專利名稱：：一種含利鈉肽基因的藥物及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種含利鈉肽基因的藥物，具體的說，是一種可以降低眼壓，治療青光眼的基因藥物，及其制備方法。
背景技術：
：青光眼是一種視神經(jīng)病變，是目前主要致盲原因之一。據(jù)統(tǒng)計，每年全世界大約700萬人因本病導致失明。盡管青光眼的發(fā)病機制尚未完全清楚，但眼壓(intraocularpressure,IOP)升高是主要的危險因素之一。因此，降眼壓一直是青光眼的主要治療手段，及時有效地降低眼壓可減緩病程及降低對視功能的損害。目前臨床應用的降眼壓藥物均局限在能影響酶活性的小分子化合物，如碳酸酐酶抑制藥，或影響受體活性的小分子藥物，如前列腺素受體興奮藥、腎上腺素P受體阻滯藥、腎上腺素a受體興奮藥和乙酰膽堿受體興奮藥等。由于如何能有效的控制青光眼病人的眼壓是青光眼治療的關鍵問題所在，目前大多降眼壓藥存在費用高，療效不理想，患者依從性和毒副作用等問題。并沒有一種非常理想的控制眼壓的藥物。利鈉肽是一種大分子的生物活性肽，包括心房利鈉肽(atrialnatriureticp印tide，ANP)，腦利納月太(brainnatriureticp印tide，BNP)禾口C型利納月太(C—typenatriureticp印tide，CNP)。所有利鈉肽均通過結合細胞膜上特異性的利鈉肽受體(NPR)而發(fā)揮作用。已知cGMP(guanosine3，，5，一cyclicmonophosphate)及可增力口目艮組織cGMP的制劑(如一氧化氮供體)可降低眼壓。利鈉肽能增加細胞cGMP的生成，影響房水生成，因此有降眼壓的作用。其作用機制與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶通路有關。cGMP激活依賴cGMP的蛋白激酶(cGMP-d印endentproteinkinase,PKG)，PKG使能構成運轉(zhuǎn)體或離子通道的特異底物蛋白磷酸化，從而影響其生物效應，減少房水生成。利鈉肽可通過激活其在組織中的相應受體參與眼壓調(diào)節(jié)，有明顯的降壓效果。由于利鈉肽可被中性內(nèi)肽酶水解后清除，所以需反復給藥以維持治療效果，但又由于利鈉肽角膜通透性差，只能通過結膜下、玻璃體腔注射進入眼內(nèi)(前者效差)；而反復結膜下、玻璃體腔注射無臨床實用意義，因此利鈉肽未能廣泛應用于青光眼的治療?，F(xiàn)有技術中，利用利鈉肽基因藥物治療青光眼國內(nèi)外未尚見報道。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒，其含有如SEQIDN0.1的核苷酸序列，質(zhì)粒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒；優(yōu)選的載體選擇逆轉(zhuǎn)錄病毒，進一步地，優(yōu)選載體為慢病毒，最優(yōu)選的載體為pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP慢病毒表達載體。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，它含有權利要求15任一一項所述的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還提供制備權利要求6所述藥物組合物的方法，克隆含有如SEQIDNO.1的核苷酸序列，將其與表達載體鏈接，然后包裝成病毒顆粒，再制備成藥物制劑，所述表達載3體為pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP慢病毒表達載體。本發(fā)明也提供所述的組合物在制備治療青光眼藥物中的應用，所述藥物優(yōu)選為注射劑。本發(fā)明是采用基因治療的途徑，即將利鈉肽基因慢病毒表達載體導入大鼠玻璃體腔，我們觀察到目的基因的表達高，有明顯的降低活體動物眼壓的效果，并且不良反應少，成本低廉，效果肯定，為青光眼治療開創(chuàng)新的思路。以下通過具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并不限制本發(fā)明，本領域技術人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權利要求的范圍。圖1RT-PCR從大鼠腎臟組織總RNA中合成并擴增CNP基因M:核酸分子量標準；泳道1:RT-PCR產(chǎn)物圖2限制性核酸內(nèi)切酶消化鑒定重組質(zhì)粒pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNPM:核酸分子量標準；泳道1，2，3:雙酶切pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP質(zhì)粒；泳道4:pCDFl-MCS2-EFl-copGFP質(zhì)粒。圖3pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP測序結果圖4慢病毒包裝流程圖圖5CNP基因在mRNA水平表達的RT-PCR檢測圖中泳道依次為100bpMarker、質(zhì)粒陽性對照、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DNAse處理組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和陰性對照。圖6檢測CNP轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)cGMP的表達圖7放射免疫法檢測大鼠睫狀體cGMP水平圖8Tonolab眼壓計測量大鼠眼壓和真實眼壓的相關性圖9雙眼眼壓在不同時間段眼壓的比較圖，橫坐標的時間段1、2、3.....為與表3.2中No.1、2、3對應的時間段圖10本發(fā)明基因藥物注射后大鼠眼壓的比較具體實施例方式實施例1CNP基因的擴增、克隆1材料1.1質(zhì)粒與細胞株l)Lentivectorexpressionsystems(pPACKFlPackagingMix):購自美國SBI公司，由pCDFl-MCS2-EFl-copGFP、pFIV-34N及pVSV-G三個質(zhì)粒一定比例混合而成。2)293FT細胞株來自美國Invitrogen公司，本實驗室保種。1.2工具酶及主要試劑1)TRIZOLReagent、Lipofectamine2000和消化用胰酶(Tyrisin):購自美國Invitrogen公司2)TakaRaOneSt印RNAPCRKit(AMV)和焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC):購自日本TakaRa公司3)質(zhì)粒大抽試劑盒PureYielcTPlasmidMidipr印System:購自美國Promega公司4)限制性核酸內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自美國MBIFermentas公司5)DNA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒EZ-10SpinColumnDNAGelExtractionKit:購自美國BioBasic公司6)大腸桿菌DH5a:購自北京TIANGEN公司7)DNAmarker:購自美國MBIFermentas公司8)RNA酶抑制劑購自日本TaKaRa公司9)dNTP:購自美國Promega公司10)Tryptone、Yeastextract:購自英國0X0ID公司1.3細胞培養(yǎng)試劑l)DEME培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司2)胎牛血清(FBS):購自美國GibicoBRL公司3)胰酶(Trypsin):購自美國GibicoBRL公司4)依地酸二鈉(EDTA):購自美國GibicoBRL公司5)青霉素、鏈霉素為國產(chǎn)注射用藥6)二甲基亞砜(DMSO):購自美國Sigma公司1.4試劑配制1.4.1細菌培養(yǎng)基l)LB液體培養(yǎng)基Bacto-tryptone10g，Yeastextract5g，，NaCl10g，蒸餾水溶解、定容至1000ml，高溫高壓滅菌20min;2)選擇性LB液體培養(yǎng)基臨用前在滅菌后的普通LB液體培養(yǎng)基中加入100mg/ml的氨芐青霉素貯存液，使其終濃度為100g/ml。3)選擇性LB固體培養(yǎng)基在普通LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉(終濃度為1.5%)，滅菌后冷卻至55t:左右時加入氨芐青霉素(終濃度100g/ml)，混勻后倒入己經(jīng)消毒備用的玻璃培養(yǎng)皿，室溫固化后置4t:保存?zhèn)溆谩?.4.2堿裂解法質(zhì)粒抽提試劑1)溶液I:50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)，15psi壓力下滅菌15min，4t:保存；2)溶液II:0.2MNaOH，1%SDS，現(xiàn)用現(xiàn)配;3)溶液III:冰乙酸11.5ml，5M乙酸鉀(KAc)60ml，ddH2028.5ml。1.4.3DNA電泳緩沖液(TAE)1)50X的儲存液pH8.5，Tris堿242g，冰醋酸57.1ml，Na2EDTA_2H2037.2g，加ddH20定容至1L;2)工作液取50X的儲存液100ml加ddH20定容至5L。1.4.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)在800ml蒸餾水中溶解8gNaCl、0.2gKC1、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04，用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4加水定容至1L，高壓下蒸氣滅菌20min，室溫保存。51.4.5細胞培養(yǎng)溶液1)細胞培養(yǎng)基①青霉素及鏈霉素雙抗溶液取青霉素及鏈霉素各100萬單位，無菌操作下溶于40ml三蒸水中，分裝，置-20°C冰箱保存。②DMEM高糖培養(yǎng)基配置10%的胎牛血清加雙抗培養(yǎng)基，置4。C冰箱保存。2)細胞保種液二甲基亞砜與胎牛血清1:9混勻。3)胰蛋白酶/EDTA消化液稱取0.25g胰蛋白酶和0.02gEDTA溶解于100ml的Hank's液，于37oC水浴中置20分鐘，待完全溶解后，以除菌濾器過濾，經(jīng)無菌實驗檢查無菌生長后分裝，置4t:冰箱保存。1.5其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品2實驗方法2.1CNP基因的獲得和擴增2.1.1Norway大鼠腎臟組織總RNA的提取將該步驟所使用的器材預先用0.1%的DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水處理，再按照Invitrogen公司TRIZOL⑧Reagent操作說明進行1)取新鮮正常Norway大鼠腎臟組織約100mg，剪碎后迅速加入液氮研磨；2)加入lmlTRIZOL，繼續(xù)研磨，直到組織完全破碎。3)將上述組織的TRIZ0L裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，在室溫下放置5min;4)在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，蓋上EP管蓋子，用力震蕩15sec，室溫放置3min后，12，000g(4。C)離心15min;5)取上層水相置于新EP管中，再加入0.5ml異丙醇，室溫放置10min，12，000g(4。C)離心10min;6)棄上清，加lml75X乙醇進行洗滌，渦旋混合，7，500g(4t:)離心5min，棄上清；7)讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；8)用100illRnase-freewater溶解RNA沉淀，分裝后置-8(TC冰箱保存?zhèn)溆谩?.1.2擴增CNP基因—、引物設計和合成CNP序列(NM_053750)使用primer5.0軟件設計引物，上游引物引入BamHI酶切位點，序列為CNPF:5'-AGGATCCATCGGCACCATGCA-3'，下游引物引入EcoRI酶切位點序列為CNPR:5'-GGAATTCGCTGCACTAACATC-3'。送上海Invitrogen公司合成。二、擴增CNP基因按TaKaRa試劑盒OneSt印RNAPCRKit(AMV)—步法RT-PCR操作說明進行(該步驟所使用的器材預先用0.1%的DEPC水處理)按下列組成在PCR反應管中配制反應液6Reagent(試齊U)Quantity(用量)10XOnestepRNAPCRbuffer5WMgC12(25mM)10WdNTPmixture(lOmM)5WRNaseInhibitor(40U/l4)1WAMV-OptimizedTaq(5腦)114AMVRTaseXL(5簡)1W上游引物PrimerI(20PM)1Ml下游引物PrimerII(20PM)1Ml腎臟總RNA5WRNasefteeddH2020WTotal50Ml按以下條件在PCR儀進行反應步驟溫度rc)時間(min)循環(huán)次數(shù)逆轉(zhuǎn)錄50301逆轉(zhuǎn)錄酶失活9421變性940.2，退火550.5>35延伸721一最后延伸7251取上述RT-PCR產(chǎn)物5iU，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相保存。三、鑒定擴增的CNP基因根據(jù)CNP序列(GenbankNM_053750)使用primer5.0軟件設計引物，擴增全長CNP基因，RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，結果顯示清晰單一的410bp目的條帶(圖l)，與預期的擴增片段大小完全相符。實施例2構建重組質(zhì)粒lpCDFl-MCS2-EFl-copGFP空載體和CNP基因PCR產(chǎn)物酶切回收分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI進行雙酶切pCDFl-MCS2-EFl-copGFP空載體和CNP基因PCR產(chǎn)物。雙酶切反應體系如下，反應條件為37t:水浴4h。BamHI和EcoRI雙酶切空載體BamHI和EcoRI雙酶切PCR產(chǎn)物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>質(zhì)粒pCDFl-MCS2-EFl-copGFP雙酶切后，O.7%瓊脂糖凝膠電泳30min后，精確切割6749bp所在位置凝膠，然后膠回收。PCR產(chǎn)物雙酶切后，1.5X瓊脂糖凝膠電泳30min后，精確切割410bp所在位置凝膠，然后膠回收。采用BioBasic公司的凝膠回收試劑盒回收酶切后的載體和PCR產(chǎn)物。2構建pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP質(zhì)粒2.1CNP基因與pCDFl-MCS2-EFl-copGFPVector連接膠回收后將CNP和pCDFl-MCS2-EFl-copGFP的回收產(chǎn)物使用promega公司T4DNA連接酶做定向連接反應。將連接產(chǎn)物及陽性對照質(zhì)粒pUC19轉(zhuǎn)化Tiagen公司的感受態(tài)細胞DH5a，過程如下1.取一支-80。C保存的100ii1感受態(tài)細胞DH5a立即置于冰上解凍。2.向感受態(tài)細胞中加入101的連接產(chǎn)物，輕柔吹打混勻后于冰上靜置30分鐘。3.30分鐘后將離心管于42。C水浴鍋中熱擊90秒。4.熱擊后立即將離心管置于冰上靜置5分鐘。5.向離心管中加入9001不含抗生素高壓滅菌的LB培養(yǎng)基，混勻后于搖床中37°C，150rpm恢復培養(yǎng)2小時。6.將高壓滅菌后的固體培養(yǎng)基約100ml重新燒熔，待溫度降至5(TC左右時加入5iU的100mg/ml氨芐青霉素，混勻后倒四個平板。7.將恢復培養(yǎng)的細菌液于4000rpm離心2分鐘，棄上清，留約100y1，吹打混勻后涂在兩個平板上。將PUC19涂一個平板做對照，將滅菌的LB培養(yǎng)基涂一個平板作為陰性對照。在室溫靜置20分鐘，待菌液吸收后于37t:生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。[cmo]8、質(zhì)粒提取將過夜培養(yǎng)的平板取出挑克隆，將菌落置于已加入5iU濃度為100mg/ml氨芐青霉素的5mlLB培養(yǎng)基中，在37t:，280rpm搖床中過夜培養(yǎng)。將菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒，試劑的配制及具體提取方法參考分子克隆手冊。2.3pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP重組質(zhì)粒的鑒定1)酶切初步鑒定按以下配制20iU酶切反應體系，置37°C，5h:Reagent(試齊j)_Quantity(用量)重組質(zhì)粒1lOXBuffer,AI)311ddH201TotalVolume_^質(zhì)粒雙酶切后成為兩個線性片段，分別為410bp和6749bp。取上述酶切產(chǎn)物5iU，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離得到預期的410bp的片段，證明連接產(chǎn)物酶切片段大小正確(圖2)。經(jīng)北京三博遠志公司3730測序儀測序驗證，測序引物為5'-tcgtttagtgaaccgtcagat-3'。序列經(jīng)Blast同源性分析，從第一個方框內(nèi)的起始密碼開始到第二個方框內(nèi)的終止密碼為止，克隆得到的序列與GenbankCNP基因(NM_053750)序列相比僅有一處多態(tài)性改變，即第310位上G—T，但不影響所編碼的氨基酸(丙氨酸)，其他序列完全相同，證明CNP基因克隆成功(圖3)。實施例3慢病毒的包裝經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導的pPACKFlPackagingPlasmidMix和表達質(zhì)粒(空載體pCDFl-MCS2-EFl-copGFP或重組質(zhì)粒pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP)共同轉(zhuǎn)染293FT細胞，包裝病毒。病毒包裝流程圖(圖4)。病毒的收獲、濃縮及滴度的檢測293FT細胞轉(zhuǎn)染后48及72h，收獲培養(yǎng)基上清。經(jīng)離心過濾，去除細胞碎片。然后進行超速離心，將沉淀用PBS重懸，即收獲了濃縮的含重組質(zhì)粒的慢病毒(將連接上CNP基因的pCDFl-MCS2-EFl-copGFPVector包裝進病毒的蛋白質(zhì)包殼)FIV-CNP和含空載體的慢病毒(將未連接CNP基因的pCDFl-MCS2-EFl-copGFPVector包裝進病毒蛋白質(zhì)包殼)病毒儲存液。將FIV-CNP病毒液和FIV-GFP感染293細胞，病毒原液孔幾乎所用細胞均表達GFP，在稀釋至第6孔時綠色熒光細胞的數(shù)量(<5個)，計算病毒滴度107Tu/ml。實施例4重組CNP基因表達檢測—、CNP基因在mRNA水平表達的RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后48h的293細胞收集，用Trizol處理后抽提總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒做逆轉(zhuǎn)錄反應得到cDNA，再以cDNA為模板用RT-PCR方法檢測CNP在mRNA水平上的表達，反應條件為94°C2min;94°C10s，56.8°C30s，72°Clmin(共35個循環(huán))；72°C10min。反應完畢后，在1.5%瓊脂糖凝膠電泳35min同時，用RT-PCR的方法做GAPDH在mRNA水平表達的檢測。如圖5。"圖中泳道依次為100bpMarker、質(zhì)粒陽性對照、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DNAse處理組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組和陰性對照。"二、檢測CNP基因轉(zhuǎn)染后cGMP的表達A、體外表達將普通293細胞均勻種在24孔板上，待細胞貼壁且出現(xiàn)正常形態(tài)后分別做重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，24h后將轉(zhuǎn)染后細胞的培養(yǎng)基移除，每孔加入200ii1濃度為10—3M的:u-HiHiHI4o34S9IBMX(將IBMX溶于DMEM中)，于37°C，5%C02細胞培養(yǎng)箱中孵育40min，移除IBMX，每孔用200ii18%次氯酸，于冰浴裂解細胞40min;每孔加入40y12mol/L的K2C03，混合均勻，然后將細胞裂解物移入干凈無菌的5001離心管中，于3000g離心10分鐘，將上清移入另一干凈無菌的500離心管中，使用放射性免疫試劑盒檢測含目的基因的質(zhì)粒和空載體對cGMP表達的影響，見圖6。(cGMP放射免疫試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學同位素室)含CNP基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞，其cGMP表達顯著增高。B、體內(nèi)表達放射免疫法檢測大鼠睫狀體cGMP水平1、取材于注射病毒后20天，斷頸法處死大鼠(n=6)，摘取眼球，浸入PBS液中。將眼球置于在顯微鏡下，從視神經(jīng)做3條鞏膜放射狀切口，小心取出晶狀體及附著其上睫狀體，并小心剪除附著的視網(wǎng)膜組織，最后將睫狀體剝離，立即放入液氮中保存?zhèn)溆肹5]。2、放射免疫法檢測從液氮中取出睫狀體，放入0.2ml預冷(4度)含lmmol/L的IBMX的50mmol/L醋酸緩沖液中。冰浴下用組織均漿器均漿，取均漿液，用0.2ml無水乙醇洗滌均漿器后，將洗滌液和均漿液混合，靜置5分鐘，3500轉(zhuǎn)/min離心15分鐘，收集上清夜。再用75%乙醇0.2ml清洗離心管內(nèi)沉淀，混均，3500轉(zhuǎn)/min離心15分鐘，將上清夜與第一次收集的上清夜混合，6(TC烘干，稱量使治療組和對照組等量。100醋酸緩沖液溶解烘干等量組織，按放射免疫試劑盒(上海中醫(yī)藥大學同位素室)操作說明檢測。實驗重復兩次。3、放射免疫法檢測大鼠睫狀體cGMP水平結果顯示大鼠玻璃體腔注射病毒后4周，治療組睫狀體cGMP水平升高(1.33±0.29pmol/L)，高于對照組(0.76±0.15pmol/L)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖7)(n=6)。實施例5重組CNP基因藥物的制備本發(fā)明藥物的組成活性物質(zhì)包含pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP基因的慢病毒[OH2]輔料PBS溶液制備成液體注射制劑，規(guī)格l(fTu/ml，分別制備成10ml/支、20ml/支、50ml/支等合適的規(guī)格。實施例6重組pCDFl-MCS2-EFl-copGFP/ratCNP降低小鼠眼壓實驗1實驗材料1.1實驗動物Wistar大鼠購于四川大學實驗動物研究中心。1.2主要試劑放射免疫試劑盒購自上海中醫(yī)藥大學同位素室其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品1.3溶液配制1.3.1中性福爾馬林緩沖液將福爾馬林稀釋于PBSpH7.2，終濃度為10%。1.3.20.02M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2-7.6)NaH2P042H200.449g，Na2HP0412H20，6.76g，NaCl8.74g加ddH20定容至1L，高10壓滅菌。1.3.3TBS:Tris-HCl緩沖液(0.5M，pH7.6)100ml，NaCl8.5g，定容至1000ml。1.3.40.01M枸櫞酸鹽緩沖液(ra6.0)1)儲存液:A液0.1M枸櫞酸鈉，29.41g枸櫞酸鈉溶于1LddH20中;B液0.1M枸櫞酸，20.Olg枸櫞酸溶于1LddH20中。2)工作液取82mlA液和18mlB液，加900mlddH20定容至1000ml，調(diào)整PH值為6.0。1.3.5Mayer，s蘇木精蘇木精lOOmg，蒸餾水100ml，碘酸鈉20mg，硫酸鋁銨5g，擰檬酸lOOmg，水合氯醛5g，用蒸餾水溶解蘇木精后，依次加入碘酸鈉、硫酸鋁銨、檸檬酸和水合氯醛，過濾后存于4t:冰箱備用。1.3.6鹽酸-乙醇分化液濃鹽酸lml，75X乙醇99ml。1.3.7DAB:1)儲備液(DAB25mg/ml):DAB250mg+PBS10ml，待完全溶解后分裝成lml，100iil，50iil，20ii1等，-2(TC，凍存;2)工作液:DAB儲備液20ii1+PBS1000ii1+3%H2025ii1。1.4主要實驗儀器與設備1.4.l眼壓計l)Tonolabtonometer:購自美國ColonialMedicalSupply,Franconia，NH2)微管眼壓測量系統(tǒng)由四川大學物理研究所提供1.4.2眼科手術顯微鏡由六六視覺饋贈2實驗方法按照IACUC(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的操作飼養(yǎng)禾口處理實驗動物。2.1大鼠眼壓測量評估由于嚙齒類動物體積小，精確地測量眼壓非常困難；而大部分眼壓計的設計是用于人或較大動物。因此，精確和方便地測量嚙齒類動物眼壓非常必要。最近，一種專門用于嚙齒類動物的Tonolab眼壓計問世。我們采用Tonolab眼壓計測量Wistar大鼠眼壓，實際眼壓的測量采用微管導入前房的方法。所用的操作在上午10:0011:00完成。結果顯示大鼠眼壓直線回歸系數(shù)為0.99±0.04(n=10)。Tonolab眼壓計讀數(shù)和真實眼壓之間有很好的相關性，Tonolab眼壓計可精確地，非侵襲性地檢測大鼠眼壓(圖8)。2.2大鼠基線眼壓的測量健康成年Wistar大鼠15只，雌雄不拘，體重150_200g。Tonolab眼壓計分別于10:0011:00、12:0013:00、14:0015:00、16:0017:00、18:0019:00、20:0021:00六個時間段，測量大鼠基線眼壓。11結果顯示在測量的6(16)個時段，大鼠眼壓波動于12.6714.20之間(表3.1)。各時間段雙眼眼壓比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.220.94)(表3.2，圖9)。表3.1大鼠右眼和左眼不同時段的眼壓(單位mmHg)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3.2雙眼眼壓在不同時間段的比較(單位mmHg)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.3大鼠玻璃體腔病毒注射上述測量基線眼壓15只Wistar大鼠，麻醉散瞳后，分別用消毒后的10iU(33g)微量推進器吸取FIV-CNP、FIV-GFP各5iil(約5X104個病毒)，選取右眼為治療組，左眼為對照組，針尖斜面朝上，于大鼠眼球上方赤道部(距角鞏膜緣后2mm)斜向后下方進針，從瞳孔直視下觀察針尖避免損傷晶狀體。治療組玻璃體腔內(nèi)注射FIV-CNP5ia，對照組玻璃體腔內(nèi)注射FIV-GFP5iU。術后雙眼涂紅霉素眼膏。2.4病毒注射后大鼠眼壓的測定于病毒注射后，每天觀察大鼠角膜，前房及晶狀體等。涂抗生素眼膏一周。一周后每天同一時間(10:0011:00)采用Tonolab眼壓計測量眼壓，持續(xù)三周后處死大鼠。結果顯示1只大鼠發(fā)生嚴重眼內(nèi)感染，另2只大鼠因注射損傷晶狀體發(fā)生白內(nèi)障，共12只大鼠納入實驗。納入的12只大鼠未見明顯的角膜、前房炎癥反應及其它眼部異常。病毒注射后眼壓比較治療組和對照組的基線眼壓(10:0011:00)分別為12.83±0.42mmHg和12.67±0.26mmHg，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05，n=12)。病毒注射后第11天，治療組眼壓開始下降，與對照組相比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05);第13天開始，治療組眼壓與基線眼壓及對照組眼壓相比，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);之后治療組眼壓持續(xù)下降，穩(wěn)定在一個相對低水平，直至第28天處死。對照組眼壓在病毒注射后第8天開始測量一直較基線眼壓升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在病毒注射后第25天開始，對照組眼壓與基線眼壓相比差別沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，直至第28天處死(表3.3，圖10)。表3.3病毒注射后大鼠眼壓的比較(單位mmHg)天數(shù)樣本數(shù)FIV-CNP組FIV-GFP組尸值01212.83±0.4212.67±0.260.2188d1213.20±0.5213.28±0.55A0.6929d1213.30±0.8413.53±0.86A0.32710d1213.33±1.1513.48±0.69A0.697Ud1212.68±1.1213.52±0.71A0.02212d1212.47±0.9013.67±0.75A0.00713d1211.83±1.13*13.50±0.70A0.00014d1211息0.89*13.40±0.75A0.00015d1211.83±1.18*13.53±0.77AO週16d1211.65±U1*13.50±0.9AO細17d1211.18±0.86*13.37±0.74A0.00018d1211.43±1.01*13.52±0.74A0.00019d1211.30±1.01*13.37±0.90AO細20d1212.03±1.06*13.35±0.74A0.00221d1211.93±0.98*13.48±0.76AO避22d1211.40±0.98*13.25±0.74A0.00123d1211.25±1.09*13.10±0.58AO細24d1211.18±0.86*13.32±0.82A0.00025d1211.27±0.88*12.97±0.43o扁26d1211.17±1.05*12.88±0.57o細27d1211.22±1.00*12.93±0.47o細28d1211.12±0.83*12.82±0.66o細0:基線眼壓；*P<0.05:治療組VS基線眼壓；A:P<0.05:對照組VS基線眼壓綜上，本發(fā)明的重組基因藥物可通過在體內(nèi)表達有活性的CNP，增加細胞cGMP的生成，可有效降低眼壓，且不良反應少，為治療青光眼提供了一種新的用藥途徑，療效持續(xù)，病人依從度好，具有良好的制藥應用前景。序列表SEQUENCELISTING〈110〉四川大學華西醫(yī)院〈120〉一種含利鈉肽基因的藥物及制備方法和應用13〈130>CD520-08P105289〈160>1〈170>PatentInversiori3.2〈210>1〈211>1243〈212>DNA〈213>C型利鈉肽〈400>1cacgctgttttgacctccatag^gattct卿gcccgggcgcgccggatccatcggcac60catgcacctctcccagctgatcgcctgtgccctgctgctcgcgctectctcactccggcc120ctccgaagccaagcccgggaC3CC3CCg皿ggtcccgagaaccccgccagggg郷agct180ggcagagccccaggcagctggtggc皿tcagac皿gactcc郷cggcgg240gggagccaatctcaagggagaccgatcgcgactgcttcgggacctgcgtgtgg3C3CC皿300gtcccgggctgcgtgggctcgccttctgcacgagcacccc皿cgcgcgca360cggc朋c朋g朋gggcttgtcca皿ggctgctttggcctc皿gctggaccggatcggctc420catgagcggtctgggatgtt3gtgC3gCg3attcgcggccgcg皿ggatctgcgatcgct■CCggtgCCCgtcagtgggcagagcgcaratcgcccacagtCCCCg3g皿gttggggggag540gggtcggcaattg雄gggtgcctegag皿ggtggcgcggggt腿ctggg腿gtgatg600tcgtgtectggctccgcctttttcccgagggtggggg卿accgtetete660tcgccgtgaacgttctttttcgc皿cgggtttgccgccag皿C3C3gCtg皿gcttcgag720gggctcgcatctctccttcacgcgcccgccgccctecctgaggccgccatccacgccggt780tgagtcgcgttctgccgcctcccgcctgtggtgcctcctgaactgcgtccgccgtctegg840teagttte朋gctcagtcgagaccgggcctttgtccggcgctcccttggagccteccteg■actcagccggctctccacgctttgctgaccctgcttgctcaactctecgtctttgtttcg960tttctgtctgcgccgtecagatccaagctgtgacggcgctacgctegacgccaccatgga1020g￡lgCg￡lCg￡lgagcggctgccgccatggagatcgagtgccgcatcaacggcacctg皿cgg1080cgtggagttccagctggtgggcggcgg腿aggcacccccCC3gC3gggCcgcctggacc1140cac朋gattg3g朋3gCtC3g郷ctgg皿cgtcagccctacctggctgggacacgtetg1200teacgttcteccttcggagcgctcatctecacagcggtctgga12431權利要求一種重組質(zhì)粒，其特征是含有如SEQIDNO.1的核苷酸序列。2.根據(jù)權利要求1所述的質(zhì)粒，其特征是質(zhì)粒載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒。3.根據(jù)權利要求2所述的質(zhì)粒，其特征是所述載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒。4.根據(jù)權利要求3所述的質(zhì)粒，其特征是所述載體為慢病毒。5.根據(jù)權利要求4所述的質(zhì)粒，其特征是所述載體為pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP慢病毒表達載體。6.—種藥物組合物，其特征是含有權利要求15任一一項所述的重組質(zhì)粒。7.—種制備權利要求6所述藥物組合物的方法，其特征是克隆含有如SEQIDNO.l的核苷酸序列，將其與表達載體鏈接，然后包裝成病毒顆粒，再制備成藥物制劑。8.根據(jù)權利要求7所述的方法，所述表達載體為pCDFl-MCS2-EFl-copGFP-CNP慢病毒表達載體。9.權利要求6所述的組合物在制備治療青光眼藥物中的應用。10.根據(jù)權利要求9所述的應用，所述藥物為注射劑。全文摘要本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，含有如SEQIDNO.1的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有所述的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了該藥物組合物的制備方法和用途。本發(fā)明是采用基因治療的途徑，即將利鈉肽基因慢病毒表達載體導入大鼠玻璃體腔，觀察到目的基因的表達高，有明顯的降低活體動物眼壓的效果，并且不良反應少，成本低廉，效果肯定，為青光眼治療開創(chuàng)新的思路。文檔編號C12N15/861GK101724653SQ200810224249公開日2010年6月9日申請日期2008年10月14日優(yōu)先權日2008年10月14日發(fā)明者劉旭陽,曹桂群,閆乃紅,馬嘉申請人:四川大學華西醫(yī)院