專利名稱：一種人hnrpa0多肽及其抗體制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種多肽及其抗體制備方法，這種抗體主要用于天然蛋白抗原的檢 測。
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背景技術(shù)：
DHNRPA0功能=HNRPAO蛋白屬于廣泛表達的核不均一核糖核蛋白的A/B亞家族。 核不均一核糖核蛋白是RNA結(jié)合蛋白，他們與核不均一核RNA形成復合物。在細胞核中， 這些蛋白與mRNA前體密切相關，參與了 mRNA前體的加工過程，以及mRNA代謝和轉(zhuǎn)運等其 他方面。雖然所有的核不均一核糖核蛋白都是細胞核中發(fā)現(xiàn)的，但是其中有些蛋白卻可以 同時分布在細胞核和細胞質(zhì)中。核不均一核糖核蛋白家族蛋白成員具有不同的核酸結(jié)合特 性。HNRPAO基因編碼的蛋白有兩個類似于RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域RRM的重復序列，C末端富含甘 氨酸。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制SAPK2a/p38復合物可以阻斷HNRPAO被MAPKAP-K2磷酸化以及細 胞因子 mRNA 和 HNRPAO 的結(jié)合(EMB0T. 2002 Dec 2 ；21 (23) 6505-14)。2)HNRPAO抗體產(chǎn)品信息經(jīng)檢索，市場上有Anti-HNRPAO多克隆抗體產(chǎn)品，但是相 關此抗體產(chǎn)品不能應用于免疫組織化學實驗檢測中。3) HNRPAO抗體的應用利用一項蛋白質(zhì)組學技術(shù)-鳥槍質(zhì)譜法(shotgun mass spectrometry)分析 發(fā)現(xiàn)，這個蛋白在精神分裂癥患者的背外側(cè)額前葉皮層中發(fā)生了差異性表達(Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 2009Apr ；259 (3) :151_63)。這項研究提示我們，HNRPAO 作為 一個重要的潛在標志物，對闡明精神分裂癥這項復雜疾病的發(fā)病機制有重要意義。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種HNRPAO多肽，其序列為PKEDIYSGGGGGGS。用此多肽制備的抗 HNRPAO抗體可以在免疫印跡(Western blot)及免疫組化(IHC)分析中特異識別組織或細 胞中的天然HNRPAO蛋白?？笻NRPAO抗體是通過以下步驟獲得的步驟一多肽序列的分析和設計利用DNAstar軟件對HNRPAO蛋白的氨基酸序列 進行抗原表位分析，主要評估親水性，抗原性，表面可能性，柔性區(qū)等指數(shù)，再結(jié)合過去制備 抗體的實際經(jīng)驗，最終確定HNRPAO蛋白175-188位14個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列， 序列為 PKEDIYSGGGGGGS。步驟二 多肽合成和交聯(lián)采用ACT396全自動多通道多肽合成儀合成目的多 肽，并采用質(zhì)譜進行鑒定；為增強多肽的抗原性，將HNRPAO多肽與載體蛋白KLH采用 Sulfo-SMCC交聯(lián)法進行交聯(lián)。步驟三多肽免疫和抗血清制備將交聯(lián)后的HNRPA0-KLH與弗氏佐劑混合乳化， 在新西蘭兔背部進行皮內(nèi)注射免疫，并反復加強免疫，至取血檢測抗體效價達到標準時停 止免疫。
步驟四抗體純化實驗兔抗體效價達到標準后，采用心臟取血，分離抗血清，采 用Protein A純化全抗體后，進一步采用肽親和純化，得到目標抗體?？笻NRPAO抗體是通過以下步驟鑒定的步驟一免疫印跡將所獲得的HNRPAO抗體作為一抗，采用標準的免疫印跡方法， 確認該抗體能夠與變性后的天然HNRPAO蛋白相互作用，可用于免疫印跡試驗。步驟二 免疫組化將所獲得的HNRPAO抗體作為一抗，采用標準的免疫組化方法， 用于檢測組織芯片(9種胎兒組織)，確認該抗體能夠與具有天然結(jié)構(gòu)的HNRPAO蛋白相互作 用，可用于免疫組化試驗。
4.


圖1為WB圖，圖中免疫印記的目的條帶為36kDa，與HNRPAO蛋白的理論分子量基
本一致。
圖2為IHC圖，圖中箭頭所指位置為抗體反應的陽性信號。 5.
具體實施例方式1.多肽序列的分析和設計利用DNAstar軟件對HNRPAO蛋白的氨基酸序列進行抗原表位分析，主要評估親 水性，抗原性，表面可能性，柔性區(qū)等指數(shù)，再結(jié)合過去制備抗體的實際經(jīng)驗，考慮氨基酸結(jié) 構(gòu)復雜程度，易氧化程度，合成難度，氨基酸類別和分布等，最終確定HNRPAO蛋白175-188 位14個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列為DSRSEAEAAKNALN。同時，為保證后期多 肽交聯(lián)載體蛋白以及肽親和純化，在N末端增加一個半胱氨酸C，最終待合成多肽序列為 C-PKEDIYSGGGGGGS。2.多肽合成和交聯(lián)采用ACT396全自動多通道多肽合成儀，按照編制好的程序自動合成目的多肽，將 合成后的多肽溶于50 %乙腈，采用質(zhì)譜儀進行鑒定，確認所獲得的多肽為目的多肽。采用 Sulfo-SMCC作為交聯(lián)劑將載體蛋白KLH與合成多肽進行交聯(lián)取IOmg KLH溶于0. 5ml超 純水中；取3mgsulfo-SMCC溶于0. 5ml超純水中，用3M NaOH調(diào)pH值7左右。在混勻情況 下，把sulfo-SMCC溶液逐滴緩慢加入KLH溶液中，室溫下旋轉(zhuǎn)混勻反應物30min。將反應 好的sulfo-SMCC/KLH混合液上樣到預先用平衡緩沖液(0. 05M PB, pH6. 0)平衡過30min 的S印hadex G25柱中，收集淺灰色洗脫液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS (pH7. 3)溶解待2mg交聯(lián)多肽，把0. 2體積的sulfo-SMCC/KLH復合物溶液加入到多肽溶 液中，調(diào)PH值到7. 3，室溫振搖4小時，-70°C冷凍后，用凍干機凍干24小時后備用。通過 Ellman法檢測交聯(lián)前后多肽巰基確定多肽交聯(lián)效率。3.多肽免疫和抗血清制備將交聯(lián)好的KLH-多肽400 μ g溶于400 μ 1磷酸緩沖液(0. OlM PBS)中，加入等體 積弗氏完全佐劑充分乳化(至在水中不擴散為準)。采用兔齡3個月，體重1.75-2. 25Kg的 健康新西蘭兔進行免疫，進行背部皮內(nèi)注射免疫，至少要注射20點以上。首次免疫3周后， 將300 μ g多肽溶于300 μ 1磷酸緩沖液(0. 01MPBS)中，與等量的弗氏不完全佐劑充分乳化 后進行皮內(nèi)免疫，作為第一次加強免疫，要求背部皮內(nèi)注射免疫，至少要注射15點以上。第 二次免疫3周后，進行第二次加強免疫，方法和要求同第一次加強免疫。1周后，采用耳緣靜脈微量取血，用未交聯(lián)的合成多肽包被酶標板，間接ELISA法檢測免疫血清效價。重復加 強免疫和效價測定，直至血清效價達到1 10000以上，采用心臟取血，標準方法獲得抗血清。4.抗體親和純化(1) ,TIgG 純化用移液器將 50% 的 Protein-A Sepharose 混懸液 IOml 加到 30ml 層析柱中，去掉頂蓋和底帽，液體流出后的柱床體積即為5ml，然后用25ml去離了水沖洗 3遍。取出對應的血清10ml，與2ml PBS混合后加入30ml層析柱中，旋轉(zhuǎn)混合器上室溫 (20-250C )混旋1小時，讓血清樣品流出。再用15ml純化洗液洗層析柱3次，加入IOml洗 脫液進行洗脫。(2)、肽親和純化在層析柱中加入Iml Sulfo-Iink凝膠懸液(0. 5ml凝膠)，待柱 內(nèi)液體流干，用4ml偶聯(lián)緩沖液沖洗層析柱。用Iml偶聯(lián)緩沖液溶解合成的HNRPAO多肽， 并加入層析柱，再加入Iml偶聯(lián)緩沖液至層析柱中，室溫顛倒混勻1小時。用6ml偶聯(lián)緩沖 液沖洗層析柱，然后加入3ml封閉液，室溫混勻1小時。沖洗層析柱3次，然后向?qū)游鲋鶅?nèi) 加入6ml IgG及3ml PBS,室溫顛倒混勻1小時。用PBS沖洗層析柱3次，然后用2ml洗脫 液洗脫。將所獲得的純化抗體裝入透析袋內(nèi)4°C透析。透析過夜，然后4000rpmX35min離 心除沉淀，收集上清。用間接ELISA法測定抗體效價并用Bradford法測定蛋白濃度。HNRPAO抗體是通過以下步驟鑒定的1.免疫印跡分析按照標準方法配制SDS-PAGE凝膠，將5μ 1蛋白濃度為5mg/ml的細胞或者組織裂 解液依次加樣，恒壓80V約30分鐘，待樣品跑過濃縮膠基本呈一條直線時，改換160V電壓， 電泳至溴酚藍指示劑完全跑出分離膠(約60分鐘)時終止電泳，采用電轉(zhuǎn)膜方法恒壓100V 電轉(zhuǎn)80分鐘轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。將所獲得的HNRPAO抗體作為一抗，采用濃度為0. 625 μ g/ml 與上述轉(zhuǎn)膜得到的抗原芯片在室溫下雜交1小時，然后用HRP標記的羊抗兔抗體在室溫下 雜交1小時，采用ECL顯色法進行顯色，在暗室中用X片進行顯色和曝光，得到免疫印跡結(jié)^ ο2.免疫組織化學分析將4%甲醛溶液固定的組織切成1. 5mmX 1. 5mmX2. 0-3. Omm的組織塊，乙醇梯度 脫水后二甲苯透明30分鐘，62°C石蠟浸蠟2小時后，在組織包埋機上將9種組織按照3X3 的排列方式用石蠟進行包埋。采用標準石蠟切片方法將切好的4-5 μ m厚的組織芯片蠟片 貼附于APES處理過的載玻片上，在烤片機60°C烤片1小時，然后在烤箱中60°C烤片6小 時。采用標準免疫組化方法，室溫下用100 μ 1 10%羊血清于濕盒中封閉切片30分鐘，加 入100 μ 1濃度為4-8 μ g/ml的HNRPAO抗體，濕盒中4°C過夜，PBS清洗后加入生物素標記 羊抗兔IgG于濕盒中37°C孵育30分鐘，然后PBS清洗后加入HRP標記的鏈霉卵白素濃縮 液，濕盒中37°C孵育30分鐘，洗片后1%DAB顯色，蘇木素復染，復藍，脫水，透明，封片，鏡 檢，檢查結(jié)果并拍照。
序列表
PKEDIYSGGGGGGS
權(quán)利要求
一種人HNRPA0多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為PKEDIYSGGGGGGS
2.一種抗人HNRPAO多肽的抗體制備方法，其特征在于按權(quán)力要求1所述序列合成中部 修飾肽，將合成的中部修飾肽與載體蛋白交聯(lián)，用交聯(lián)的肽免疫動物，取免疫動物的血制備 抗血清，從血清中分離純化IgG。
3.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于N端修飾為在序列N端增加一個 半胱氨酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于載體蛋白為匙孔血藍蛋白(KLH) 或牛血清白蛋白(BSA)。
5.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于中部修飾肽通過交聯(lián)劑將其巰基 與載體蛋白氨基共價交聯(lián)。
6.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于交聯(lián)肽與免疫佐劑混合乳化后， 在兔背部通過多點皮下注射，并經(jīng)二次以上加強免疫，血清的效價大于1 10000。
7.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于經(jīng)過硫酸銨沉淀、蛋白A親和純化 以及肽親和純化可以從抗血清中獲得高純度的IgG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種序列中部特異的人HNRPA0多肽以及抗體的制備方法，屬于以抗體為特征的體外實驗用的生物制品。N端特異的人HNRPA0多肽的氨基酸序列為PKEDIYSGGGGGGS?？谷薍NRPA0多肽抗體按以下方法制備(1)人HNRPA0抗原表位分析；(2)人HNRPA0表位多肽合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗人HNRPA0多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人HNRPA0多肽抗體。本發(fā)明制備的序列中部特異的抗人HNRPA0合成多肽抗體效價高、親和力強、特異性好，可與天然人HNRPA0發(fā)生特異性結(jié)合反應；制備成本低；純化后的抗體可以用于免疫印跡和免疫組化。該抗體為HNRPA0蛋白的基礎研究，比如對HNRPA0的特性、功能、表達譜和含量的分析，及其相關疾病的研究提供了一個重要的工具。
文檔編號C07K7/08GK101928332SQ20091013656
公開日2010年12月29日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者張虎生, 江虹, 田睿, 石春林, 茹莉莉, 薛沿寧 申請人:北京奧維亞生物技術(shù)有限公司