鑒定或輔助鑒定小麥抗寒性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鑒定或輔助鑒定冬小麥抗寒性的方法。本發(fā)明提供了用于鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒的引物組合物，由單獨使用的引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8和引物對9組成；本發(fā)明的實驗證明，根據(jù)5A、5B和5D三個染色體上的Vrn1基因的顯隱性來判斷小麥是否抗寒，可在實驗室快速測定黃淮和北部冬麥區(qū)小麥品種的抗寒性，避免因使用不抗寒的品種在小麥生產(chǎn)上導致的冬季凍害損失。
【專利說明】鑒定或輔助鑒定小麥抗寒性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及鑒定或輔助鑒定小麥抗寒性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 嚴重影響小麥生產(chǎn)的低溫凍害分冬季凍害和春季凍害（冷害）兩大類。小麥春季 凍害難以預(yù)測，在花粉母細胞減數(shù)分裂期，曾有溫度僅降至6°C也發(fā)生嚴重不結(jié)實的記錄， 品種間對春季凍害的反應(yīng)差異不明顯，只是不同品種受凍后的恢復速度與恢復程度存在明 顯差異，在生產(chǎn)上主要通過栽培技術(shù)措施加以預(yù)防和補救。但小麥品種對冬季凍害的抗性 (稱為抗寒性或越冬性），品種間有明顯差異，生產(chǎn)上可以通過培育新品種的抗寒性加以預(yù) 防。
[0003] 小麥因?qū)囟雀叩秃腿照臻L短的反應(yīng)以及生長發(fā)育快慢程度的不同被分為冬性、 弱（半）冬性和春性品種。其中對溫度的反應(yīng)被稱為春化反應(yīng)，是小麥對寒冬條件的一種 適應(yīng)，它在幼穗發(fā)育前要求有一定時間的低溫，客觀上使這個對外部條件敏感的發(fā)育過程 延遲到春季溫度上升時才開始，從而避開了嚴寒危害。小麥品種之間的光照反應(yīng)和早晚熟 程度差異也是明顯的，這些差異與不同春化反應(yīng)結(jié)合在一起，在不同地區(qū)形成了多種多樣 的氣候生態(tài)類型。
[0004]僅從遺傳學角度來看，目前公認的春化有關(guān)基因有5個，分別定名為：Vrnl、 Vrn2、Vrn3、Vrn4和Vrn5,前3個基因合稱VRN-1，分別定位在5A、5B和5D染色體長臂 上。其中，Vrnl對溫度敏感性影響最大，并對其它春化基因具有上位性效應(yīng)，而Vrn5影響 最小。Sutka和Snape(1989)曾將命名為"Frl"的耐凍基因定位在5A染色體上，與Vrnl 位置相同，他們同時又認為該基因可能是Vrnl基因的多效性或兩者之間的緊密連鎖。 Distelfeld等（2009)的研究報道提供了上述工作的分子生物學依據(jù)（Curr Opin Plant Biol, 2009, l2:1 - 7)。Dhillon等（2〇1〇)在美國和匈牙利比較了 VRN-1基因?qū)Σ煌潭?冬季嚴寒的反應(yīng)，結(jié)果表明Vrn-Ι等位變異足以決定耐凍性的差異，說明過去作圖的耐凍 性基因可能是Vrn-Ι的多態(tài)性效應(yīng)，而不是像Sutka和Snape (1989)提出的那種獨立緊 密連鎖位點的效應(yīng)（Regulation of freezing tolerance and flowering in temperate cereals:The VRN-lconnection. Plant Physiol,2010,153:1846 - 1858)。Galiba 等 (2009)的研允也表明，春化與冷適應(yīng)調(diào)節(jié)的基因網(wǎng)絡(luò)是互相聯(lián)系的（RegUi at〇ry genes involved in the determination of frost tolerance in temperate cereals. Plant Sci，2009, 176:12 - 19)〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒的引物組合物。 [0006]本發(fā)明提供的組合物，由單獨使用的引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物 對5、引物對6、引物對7、引物對8和引物對9組成；
[0007] 所述引物對1由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子361S-F和序列表中序列2 所不的單鏈DNA分子VA1-R組成；
[0008] 所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈·Α分子361W_F和序列表中序列2 所示的單鏈DNA分子VA1-R組成；
[0009] 所述引物對3由序列表中序列4所示的單鏈DNA分子VRN1AF和序列表中序列5 所示的單鏈DNA分子VRN1-INT1R組成；
[0010] 所述引物對4由序列表中序列6所示的單鏈DNA分子Intrl/A/F2和序列表中序 列7所示的單鏈DNA分子Intrl/A/R3組成；
[0011] 所述引物對5由序列表中序列8所示的單鏈DNA分子Intrl/C/F和序列表中序列 9所示的單鏈DNA分子Intrl/AB/R組成；
[0012]所述引物對6由序列表中序列10所示的單鏈DNA分子Intrl/ B/F和序列表中序 列11所示的單鏈DNA分子1ntrl/B/R3組成； _3]所述引物對7由序列表中序列10所示的單鏈DNA分子Intrl/ B/F和序列表中序 列12所示的單鏈DNA分子Intrl/B/R4組成；
[0014]所述引物對8由序列表中序列13所示的單鏈DNA分子Intrl/ D/F和序列表中序 列14所示的單鏈DNA分子Intrl/D/R3組成；
[0015]所述引物對9由序列表中序列13所示的單鏈DNA分子 Intrl/D/F和序列表中序 列15所示的單鏈DNA分子Intrl/D/R4組成。
[0016] 上述組合物中，所述引物組合物中各引物均為等摩爾比。
[0017]上述的引物組合物在鑒定或輔助鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒中的應(yīng)用也是本 發(fā)明保護的范圍；
[0018]或上述的引物組合物在制備鑒定或輔助鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒產(chǎn)品中的 應(yīng)用；所述產(chǎn)品具體為試劑盒。
[0019]本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒的方 法。
[0020]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：以待測小麥的基因組DNA為模板，分別用上述 的引物組合物中的9對引物對進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物：
[0021]若擴增產(chǎn)物滿足如下1)-3)的全部標準，則待測小麥抗寒或候選抗寒：D引物對2 擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為469bp或引物對5擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為l〇68bp,且引物 對1、引物對3、引物對4沒有擴增產(chǎn)物； 2)引物對7擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為1149bp,且 引物對6沒有擴增產(chǎn)物；3)引物對9擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為 997bp，且引物對8沒有擴 增產(chǎn)物；
[0022]若擴增產(chǎn)物滿足如下A)-B)的任一種標準，則待測小麥不抗寒或候選不抗寒:A) 引物對1擴增產(chǎn)物大小為46%ρ或引物對3擴增產(chǎn)物大小為7l4-965bp或引物對4擴增產(chǎn) 物大小為ll 7〇bp，且引物對2和引物對5均沒有擴增產(chǎn)物；B)引物對6擴增得到的擴增產(chǎn)物 大小為709bp，且引物對7沒有擴增產(chǎn)物； 3)弓丨物對8擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為I671bp， 且引物對9沒有擴增產(chǎn)物。
[0023]本發(fā)明第三個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒的方法。 [0024]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測小麥的5A、5B和ro染色體上的Vrnl 基因是否為隱性，若5A、5B和?染色體上的Vrnl基因均為隱性，則待測小麥抗寒或候選抗 寒，若5A、5B和5D染色體上的Vrnl基因至少1個不為隱性，則待測小麥不抗寒或者候選不 抗寒。
[0025]上述方法中，所述檢測待測小麥的δΑ、5Β和5D染色體上的Vrnl基因隱性的方法 包括如下步驟：
[0026]以待測小麥的基因組DNA為模板，分別用上述的引物組合物中的9對引物對進行 PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物：
[0027]若擴增產(chǎn)物滿足如下1)-3)的全部標準，則待測小麥的5A、5B和5D染色體上的 Vrnl基因均為隱性：1)引物對2擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為469bp或引物對5擴增得到的 擴增產(chǎn)物大小為1068bp，且引物對1、引物對3、引物對4沒有擴增產(chǎn)物；2)引物對7擴增得 到的擴增產(chǎn)物大小為1149bp，且引物對6沒有擴增產(chǎn)物；3)引物對9擴增得到的擴增產(chǎn)物 大小為997bp，且引物對8沒有擴增產(chǎn)物；
[0028]若擴增產(chǎn)物滿足如下A) -B)的任一種標準，則待測小麥的5A、5B和5D染色體上的 Vrnl基因至少1個不為隱性:A)引物對1擴增產(chǎn)物大小為469bp或引物對3擴增產(chǎn)物大 小為714-965bp或引物對4擴增產(chǎn)物大小為lHObp，且引物對2和引物對5均沒有擴增產(chǎn) 物；B)引物對6擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為 7〇%ρ，且引物對7沒有擴增產(chǎn)物；3)引物對8 擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為1671bp，且引物對9沒有擴增產(chǎn)物。
[0029] 上述方法中，所述待測小麥為在每年秋季播種后經(jīng)歷越冬期的小麥。
[0030]上述抗寒小麥為抗寒性等級為1或2的小麥，不抗寒小麥為抗寒等級為4或5的 小麥。
[0031] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明δΑ、5Β和5D三個染色體上的Vrnl基因的顯性隱性來 判斷小麥是否抗寒，該方法可在實驗室鑒定新品種抗寒性，彌補了田間鑒定時因某些年份 遭遇"暖冬"天氣帶來的千擾，可從現(xiàn)有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗病的小麥新品種中快速鑒定出不同生態(tài) 區(qū)適用的抗寒性品種，避免冬季低溫造成的凍害損失。
[0032] 通過分析春化基因與抗凍性關(guān)系可以看出，含有Vrn-Al、Vrn-Bl的品種抗寒性都 很差（表1)。國家農(nóng)作物新品種區(qū)域試驗規(guī)定：在黃淮北部及北部冬麥區(qū)種植的品種要測 試其抗寒性，審定品種的抗寒性要較強。因此在黃淮北部及北部冬麥區(qū)推廣的品種應(yīng)盡量 避免攜帶 Vrn-Al、Vrn-B1。
[0033] 表1春化基因 VRN1等位變異組成與抗寒性的關(guān)系
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 用于鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒的引物組合物，由單獨使用的引物對1、引物對 2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6、引物對7、引物對8和引物對9組成； 所述引物對1由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子361S-F和序列表中序列2所示 的單鏈DNA分子VA1-R組成； 所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子361W-F和序列表中序列2所示 的單鏈DNA分子VA1-R組成； 所述引物對3由序列表中序列4所示的單鏈DNA分子VRN1AF和序列表中序列5所示 的單鏈DNA分子VRN1-INT1R組成； 所述引物對4由序列表中序列6所示的單鏈DNA分子Intrl/A/F2和序列表中序列7 所示的單鏈DNA分子Intrl/A/R3組成； 所述引物對5由序列表中序列8所示的單鏈DNA分子Intrl/C/F和序列表中序列9所 示的單鏈DNA分子Intrl/AB/R組成； 所述引物對6由序列表中序列10所示的單鏈DNA分子Intrl/B/F和序列表中序列11 所示的單鏈DNA分子Intrl/B/R3組成； 所述引物對7由序列表中序列10所示的單鏈DNA分子Intrl/B/F和序列表中序列12 所示的單鏈DNA分子Intrl/B/R4組成； 所述引物對8由序列表中序列13所示的單鏈DNA分子Intrl/D/F和序列表中序列14 所示的單鏈DNA分子Intrl/D/R3組成； 所述引物對9由序列表中序列13所示的單鏈DNA分子Intrl/D/F和序列表中序列15 所示的單鏈DNA分子Intrl/D/R4組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合物，其特征在于：所述引物組合物中各引物均為等 摩爾比。
3. 權(quán)利要求1或2所述的引物組合物在鑒定或輔助鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒中的 應(yīng)用； 或權(quán)利要求1或2所述的引物組合物在制備鑒定或輔助鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒 產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述產(chǎn)品具體為試劑盒。
4. 一種鑒定或輔助鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒的方法，包括如下步驟：以待測小麥 的基因組DNA為模板，分別用權(quán)利要求1或2所述的引物組合物中的9對引物對進行PCR 擴增，檢測擴增產(chǎn)物： 若擴增產(chǎn)物滿足如下1)_3)的全部標準，則待測小麥抗寒或候選抗寒：1)引物對2擴 增得到的擴增產(chǎn)物大小為469bp或引物對5擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為1068bp，且引物對 1、引物對3、引物對4沒有擴增產(chǎn)物；2)引物對7擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為1149bp，且引 物對6沒有擴增產(chǎn)物；3)引物對9擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為997bp，且引物對8沒有擴增 產(chǎn)物； 若擴增產(chǎn)物滿足不符合上述情況，則待測小麥不抗寒或候選不抗寒。
5. -種鑒定或輔助鑒定待測小麥抗寒還是不抗寒的方法，包括如下步驟：檢測待測小 麥的5A、5B和?染色體上的Vrnl基因是否為隱性，若5A、5B和?染色體上的Vrnl基因 均為隱性，則待測小麥抗寒或候選抗寒，若不符合上述情況，則待測小麥不抗寒或者候選不 抗寒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述檢測待測小麥的5A、5B和ro染色體 上的Vrnl基因是否為隱性的方法包括如下步驟： 以待測小麥的基因組DNA為模板，分別用權(quán)利要求1或2所述的引物組合物中的9對 引物對進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物： 若擴增產(chǎn)物滿足如下1)_3)的全部標準，則待測小麥的5A、5B和?染色體上的Vrnl 基因均為隱性：1)引物對2擴增得到的擴增產(chǎn)物大小為469bp或引物對5擴增得到的擴增 產(chǎn)物大小為l〇68bp，且引物對1、引物對3、引物對4沒有擴增產(chǎn)物；2)引物對7擴增得到的 擴增產(chǎn)物大小為1149bp，且引物對6沒有擴增產(chǎn)物；3)引物對9擴增得到的擴增產(chǎn)物大小 為997bp，且引物對8沒有擴增產(chǎn)物； 若擴增產(chǎn)物不符合上述情況，則待測小麥的5A、5B和?染色體上的Vrnl基因不全為 隱性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于： 所述待測小麥為在每年秋季播種后經(jīng)歷越冬期的小麥。
【文檔編號】C12N15/11GK104232758SQ201410379477
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】孫果忠, 游光霞, 張秀英, 肖世和 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所