單獨(dú)給藥任一單克隆抗體。
實(shí)施例6用單克隆抗體2C4治療結(jié)直腸癌按Sheng等，J.Clin.Invest.992254-2259(1997)中所述方法，將人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCA-7、LS174T或CaCo-2等皮下接種于無(wú)胸腺裸鼠。一旦腫瘤體積達(dá)到約100mm3，用10-50mg/kg單克隆抗體2C4通過(guò)腹腔注射給藥各組動(dòng)物，每周兩次。單克隆抗體2C4在體內(nèi)抑制結(jié)直腸異體移植物的生長(zhǎng)。
實(shí)施例7用人源化抗體2C4治療乳腺癌用一項(xiàng)3日Alamar Blue檢測(cè)，估測(cè)了rhuMAb或HERCEPTIN對(duì)ErbB2不過(guò)度表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞的作用(Ahmed，S.A.免疫學(xué)方法雜志170211-224(1994)；和Page等，國(guó)際腫瘤學(xué)雜志3473-476(1996))。用于此檢測(cè)的細(xì)胞是ErbB2表達(dá)水平為1+的MDA-175人乳腺癌細(xì)胞。如圖12所示，與HERCEPTIN治療相比，加入rhuMAb 2C4以劑量依賴性方式顯著抑制乳腺癌細(xì)胞系MDA-175的生長(zhǎng)。
估測(cè)了rhuMAb 2C4抗MCF7異體移植物的效果，所述MCF7異體移植物為雌激素受體陽(yáng)性(ER+)并表達(dá)低水平ErbB2。使用了補(bǔ)充雌激素的雌性小鼠。rhuMAb 2C4以30mg/kg/周的劑量給藥。如圖13所示，rhuMAb 2C4可有效地抑制乳腺癌的體內(nèi)生長(zhǎng)，其中該乳腺癌的特點(diǎn)不是過(guò)度表達(dá)ErbB2。
實(shí)施例82C4的藥代動(dòng)力學(xué)、代謝和毒理學(xué)
rhuMAb 2C4在人血清中是穩(wěn)定的。在生物物質(zhì)中沒(méi)有觀察到復(fù)合物形成的跡象或聚集。在小鼠中rhuMAb 2C4的清除比HERCEPTIN快。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明每周給藥約2-6mg/kg rhuMAb將導(dǎo)致其血清濃度與按目前劑量給藥的HERCEPTIN相似。所得血清與2C4接觸將大大提高體外測(cè)定的IC50值。
在恒河猴(cynomolgus)中(每組中2雄性和2雌性)進(jìn)行毒理學(xué)研究。靜脈給藥0、10、50或100mg/kg的rhuMAb 2C4，每周兩次，給藥4周。毒理學(xué)研究中檢測(cè)體重(-2、-1周及其后每周)；食物消耗(定量，每日)；體檢并評(píng)估血壓、心電圖(ECG)和體溫(-2、-1周及第2和4周，該周第二次給藥后4小時(shí)(4 hours post-dose following that weeks second dose))等；心臟超聲檢測(cè)(第一周第一次給藥后，及研究的末期，第四周)；臨床病理學(xué)(基線水平和第2周及第4周末)；尿液分析(基線和第2周及第4周末)；抗體分析采樣(基線和第2周及第4周末)；以及尸檢和組織病理學(xué)分析。
所有組的全部動(dòng)物均存活到研究結(jié)束。沒(méi)有觀察到明顯的臨床癥狀或各組間的差異。尸檢結(jié)果表明任何動(dòng)物的器官中沒(méi)有顯著的大體(gross)異常。在任何動(dòng)物的組織中沒(méi)有觀察到顯著的鏡下異常。從本研究的開始到結(jié)束，沒(méi)有觀察到顯著的ECG變化。另外，在各組之間沒(méi)有見(jiàn)到差異。
實(shí)施例9劑量逐級(jí)提高(Escalation)向腫瘤患者給藥5個(gè)劑量水平(0.05、0.5、2.0、4.0或10mg/kg；每個(gè)劑量水平6個(gè)受試者)之一的首劑量的rhuMAb 2C4，隨后4周停藥(wash-out)。第5周，向患者給藥相同劑量，一周4次，隨后4周停藥。具有完全應(yīng)答、部分應(yīng)答或穩(wěn)定疾病的患者適合于進(jìn)一步研究。
實(shí)施例10復(fù)發(fā)性或不應(yīng)性轉(zhuǎn)移型前列腺癌的治療rhuMAb 2C4是針對(duì)ErbB2的全長(zhǎng)人源化單克隆抗體(由CHO細(xì)胞產(chǎn)生)。rhuMAb 2C4阻斷ErbB2與其它ErbB家族成員的結(jié)合，因而抑制細(xì)胞內(nèi)ErbB途徑的信號(hào)傳導(dǎo)。與HERCEPTIN相反，rhuMAb 2C4不但抑制ErbB2過(guò)度表達(dá)型腫瘤的生長(zhǎng)，還阻斷需要ErbB配體依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的腫瘤的生長(zhǎng)。
rhuMAb 2C4可作為治療激素不應(yīng)性(雄激素非依賴性)前列腺癌患者的單一藥物。效力的主要終點(diǎn)包括相對(duì)于提供最佳護(hù)理(米托蒽醌/潑尼松)(作為單一藥物)的總存活率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括疾病進(jìn)展時(shí)間，應(yīng)答率，生命質(zhì)量、疼痛和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展(progression)。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
rhuMAb 2C4還可與化療聯(lián)合用于治療激素不應(yīng)性(雄激素非依賴性)前列腺癌患者。效力的主要終點(diǎn)包括相對(duì)于化療的總存活率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括疾病進(jìn)展時(shí)間，應(yīng)答率，生命質(zhì)量、疼痛和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
可與抗ErbB2抗體(其阻斷ErbB2受體的配體活化作用)聯(lián)合治療前列腺癌(例如雄激素非依賴性前列腺癌)的藥物實(shí)例包括法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；抗血管生成藥(例如抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如C225或ZD1839)；另一抗ErbB2抗體(生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2抗體如HERCEPTIN等，或誘導(dǎo)凋亡的抗ErbB2抗體如7C2或7F3等，包括其人源化變體和/或親和力成熟變體)；細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；抗雄激素(如氟他胺或環(huán)丙孕酮乙酸酯)；亮丙瑞林；蘇拉明；化療藥如長(zhǎng)春新堿、雌莫司汀、米托蒽醌、liarozole(視黃酸代謝阻斷藥)、環(huán)磷酰胺、阿霉素等蒽環(huán)霉素類抗生素、紫杉烷(例如紫杉醇或紫杉萜)或氨甲蝶呤，或者上述藥物的任何組合，例如長(zhǎng)春新堿/雌莫司汀或環(huán)磷酰胺/阿霉素/氨甲蝶呤；潑尼松；氫化可的松；或其組合?？山o藥這些藥物的標(biāo)準(zhǔn)劑量，例如40mg/m2/wk紫杉萜(TAXOTERE)；6(AUC)卡鉑；和200mg/m2紫杉醇(TAXOL)。
實(shí)施例11轉(zhuǎn)移乳腺癌的治療rhuMAb 2C4可作為治療轉(zhuǎn)移型乳腺癌癌患者(其腫瘤并不過(guò)度表達(dá)ErbB2)的單一藥物。效力的主要終點(diǎn)包括應(yīng)答率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括總存活率，疾病進(jìn)展時(shí)間，生命質(zhì)量、和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
rhuMAb 2C4還可與化療聯(lián)合用于治療轉(zhuǎn)移型乳腺癌癌患者(其腫瘤并不過(guò)度表達(dá)ErbB2)。效力的主要終點(diǎn)包括相對(duì)于單獨(dú)使用化療的總存活率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括疾病進(jìn)展時(shí)間，應(yīng)答率，生命質(zhì)量、和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
可與抗ErbB2抗體(其阻斷ErbB2受體的配體活化作用)聯(lián)合用于治療乳腺癌(例如不以ErbB2過(guò)度表達(dá)為特征的轉(zhuǎn)移型乳腺癌)的藥物實(shí)例包括化療藥，如蒽環(huán)霉素類抗生素(例如阿霉素)、環(huán)磷酰胺、紫杉烷(例如紫杉醇或紫杉萜)、navelbine、xeloda、絲裂霉素C、鉑化合物、奧沙利鉑、吉西他濱，或這些藥物中兩種或更多種的組合，如阿霉素/環(huán)磷酰胺；另一抗ErbB2抗體(生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2抗體如HERCEPTIN等，或誘導(dǎo)凋亡的抗ErbB2抗體如7C2或7F3等，包括它們的人源化變體和/或親和力成熟變體)；抗雌激素(例如他莫昔芬)；法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；抗血管生成藥(例如抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如C225或ZD1839)；細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；或上述藥物的組合。可用這些附加藥物的標(biāo)準(zhǔn)劑量。
另外，rhuMAb 2C4還可與HERCEPTIN聯(lián)合用于治療轉(zhuǎn)移型乳腺癌癌患者(其腫瘤并不過(guò)度表達(dá)ErbB2)。效力的主要終點(diǎn)包括應(yīng)答率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括疾病進(jìn)展時(shí)間，相對(duì)于單獨(dú)使用HERCEPTIN的總存活率，生命質(zhì)量、和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。HERCEPTIN可靜脈內(nèi)給藥，第一劑為4mg/kg，其后每周維持劑量為2mg/kg。HERCEPTIN以凍干粉形式提供。每瓶HERCEPTIN含440mg HERCEPTIN、9.9mg鹽酸L-組氨酸、6.4mg L-組氨酸、400mgα-α-海藻糖二水合物、1.8mg聚山梨酸酯20。用20ml含1.1％苯甲醇(作為防腐劑)的注射用無(wú)菌水(BWFI)重建，產(chǎn)生含21mg/ml HERCEPTIN的21ml多劑量溶液(pH為約6.0)。
實(shí)施例12肺癌的治療rhuMAb 2C4可作為治療IIIb或IV期非小細(xì)胞肺癌的單一藥物。效力的主要終點(diǎn)包括應(yīng)答率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括總存活率，疾病進(jìn)展時(shí)間，生命質(zhì)量、和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
rhuMAb 2C4還可與化療聯(lián)合用于治療轉(zhuǎn)移型非小細(xì)胞肺癌。效力的主要終點(diǎn)包括相對(duì)于常規(guī)治療的總存活率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括疾病進(jìn)展時(shí)間，應(yīng)答率，生命質(zhì)量和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
可與抗ErbB2抗體(其阻斷ErbB受體的配體活化作用)聯(lián)合治療肺癌的藥物實(shí)例包括化療藥，如卡鉑、紫杉烷(例如紫杉醇或紫杉萜)、吉西他濱、navelbine、順鉑、奧沙利鉑，或這些藥物的任何組合，例如卡鉑/紫杉萜；另一抗ErbB2抗體(生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2抗體如HERCEPTIN等，或誘導(dǎo)凋亡的抗ErbB2抗體如7C2或7F3等，包括它們的人源化變體和/或親和力成熟變體)；法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；抗血管生成藥(例如抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如C225或ZD1839)；細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；或上述藥物的組合。
實(shí)施例13結(jié)直腸癌的治療rhuMAb 2C4可作為治療轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌的單體藥物。效力的主要終點(diǎn)包括應(yīng)答率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括總存活率，疾病進(jìn)展時(shí)間，生命質(zhì)量、和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
rhuMAb 2C4還可與化療聯(lián)合用于治療轉(zhuǎn)移型結(jié)直腸癌患者。效力的主要終點(diǎn)包括相對(duì)于常規(guī)治療的總存活率和安全性。效力的次要終點(diǎn)包括疾病進(jìn)展時(shí)間，應(yīng)答率，生命質(zhì)量和/或應(yīng)答持續(xù)時(shí)間。rhuMAb 2C4每周或每三周靜脈內(nèi)(IV)給藥，劑量分別為2或4mg/kg，直到疾病進(jìn)展。所述抗體以多劑液體劑型提供(20ml裝，濃度為20mg/ml或更高)。
可與抗ErbB2抗體(其阻斷ErbB受體的配體活化作用)聯(lián)合用于治療結(jié)直腸癌的化療藥物實(shí)例包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸(LV)、CPT-11、左旋咪唑，或這些藥物中兩種或多種的組合如5-FU/LV/CPT-11?？山o藥這些化療藥的標(biāo)準(zhǔn)劑量?？膳c抗ErbB2抗體聯(lián)合用于治療結(jié)直腸癌的其它藥物包括法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；抗血管生成藥(例如抗VEGF抗體)；EGFR靶向藥物(例如C225或ZD1839)；細(xì)胞因子(例如IL-2、IL-12、G-CSF或GM-CSF)；另一抗ErbB2抗體(生長(zhǎng)抑制性抗ErbB2抗體如HERCEPTIN等，或誘導(dǎo)凋亡的抗ErbB2抗體如7C2或7F3等，包括它們的人源化變體和/或親和力成熟變體)；或上述藥物的組合。
序列表<110>杰南技術(shù)公司(Genentech，Inc.)<120>人源化抗ErbB2抗體及用抗ErbB2抗體進(jìn)行的治療<130>P1467R2PCT.1<140>PCT/US00/17366<141>2000-06-23<150>US 60/141,316<151>1999-06-25<160>13<210>1<211>107<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>1Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val1 5 10 15Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser20 25 30Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp50 55 60Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile65 70 75Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu95 100 105Ile Lys<210>2<211>119<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>2Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly1 5 10 15Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr20 25 30Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu35 40 45Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr50 55 60Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser65 70 75Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr95 100 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110 115<210>3<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化VL序列<400>3Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val15 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser20 25 30Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105Ile Lys<210>4<211>119<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化VH序列<400> 4Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr20 25 30Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr50 55 60Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr95 100 105Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115<210>5<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>輕鏈共有序列<400>5Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val1 5 10 15Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser20 25 30Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys35 40 45Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln80 85 90Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu95 100 105Ile Lys<210>6<211>119<212>PRT<213>人工序列<220><223>重鏈共有序列<400> 6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu35 40 45Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr50 55 60Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser65 70 75Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp80 85 90Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu95 100105Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser110 115<210>7<211>10<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<220><221>不確定<222>10<223>未知氨基酸<400>7Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa15 10<210>8<211>17<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>8Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe1 5 10 15Lys Gly<210>9<211>10<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>9Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>10Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala1 5 10<210>11<211>7<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<220><221>不確定<222>5-7<223>未知氨基酸<400>11Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>鼠(Mus Musculus)<400>12Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr1 5<210>13<211>645<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400> 13Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp20 25 30Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met35 40 45Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu50 55 60Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln65 70 75Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln80 85 90Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr95 100105Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly110 115120Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly125 130135Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys140 145 150Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp155 160165Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala
170 175 180Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys185 190 195Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu200 205 210Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala215 220 225Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys230 235 240Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys245 250 255Leu His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala260 265 270Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro275280 285Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro290295 300Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys305310 315Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg320325 330Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu335340 345Gly Mer Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn350355 360Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala365370 375Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala380 385390Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu395 400405Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro410 415420Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile425 430435Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile440 445450Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu455 460465Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val470 475480Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His
485 490 495Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala500 505 510Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro515 520 525Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys530 535 540Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val545 550 555ASn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln560 565 570Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val575 580 585Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys590 595 600Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys605 610 615Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys620 625 630Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu635 640 64權(quán)利要求
1.在人體中治療癌癥的方法，其中所述癌癥表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，所述方法包括向人體給藥治療有效量的與ErbB2結(jié)合的抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體阻斷ErbB受體的配體活化作用。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體阻斷單克隆抗體2C4與ErbB2的結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥的特點(diǎn)是EGFR過(guò)度活化。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述癌癥過(guò)度表達(dá)ErbB配體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述ErbB配體是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體阻斷促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的TGF-α活化作用。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥不以過(guò)度表達(dá)ErbB2受體為特征。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥選自結(jié)腸癌、直腸癌和結(jié)直腸癌。
10.權(quán)利要求9的方法，其進(jìn)一步包括向人體給藥化療藥物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述化療藥物選自5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸(LV)、CPT-11和左旋咪唑。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是肺癌。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述癌癥是非小細(xì)胞肺癌。
14.權(quán)利要求12的方法，其進(jìn)一步包括向人體給藥化療藥。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述化療藥物選自紫杉烷、吉西他濱、新霉酰胺、順鉑、奧沙利鉑和卡鉑。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體具有單克隆抗體2C4的生物學(xué)特點(diǎn)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體包含單克隆抗體2C4或人源化2C4。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體是抗體片段。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體片段是Fab片段。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體不與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗體片段不與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)。
23.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括向人體給藥治療有效量的第二種治療藥物，該藥物選自與ErbB2結(jié)合的第二種不同抗體、化療藥物、靶向EGFR的藥物、抗血管生成藥物、抗激素化合物、心臟保護(hù)劑和細(xì)胞因子。
24.權(quán)利要求1的方法，包括向人體給藥至少一劑所述抗體，其量從約0.5mg/kg到約10mg/kg。
25.權(quán)利要求24的方法，包括約每周給藥所述劑量。
26.權(quán)利要求24的方法，包括約每3周給藥所述劑量。
27.在人體中治療癌癥的方法，其中所述癌癥不以ErbB2受體的過(guò)度表達(dá)為特征，所述方法包括向人體給藥治療有效量的與ErbB2結(jié)合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移性乳腺癌。
30.權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包括向人體給藥化療藥物。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述化療藥物選自蒽環(huán)霉素類抗生素、環(huán)磷酰胺、紫杉烷、新霉酰胺、xeloda、絲裂霉素C、奧沙利鉑、吉西他濱和鉑化合物。
32.在人體中治療癌癥的方法，包括向人體給藥治療有效量的(a)結(jié)合ErbB2并抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌生長(zhǎng)的第一種抗體；(b)結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二種抗體。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一種抗體包括單克隆抗體4D5或人源化4D5，而所述第二種抗體包括單克隆抗體2C4或人源化2C4。
34.在人體中治療癌癥的方法，其中所述癌癥選自結(jié)腸癌、直腸癌和結(jié)腸直腸癌，所述方法包括向人體給藥治療有效量的能結(jié)合ErbB2并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體。
35.一種包括容器和其中組合物的產(chǎn)品，其中所述組合物包括結(jié)合ErbB2的抗體，該產(chǎn)品還包括包裝插頁(yè)，其說(shuō)明所述組合物可用于治療表達(dá)生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的癌癥。
36.一種包括容器和其中組合物的產(chǎn)品，其中所述組合物包括與ErbB2結(jié)合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，該產(chǎn)品還包括包裝插頁(yè)，其說(shuō)明所述組合物可用于治療癌癥，其中所述癌癥的特點(diǎn)不是ErbB2受體的過(guò)度表達(dá)。
37.一種產(chǎn)品，其包括(a)第一個(gè)容器，其中含組合物，該組合物包括與ErbB2結(jié)合并抑制過(guò)度表達(dá)ErbB2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的第一種抗體；(b)第二個(gè)容器，其中包含組合物，該組合物包括能與ErbB2結(jié)合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的第二種抗體。
38.權(quán)利要求37的產(chǎn)品，進(jìn)一步包括一種包裝插頁(yè)，其說(shuō)明所述第一和第二種抗體組合物可用于治療癌癥。
39.一種產(chǎn)品，其包括一種容器和其中所含組合物，其中所述組合物包括與ErbB2結(jié)合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的抗體，該產(chǎn)品還包括一種包裝插頁(yè)，其說(shuō)明所述組合物可用于治療選自結(jié)腸癌、直腸癌和結(jié)腸直腸癌的癌癥。
40.與ErbB2結(jié)合并阻斷ErbB受體的配體活化作用的人源化抗體。
41.權(quán)利要求40的人源化抗體，其基本上以與鼠單克隆抗體2C4等效的能力結(jié)合ErbB2。
42.包括重鏈可變區(qū)(VH)的權(quán)利要求40所述人源化抗體，其中已將非人類超變區(qū)殘基引入到人VH區(qū)中，并且進(jìn)一步包括在選自69H、71H和73H的位點(diǎn)上的框架區(qū)(FR)取代，這里利用Kabat提出的編號(hào)系統(tǒng)(1991)。
43.權(quán)利要求42所述人源化抗體，其在位點(diǎn)69H、71H和73H上包含F(xiàn)R取代。
44.權(quán)利要求40所述人源化抗體，其包括VH互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基GFTFTDYTMX(SEQ ID NO7)、DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO8)和NLGPSFYFDY(SEQ ID NO9)。
45.權(quán)利要求40所述人源化抗體，其包括SEQ ID NO4中的VH區(qū)氨基酸序列。
46.權(quán)利要求40所述人源化抗體，其包括VL互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO10)、SASYXXX(SEQ ID NO11)和QQYYIYPYT(SEQ ID NO12)。
47.權(quán)利要求40所述人源化抗體，其包括SEQ ID NO3中的VL區(qū)氨基酸序列。
48.權(quán)利要求40所述人源化抗體，其為完整的IgG1抗體。
49.權(quán)利要求40所述人源化抗體，其為抗體片段。
50.權(quán)利要求49所述人源化抗體，其為Fab片段。
51.一種親和力成熟的抗體，其與ErbB2結(jié)合并阻斷ErbB受體的配體活化作用。
52.一種組合物，其包括權(quán)利要求40所述人源化抗體和一種可藥用載體。
53.一種免疫偶聯(lián)物，其包括與細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)的權(quán)利要求40所述人源化抗體。
54.分離的編碼權(quán)利要求40所述人源化抗體的核酸。
55.包括權(quán)利要求54所述核酸的載體。
56.包括權(quán)利要求55所述載體的宿主細(xì)胞。
57.制備人源化抗體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求56所述宿主細(xì)胞，從而使所述核酸表達(dá)。
58.權(quán)利要求57所述方法，其進(jìn)一步包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)中回收所述人源化抗體。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述人源化抗體是從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中回收。
全文摘要
本申請(qǐng)描述了人源化抗ErbB2抗體,以及用抗ErbB2抗體,如人源化抗ErbB2抗體治療癌癥的方法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1370082SQ00811898
公開日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月25日
發(fā)明者卡梅利亞·W·亞當(dāng)斯, 倫納德·G·普雷斯塔, 馬克·斯利科斯基 申請(qǐng)人:杰南技術(shù)公司