一種芒草wrky轉(zhuǎn)錄因子在提高植物纖維生物量中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及芒草WRKY類轉(zhuǎn)錄因子MlWRKYl2及其編碼基因與應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]芒草(Miscanthus)是一類具有根狀莖的多年生C4植物，多分布于熱帶至亞洲的東南部，是一種開發(fā)潛力巨大的纖維類能源植物，南荻(M.1utar1riparia)是我國(guó)特有的、在長(zhǎng)江流域廣泛分布的高生物產(chǎn)量纖維型多年生能源植物，具有重要的用途，其基因組序列與甜高粱具有較高的序列相似性。
[0003]植物的次生細(xì)胞壁是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的重要來源，它們也為人類生存提供織物、木材和潛在的第二代生物能源。參與細(xì)胞壁(即纖維素、半纖維素和木質(zhì)素)合成的NAC和MYB轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中都有深入研究，近來發(fā)現(xiàn)的擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子被證明參與髓薄壁細(xì)胞的次生細(xì)胞壁形成相關(guān)，可顯著提高植物生物量。WRKY類蛋白共同特點(diǎn)是至少含有一個(gè)高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域(WRKYGQK)和C2H2或C2HC的鋅指結(jié)構(gòu)。這類蛋白的WRKY結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的W盒(T)TGACC(A/T)核苷酸序列而調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，發(fā)揮其重要的生物學(xué)功能。研究表明，WRKY蛋白參與植物病菌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物衰老、生長(zhǎng)發(fā)育和非生物逆境等眾多生理過程。
[0004]植物開花是高等植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變過程，是個(gè)體發(fā)育和后代繁衍的中心環(huán)節(jié)。這一發(fā)育的轉(zhuǎn)變是植物體自身的發(fā)育條件和外部環(huán)境因素共同決定的。此外，開花時(shí)間是在提高生物能源作物的一個(gè)重要特征，因?yàn)檠舆t開花可以增加營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間，從而達(dá)到提高纖維生物質(zhì)產(chǎn)量的潛力。
[0005]目前對(duì)芒草WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究尚處于空白，特別是對(duì)其調(diào)控的遺傳和分子機(jī)制還幾乎一無所知。借助擬南芥模式體系，挖掘芒草WRKY家族中調(diào)節(jié)植物細(xì)胞壁增厚及調(diào)控植物花期的重要基因資源，對(duì)于植物的遺傳改良上具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供芒草轉(zhuǎn)錄因子#7rMT7J?基因的序列及功能，并進(jìn)一步公開了該基因的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所提供的芒草WRKY類轉(zhuǎn)錄因子，命名為M1WRKY12,來源于芒屬植物南荻(.Miscanthus 7wiar1ri/7ariw5.),是具有下述(I)至(3)中任一項(xiàng)所述的核苷酸序列:
(O具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列；
(2)具有編碼序列表中SEQID N0.2的蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
(3)具有與序列表中SEQID N0.1的DNA序列較高同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
(4)其中，序列表中的SEQID N0.1由702個(gè)堿基組成，編碼一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼具有序列表SEQ ID N0.2的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。上述編碼基因均具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列。
[0008]上述芒草WRKY轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因MlWRKYl2為如下(I)至(3)是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì):
(O由序列表中的SEQ ID N0.2氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；
(2)將序列表中的SEQID N0.1氨基酸殘基序列經(jīng)過一至多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而形成的具有同等功能的衍生蛋白質(zhì)；
(3)其中，序列表中的SEQID N0.2由233個(gè)氨基酸殘基組成。
[0009]同時(shí)，本發(fā)明還包含上述芒草WRKY轉(zhuǎn)錄因子在改變植物生物量、調(diào)控植物開花中的應(yīng)用，及含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因植株、重組菌及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]擴(kuò)增M/zmrn之中任一片段的引物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011]本發(fā)明還包括所述植物轉(zhuǎn)錄因子蛋白的亞細(xì)胞定位分析。
[0012]本發(fā)明還包括所述植物轉(zhuǎn)錄因子蛋白的應(yīng)用，包括將含有所述的WRKY蛋白的編碼基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥等其他植物，增強(qiáng)或抑制WRKY蛋白的表達(dá)從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞壁的組成，提高或降低生物量，調(diào)控開花時(shí)間等。
【附圖說明】
[0013]圖1 MlWRKYl2與其他物種WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子保守區(qū)的氨基酸序列同源性比對(duì)。
[0014]圖2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對(duì)后的進(jìn)化樹。
[0015]圖3 M1WRKY12蛋白亞細(xì)胞定位圖。
[0016]圖4 M1VRKY12的表達(dá)模式分析。
[0017]圖5 MlWRKYl2恢復(fù)擬南芥J tVRKY12的突變表型。
[0018]圖6 MlWRKYl2促進(jìn)擬南芥早花現(xiàn)象。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。
[0020]本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0021 ] 實(shí)施例1芒草WRKY家族基因MlWRKYl2的獲得。
[0022]取在14h L/1Oh D光照、溫度25°C、相對(duì)濕度60%的條件下培養(yǎng)4周左右的芒草莖段進(jìn)行基因的克隆分離。利用Trizol法提取其總RNA，利用RT-PCR技術(shù)從芒草中分離
之基因的cNDA，其編碼氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0023]本實(shí)施例設(shè)計(jì)的擴(kuò)增芒草#7rMT7J?基因核心片段的特異性引物為:
正向引物:5’-ATGGAGGGAGGCCAGTTGAG-3’ (SEQ ID N0.3)
反向引物:5’-TCAGAAGGAGCTGAAGCAATC-3’ (SEQ ID N0.4)。
[0024]PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞并測(cè)序。
[0025]實(shí)施例2之基因序列分析。
[0026]MlWRKYl2基因⑶S序列包含702個(gè)核苷酸序列和233個(gè)氨基酸序列，預(yù)測(cè)其分子量為25.7kDa,用DNAMAN軟件分析了 M1WRKY12與其他擬南芥WRKY家族蛋白的同源性。分析結(jié)果表明#7rM77J?具有典型保守的C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)修飾(圖1)。使用MEGA軟件建立了 MlWRKYl2同其它WRKY家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表明MlWRKYl2屬于WRKY-1Ic亞家族，與甜高粱Sb04g033240、穗短柄草&/厥《77￥，水稻flsrMOh擬南芥FMTZJ的親緣關(guān)系最近。圖2展不#7腸?Τ/J?蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。
[0027]實(shí)施例3麗/厥《77之基因的亞細(xì)胞定位。
[0028]將去掉終止密碼子的的的開放閱讀框(ORF)與pB7FWG2載體進(jìn)行連接，構(gòu)建與GFP相融合的載體，進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)基因，對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分析，表明該基因主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，如圖3所示。
[0029]實(shí)施例4 M1WRKY12的表達(dá)模式分析。
[0030]在芒草盛花期，取其根〈root〉、地下莖〈Rhizome〉、基部莖〈stem(B) >、莖尖〈stem(U)〉、葉片〈leaf〉、葉鞘〈sheath〉、花序〈inflorescence〉等進(jìn)行表達(dá)模式分析。利用Trizol法分別提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA。利用qRT-PCR方法檢測(cè)芒草
基因在這七個(gè)組織中的表達(dá)情況。基因用作為內(nèi)參。如圖4所示，結(jié)果表明，基因在地下莖和莖中的表達(dá)量較高。
[0031]本實(shí)施例設(shè)計(jì)的qRT-PCR基因核心片段的特異性引物為:
正向引物:5’-CGTGGATGTACTGGATGATGG-3’ (SEQ ID N0.5),
反向引物:5’-CGGAAATAGCTCCTTGGGTG-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0032]本實(shí)施例設(shè)計(jì)的基因核心片段的特異性引物為:
正向引物:5’-TGACAGAAGCACCACTAAACCC-3’ (SEQ ID N0.7),
反向引物:5’-CCTGGATGGCGACATACATT-3’ (SEQ ID N0.8)。
[0033]實(shí)施例5芒草基因過表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0034]先將芒草#7柳沿7之基因全長(zhǎng)cDNA連接到pGWC_T載體中，測(cè)序正確后，通過基因重組將其插入到Gateway載體pH2GW7中，從而得到含有#7rMT7J?基因的植物過表達(dá)載體。
[0035]實(shí)施例6在擬南芥的突變體中過量表達(dá)#7rMT7J?基因，恢復(fù)突變表型在擬南芥中基因缺失突變體表現(xiàn)為髓細(xì)胞壁增厚，將基因轉(zhuǎn)化到擬南芥的突變體中。根據(jù)基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化到突變體中飽M1WRKY12基因使髓細(xì)胞壁增厚并恢復(fù)到了野生型的水平，證明了 MlWRKYl2基因的生物學(xué)功能為與髓細(xì)胞壁加厚有關(guān)，確認(rèn)了該基因即為與髓細(xì)胞壁形成相關(guān)的基因。
[0036]利用石蠟切片觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥莖部次生壁的發(fā)育情況。具體步驟為:(I)材料的選取及固定:利用鋒利刀片取植株0.2cm左右莖段，置于4%多聚甲醛固定液中真空抽氣2h,直到材料沉于管底，4°C過夜。(2)脫水及透明:1倍PBS清洗一次，乙醇梯度脫水后，利用無水乙醇(A)和二甲苯(B)分別按照4作=3/1^作=1/1^作=1/3，8，8的比例滲透，每步Ih0 (3)浸蠟及包埋:利用二甲苯(B)和石蠟(C)按照8/0=3/1，8/^=1/1，8/^=1/3，(:，(:，〇的比例浸蠟，每步3h，62°C烘箱中進(jìn)行。(4)切片、展片及烘片:利用LeicaRM2235切片機(jī)(Leica公司)將材料切成8 μ m的薄片，置于42°C水浴鍋中展片f 2min，使之吸附于世泰REF188105粘附載玻片(世泰公司)上，37°C烘片2天。(5)脫蠟、二甲苯及染色:將附著有材料的載玻片置于二甲苯中脫蠟5min后，經(jīng)A(無水乙醇)/B (二甲苯)=1/1，A, A, 95%A, 85%A, 75%A, 50%A, 30%A梯度脫于水中，最后在0.5% TBO染液中染色15s。(7)脫水及封片:將清水洗過的玻片依次在30%A，50%A, 75%A, 85%A, 95%A, A, A, B, B中脫水至二甲苯中，每步30s，隨后利用加拿大樹膠將其封存。(8)切片的觀察:利用OLYMPUS DX51光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)進(jìn)行觀察，拍照，如圖5所示。
[0037]實(shí)施例7在植物中過量表達(dá)#7rMT7J?基因，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株提前開花。
[0038]在#7rMT7J?的超表達(dá)植株中，植株表現(xiàn)出早花現(xiàn)象。進(jìn)一步豐富了人們研究植物春化作用機(jī)理和成花過程的手段和內(nèi)容，同時(shí)對(duì)于完善和推進(jìn)植物春化作用機(jī)理的研究有著重要的意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.芒草WRKY類轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)cDNA，其特征在于: (1)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列； (2)SEQID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列。2.權(quán)利要求1所述芒草WRKY類轉(zhuǎn)錄因子#7腸《77之基因全長(zhǎng)cDNA編碼的WRKY蛋白，其特征在于: (1)SEQID N0.2所示的氨基酸序列序列； (2)SEQID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而形成的具有同等功能的蛋白序列。3.含有權(quán)利要求1所述的芒草WRKY類轉(zhuǎn)錄因子#7rMT7J?基因的植物表達(dá)載體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體是將所述的WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因M1WRKY12插入雙元表達(dá)載體PB2GW7所得。5.含有權(quán)利要求1所述的芒草WRKY轉(zhuǎn)職子MlWRKYl2基因的亞細(xì)胞定位重組載體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的亞細(xì)胞定位載體，其特征在于所述的表達(dá)載體是將所述的WRKY轉(zhuǎn)錄浪子Μ1.ΚΥ12的CDS序列去掉終止密碼子插入表達(dá)載體pB7FWG2所得。7.芒草MlWRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因#7厥《77之的基因工程應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的芒草WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因M1WRKY12在通過基因工程手段改變植物細(xì)胞壁的組成結(jié)構(gòu)及調(diào)控開花時(shí)間，培育植物新品種中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從芒草（Miscanthus）中分離克隆得到的MIWRKY12基因與植物薄壁細(xì)胞增厚及開花調(diào)控相關(guān)的應(yīng)用。其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本發(fā)明可為提高植物生物量及調(diào)控植物花期提供可行方法。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29
【公開號(hào)】CN104975028
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410125344
【發(fā)明人】周功克, 賀郭, 于延沖, 胡瑞波, 王華美, 曹英萍, 付春祥
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2014年4月1日