專利名稱：：抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及抗微管類化療藥物療效相關(guān)的基因mRNA表達水平檢測液相芯片和檢測方法。
背景技術(shù)：
：抗微管類化療藥物是一類重要的化療藥物，主要包括有紫杉醇、泰素帝、長春堿和長春新堿和諾維本。其中，紫杉醇通過促進微管蛋白形成微管，抑制微管的解聚，促進微管雙聚體形成、阻止其多聚化，導(dǎo)致紡錘體異常并抑制有絲分裂而使細胞阻滯于G-2/M期，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。而長春類生物堿能在受體部位與紡錘微小管蛋白結(jié)合，形成高度規(guī)則的結(jié)晶體，從而影響微管蛋白裝配，使細胞阻滯于G-2/M期，阻斷細胞的正常分裂?？刮⒐茴愃幬锏寞熜щm得到廣泛認可，但患者用藥后藥效的個體差異很大、且有不同程度的毒副作用。其副作用主要神經(jīng)系統(tǒng)毒性、組織局部壞死、脫發(fā)、低血壓、支氣管痙攣、惡心，嘔吐或腹瀉、紅斑等不良反應(yīng)。大量的臨床研究已經(jīng)證實，抗微管類藥物的療效/毒副作用與患者體內(nèi)13-微管蛋白-111(P-tubulin-111，TUBB3)、STMNl的表達水平關(guān)系密切。(1)抗微管藥物與P-微管蛋白-III(e-tubulin-III，TUBB3)細胞內(nèi)微管蛋白是細胞骨架的重要組成部分，是有絲分裂時紡錘體的基本組成單位。人類細胞中存在著6種13微管蛋白同型體，其中3型13微管蛋白(e-tubulin-III)與作用于微管的化療藥物敏感性有最密切的關(guān)系。P-tubulin亞型的選擇性表達，最主要是e-tubulin-III的過表達可減弱紫杉醇與微管相互作用的動力學(xué)，從而導(dǎo)致紫杉醇的耐藥性。在細胞系的研究中證明e-tubulin-III的過表達與紫杉醇的耐藥性相關(guān)，大量臨床研究也支持P-tubulin-III過表達與對紫杉醇的低應(yīng)答存在相關(guān)性。在一項對93例非小細胞肺癌(NSCLC)患者的研究中，發(fā)現(xiàn)13-tubulin-III的表達水平是與無進展生存率(P=0.04)和總生存率(P=0.012)相關(guān)的獨立因素，顯示高表達的13-tubulin-III與長春瑞濱的耐藥性和NSCLC患者的化療預(yù)后不良也有密切關(guān)系。因此，13-tubulin-III的表達水平可能是抗微管類化療藥物的良好預(yù)后指標。[OOOS](2)抗微管類藥物與STMNlSTMNl(Stathmin，又稱oncoprotein18)，其編碼的STMNl蛋白通過促進微管的解聚或阻止微管的聚合從而影響有絲分裂紡錘體的形成。抑制STMNl表達可以干擾惡性腫瘤細胞的有絲分裂，從而影響腫瘤細胞的增殖與凋亡。在多種腫瘤細胞系的研究和臨床研究中，STMNl基因的mRNA表達水平與抗微管類化療的療效密切相關(guān)。STMNl低表達的腫瘤患者接受長春瑞濱/順鉑治療的效果較好，中位生存期較長，反之，STMNl高表達的患者接受長春瑞濱/順鉑的療效較差。而且，STMNl在腫瘤中mRNA的表達水平與患者預(yù)后直接相關(guān)，STMNl的表達水平越高，患者的生存率越低，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險越高。(3)持家基因132-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)和TATA框結(jié)合蛋白(TBP)持家基因一般在體內(nèi)可穩(wěn)定表達，但由于這種穩(wěn)定表達是相對的，在一定的病理狀態(tài)或用藥情況下，某些常用的持家基因的表達也會發(fā)生變化。選擇在我們所研究對象中穩(wěn)定表達的基因作持家基因，對保證檢測結(jié)果的準確性至關(guān)重要。因此，本發(fā)明從一定數(shù)量的常用持家基因中進行篩選，確定3個合適的持家基因，分別是132-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)、TATA框結(jié)合蛋白(TBP)?；谝陨匣虻谋磉_水平與化療藥物療效的相關(guān)性，專家推薦患者在接受化療藥物之前，應(yīng)當進行相關(guān)的基因mRNA表達水平的檢測，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個體差異制定個體化用藥方案，以提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。目前，對基因的mRNA表達水平進行檢測的技術(shù)主要有逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法、實時熒光定量PCR法、RNA原位核酸雜交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析組織或細胞內(nèi)RNA分布以了解特定基因的表達情況，且其過程較長、操作繁瑣，不適合用于臨床應(yīng)用；而逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實時熒光定量PCR法，首先，這兩種方法均需要進行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄，檢測的結(jié)果受RNA降解影響大；其次，這兩種方法只通過一對引物進行PCR擴增，容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性高；再次，這兩種方法一般只有一個持家基因作對照，其準確性容易受到病理狀態(tài)的影響；因此，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實時熒光定量PCR法作為臨床應(yīng)用均存在著難以克服的技術(shù)缺陷。本發(fā)明所采用的基因mRNA表達液相芯片在無需RNA抽提純化、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增的情況下，實現(xiàn)對mRNA表達水平檢測。本發(fā)明通過5至7條長度介于17nt至27nt的支持延伸探針捕獲目標基因的mRNA，因此基本不受mRNA降解的影響；而利用堿基互補配對的原理對目標基因的mRNA進行信號的級聯(lián)放大，特異性高，不容易產(chǎn)生假陽性；同時，以多個持家基因作對照(n>3)，檢測結(jié)果不易受病理狀態(tài)的影響，準確性高；且基因表達液相芯片除了適用于新鮮組織，在石蠟包埋固定組織、組織切片均適用。對比起其他的mRNA檢測方法，有著操作簡易、準確性高、特異性高的特點。液相芯片技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，在微球的制造過程中，摻入不同比例的染色劑，從而形成100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價結(jié)合了針對不同待檢測物的探針分子從而實現(xiàn)對多達100中待檢物質(zhì)的同步并行檢測。因此，我們采用液相芯片技術(shù)可以同時檢測多個基因的mRNA表達水平，實現(xiàn)了檢測的高通量，大大提高了檢測效率。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供與抗微管類化療藥物療效相關(guān)的基因mRNA表達水平液相檢測芯片，該液相芯片可用于檢測以下5種目標基因的表達水平TUBB3、ST麗1、B2M、TFRC、TBP。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下—種抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，主要包括(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列和3'端的能與支持延伸探針互補配對的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個目標基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5'端能與對應(yīng)的目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3'端能與對應(yīng)的支持探針的特異性序列PI互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對TUBB3基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對STMN1基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上；以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.30中的2條或2條以上；(3)擴增延伸探針，每條擴增延伸探針包括有5'端能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3'端序列P5，3'端還修飾有生物素；所述擴增延伸探針的特異性序列P4包括有針對TUBB3基因的選自SEQ.NO.31-SEQ.NO.40中的5條或5條以上、和/或針對STMNl基因的選自SEQ.NO.41-SEQ.NO.50中的5條或5條以上；以及針對B2M基因的選自SEQ.NO.51-SEQ.NO.60中的5條或5條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.61-SEQ.NO.70中的5條或5條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.71-SEQ.NO.80中的5條或5條以上，所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列?；蛘?，主要包括(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列和3'端的與支持延伸探針互補配對的特異性序列Pl，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.5，每個目標基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；(2)連接支持探針與目標基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5'端能與對應(yīng)的目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3'端能與對應(yīng)的支持探針的特異性序列PI互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對TUBB3基因的選自SEQ.NO.6-SEQ.NO.10中的2條或2條以上、和/或針對STMN1基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.15中的2條或2條以上；針對B2M基因的選自SEQ.NO.16-SEQ.NO.20中的2條或2條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.21-SEQ.NO.25中的2條或2條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.26-SEQ.NO.30中的2條或2條以上；(3)擴增延伸探針，每條擴增延伸探針包括有5'端能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3'端序列P5;所述擴增延伸探針的特異性序列P4包括有針對TUBB3基因的選自SEQ.NO.31-SEQ.NO.40中的5條或5條以上、和/或針對STMN1基因的選自SEQ.NO.41-SEQ.NO.50中的5條或5條以上；針對B2M基因的選自SEQ.NO.51-SEQ.NO.60中的5條或5條以上，針對TFRC基因的選自SEQ.NO.61-SEQ.NO.70中的5條或5條以上，和針對TBP基因的選自SEQ.NO.71-SEQ.NO.80中的5條或5條以上，所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與Pl、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；禾口(4)標記探針，所述標記探針具有與擴增延伸探針P5互補配對的序列，且末端具有生物素修飾。優(yōu)選地，所述的抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片，還包括有填充序列，包括有針對TUBB3基因的SEQ.NO.81、針對ST麗1基因的選自SEQ.NO.82-SEQ.NO.85中的一條或多條、針對B2M基因的選自SEQ.NO.86-SEQ.NO.93中的一條或多條，和/或針對TFRC基因的選自SEQ.NO.94-SEQ.NO.97中的一條或多條。優(yōu)選地，所述間隔臂序列為5-10個T;所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。本發(fā)明的另一目的是提供檢測抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平的方法。具體技術(shù)方案如下—種檢測抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平的方法，使用上述液相芯片，主要包括以下步驟(—)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴增延伸探針密封于雜交板中，54t:士rC，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的Pl互補結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標mRNA特異結(jié)合，從而將目標mRNA結(jié)合到微球上；擴增延伸探針帶有生物素標記，擴增延伸探針的P4與目標mRNA特異結(jié)合從而實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大；(三)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應(yīng)；(四)通過熒光檢測儀檢測?；蛘咧饕ㄒ韵虏襟E(—)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴增延伸探針密封于雜交板中，54t:士rC，600rpm震蕩孵育過夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的Pl結(jié)合互補結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標mRNA特異結(jié)合，從而將目標mRNA結(jié)合到微球上；擴增延伸探針的P4與目標mRNA特異結(jié)合；(三)再加入標記探針，標記探針帶有生物素標記，5(TC土rC，600rpm震蕩孵育1小時，標記探針與擴增延伸探針的序列P5互補配對結(jié)合，從而實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大；(四)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素_藻紅蛋白進行反應(yīng)；(五)通過熒光檢測儀檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)運用本發(fā)明所述的液相芯片和檢測方法，對抗代謝類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平進行檢測，無需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測結(jié)果的準確性；另一方面，以多個持家基因作對照(N>3)，檢測結(jié)果不易受病理狀態(tài)的影響，準確性高使檢測結(jié)果更為可靠。(2)本發(fā)明使用的是探針的多位點特異配對、級聯(lián)放大的方式來實現(xiàn)信號的放大，而不是PCR擴增的方法，提高了檢測信號，實現(xiàn)了檢測的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)的假陽性。(3)本發(fā)明所述的液相芯片和檢測方法適用于新鮮組織、石蠟包埋固定組織、組織切片、穿剌組織等樣本類型，對比起其他的mRNA檢測方法，有著操作簡易、準確性高、特異性高的特點。(4)本發(fā)明所設(shè)計的各種探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進行雜交反應(yīng)，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時，多種探針的組合使用使液相芯片和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統(tǒng)。具體實施例方式本領(lǐng)域的人員所知，所述間隔臂序列為用于將支持探針與微球表面間隔開來，在支持延伸探針與擴增延伸探針內(nèi)部也存在間隔臂序列，通過在探針序列與胺基之間、探針內(nèi)部設(shè)置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n^3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂(間隔臂長度優(yōu)選2-4)。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5-10個T，在中國，T的合成技術(shù)比較成熟，成本相對較低。實施例1抗微管類化療藥物療效相關(guān)的目標基因mRNA表達水平檢測液相芯片試劑盒，主要包括有—、偶聯(lián)有支持探針(SP)的微球支持探針由三部分組成，5'端是與微球結(jié)合的胺基端，3'端是與支持延伸探針結(jié)合的特異性序列Pl，長度為16nt，中間是8個寡聚核苷酸T的間隔臂序列，每個目標基因選用一種微球，并選用一條支持探針，每種微球具有不同的熒光編碼。每個目標基因的支持探針如表1所示表1不同的目標基因及其選用微球的編號、支持探針(SP)基因微球號SP序列(5'—3')NH2+poly(dT)+Pl(PI)SEQID■B3365，NH2-TTTTTTTT-CTCAAATACTCAAATC1STMN1345，NH2-TTTTTTTT-TTCTATATCAACATCT2B2M225，NH2-TTTTTTTT-CTTTCTTTAATCTCAA3TFRC615，NH2-TTTTTTTT-CATTCAAATCTCAACT4TBP335，NH2-TTTTTTTT-CAATTACTTCAAATCT5所有探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的支持探針用滅菌(1朋20配成100nmol/ml的貯存液。微球包被的過程如下分別取5X106個上述編號的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul0.lmol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的捕獲探針(100nmol/ml)。配制lOng/ml的EDC(N_(3-Dimethylaminopropyl)_N_ethylcarbodiimide)(購自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02X的Tween-20洗滌一次，再用0.1%的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有支持探針的微球重懸于lOOul的Tris-EDTA溶液[1Ommol/LTris(pH8.0)，1,1/LEDTA]中，2-8。C避光保存。二、與目標基因mRNA特異結(jié)合的支持延伸探針(SE)、擴增延伸探針(AE)1)支持延伸探針(SE)是連接支持探針(SP)與目標基因mRNA之間的序列，SE由三部分組成，5'端是能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2，長度介于17nt至26nt，3'端是能與支持探針5'端PI序列通過堿基互補結(jié)合的特異性序列P3，中間是5個寡聚核苷酸T的間隔臂序列。每個目標基因分別設(shè)計5條支持延伸探針，以提高檢測的特異性。使用時，針對每種目標基因，選擇2條或2條以上支持延伸探針即可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都很好(實驗數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用5條支持延伸探針，以使特異性達到最好。合成后的每條探針分別用1Ommol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。目標基因的支持延伸探針(SE)見表2。表2目標基因的支持延伸探針(SE)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2)擴增延伸探針(AE)是連接目標基因mRNA與信號檢測組分之間的序列，AE由三部分組成，5'端是能與目標基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4，3'端是能與標記探針互補配對的序列P5，(如不運用標記探針檢測時，則3'端還修飾有生物素)，中間是5個寡聚核苷酸T的間隔臂序列。每個目標基因分別設(shè)計10至15條擴增延伸探針，從而將檢測信號進行級聯(lián)放大。合成后的每條探針分別用10mmol/LTrisBuffer配制成100pmol/mL的貯存液。目標基因的擴增延伸探針(AE)見表3。所述P5的設(shè)計按照本領(lǐng)域的探針設(shè)計的公知常識，其為不存在內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間都不形成二聚體、不存在錯配，與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列，本發(fā)明優(yōu)選堿基組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。使用時，針對每種目標基因，選擇5條或5條以上擴增延伸探針即可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都很好(實驗數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選為使用IO條擴增延伸探針，以使特異性達到最好。表3目標基因的擴增延伸探針(AE)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3)填充序列(FS)，將目標基因mRNA中沒有與SE、AE特異結(jié)合的區(qū)域封閉，以減少后續(xù)反應(yīng)中生物素或標記探針的非特異性結(jié)合，從而減少檢測背景。填充序列的Tm值應(yīng)與SE、AE接近，如表4所示。表4目標基因的填充序列(FS)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>三、標記探針(LP)標記探針(LP)由兩部分組成，其序列是能與擴增延伸探針3'端的序列P5互補結(jié)合的序列，5'端帶有生物素標記，通過與擴增延伸探針結(jié)合實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大。表5標記探針(LP)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例2運用抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達檢測液相芯片對臨床樣本的檢測所述各種溶液的配方如下溶滾名稱勾察緩沖液!68mMUC！,9mMfiDTA,5%十二烷基*酸鋰，50raMHEPES,0,05%ProClin300裂解混合液WOmMLiCL5%十二焼*硫酸鋰，9mMED丁A,50mMHEPES(pH7.5),0.05。/。羥乙基淀粉,0.05%ProC!in300，0,2%薩蛋白.封閉液;100|ig/ml變性鮭精DNA探餘.C詐液SE:0J65frao!/ul/gene;AE:0,66f雄oZul/gene;FS:0,33ft加〗.'ul/gene標E探針工作滾LP:0.75faid/ul/gene徽球工作滾偶聯(lián)有SP的徵球，每種目標基因"分別有2000個微球洗》緩沖液0.1xSSC,0.03%1-二烷基硫酸鋰SA-PE工作織20mmol/LTris-HC1,400mmol/L氣化鋰，itnL/L吐溫20,1mL/L牛血淸白蛋白，and5mL/LMier-O-protert,6mg/LSA-PE'SA-PE洗歸100mMtris-(經(jīng)甲基)胺基甲烷.pH8.0,0.1%BWJ*-35，1raMZnCl2，10mMMgC:h—、裂解樣本釋放總RNA1.將FFPE腫瘤組織切片從載玻片上刮下，放入1.5ml離心管中，加入300ul勻漿緩沖液和3ul蛋白酶K(50ug/ul)，混合均勻，65t:消化2h。2.消化2h后的樣品，室溫下13，OOOrpm離心5分鐘，吸取中間澄清的溶液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中備用。(如溶液仍不澄清，則重復(fù)本步驟12次。)二、目標mRNA通過與探針特異性結(jié)合固定在微球上。1.取出探針工作液于室溫融解，然后在95t:變性5分鐘，馬上置于冰上。2.按下表配制工作液，混合均勻<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3.將上述配制好的工作液分裝至雜交板上，60ul/孔。然后將上述處理好的樣品以40ul/孔分別加入雜交板中；空白對照加入勻漿緩沖液40ul/孔。密封雜交板，54°C士rC，600rpm震蕩孵育過夜(16-22h)。4.用洗滌緩沖液潤濕濾板1分鐘，除去洗滌緩沖液。5.將雜交板取出，500Xg離心1分鐘，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至濾板中。6.除去溶液，用200ul洗滌緩沖液洗滌3次。三、通過雜交反應(yīng)將目標RNA信號放大1.加入標記探針工作液飾1/孔。50°C士rC，600rpm震蕩孵育1小時。2.除去溶液，用200ul洗滌液洗滌2次。四、與SA-PE結(jié)合，并在液相芯片閱讀儀上檢測1.加入SA-PE工作液100u1/孔，600rpm震蕩室溫孵育30min。2.除去溶液，用200ulSA-PE洗滌液洗滌2次，用吸水紙吸干濾板底部。3.加入SA-PE洗滌液130u1/孔。室溫，600rpm震蕩孵育2至5分鐘。4.在液相芯片儀上讀取數(shù)據(jù)。五、數(shù)據(jù)分析及cutoff值的界定在5個目標基因中，標志基因2個，分別是TUBB3、STMN1;持家基因3個，分別是B2M、TFRC、TBP;將讀取的熒光值按照以下方法進行均一化處理步驟1:獲得原始數(shù)據(jù)(MFI值)步驟2:樣品的MFI減去空白孔N的MFI=netMFI步驟3:每個樣品的三個持家基因的netMFI值分別取幾何平均值，得到相應(yīng)的G1、G2、G3......Gn步驟4:每個樣品目標基因mRNA的netMFI除以對應(yīng)的Gn得到相應(yīng)的Nn。Nn即為已排除上樣量差異，可在樣品間進行相對表達量比較的數(shù)值。本實施例中對10例樣品進行檢測，檢測結(jié)果如下所示表610例樣品原始數(shù)據(jù)(MFI值)禾PTUBB3、STMN1的相對表達量<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例3:不同間隔臂的液相芯片對抗微管類化療藥物相關(guān)基因mRNA表達水平的檢測—、液相芯片制備的設(shè)計(間隔臂的選擇)以TUBB3檢測液相芯片的支持探針為例，分別選用不同的間隔臂，具體設(shè)計如表7所示。探針SP、SE與AE的合成、SP序列包被微球、檢測方法等如實施例1和實施例2所述。表7間隔臂及其長度<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>二、樣品檢測采用上述設(shè)計制備的液相芯片，按實施例2所述檢測過程和方法對樣品11-15進行檢測，檢測結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測熒光值)表8樣品檢測結(jié)果(檢測熒光值〈MFI值>)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>將4組設(shè)計的檢測熒光值進行統(tǒng)計學(xué)分析，證明4組設(shè)計的檢測效果沒有差異。因此，這4種間隔臂的設(shè)計是等效的。其它針對支持延伸探針、擴增延伸探針內(nèi)部不同的間隔序列的液相芯片，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例4:不同信號檢測組分液相芯片對抗微管類化療藥物相關(guān)基因mRNA表達水平的檢測—、液相芯片制備的設(shè)計(信號檢測組分)信號檢測組分有兩種選擇，1)擴增延伸探針3'端序列P5的3'端帶有生物素標記；2)擴增延伸探針3'端序列P5與標記探針(LP)通過堿基互補配對結(jié)合，同時標記探針的5'端帶有生物素標記。這兩種信號檢測組分均能實現(xiàn)信號放大，檢測到正常信號。其中，使用標記探針的生物素活性更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。所述液相芯片以TUBB3的兩種信號檢測組分為例，具體設(shè)計如表9所示。即所述液相芯片的組成為實驗組1:支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列同實施例l，擴增延伸探針具有生物素標記；沒有標記探針；實驗組2:支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列、標記探針同實施例1，擴增延伸探針不具有生物素標記。表9信號檢測組分<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>二、樣品檢測采用上述設(shè)計制備的液相芯片，檢測方法實驗組2同實施例2所述檢測過程和方法對樣品16-20進行檢測，實驗組1所述檢測方法，省略(三、通過雜交反應(yīng)將目標RNA信號放大)該步驟，其余同實施例2。檢測結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測熒光值)表10樣品檢測結(jié)果(檢測熒光值〈MFI值>)S咖ple實驗組1實驗組2N15816256326351718921905185201532019362536982080118105將兩組設(shè)計的檢測熒光值進行統(tǒng)計學(xué)分析，證明兩組設(shè)計的檢測結(jié)果沒有差異，因此，這兩種信號檢測組分對信號的檢測是等效的。其中，使用標記探針的信號檢測組分，由于其生物素的活性更為穩(wěn)定，效果較優(yōu)。以上是針對本發(fā)明的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。序列表〈110〉廣州益善生物技術(shù)有限公司〈120〉抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達水平檢測液相芯片和檢測方法〈160>98〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1ctcaaatactcaaatc16〈210>2〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2ttctatatcaacatct〈210〉3〈211〉16〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>3ctttctttaatctcaa〈210〉4<211>16〈212>DNA<213>人工序列〈400〉4cattcaaatctcaact<210>5〈211>16〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉5caattacttcaaatct〈210>6〈211〉20〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>6ccgagtcgcccacgtagttg〈210〉7〈211〉18〈212>DNA〈213〉人工序列<400>7ttccgggtt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