一種靶向肝癌基因治療藥物scrAAV-Kal的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001] 本發(fā)明屬于分子藥物學(xué)和分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,涉及一種自身互補(bǔ)型重組腺相關(guān)病毒載 體和內(nèi)源性血管生成抑制因子基因藥物的制備及應(yīng)用。 技術(shù)背景:
[0002] 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)簡(jiǎn)稱肝癌,是一種高發(fā)病率和 高死亡率的惡性腫瘤疾病,被冠以"癌中王"。根據(jù)2014年2月3日世界衛(wèi)生組織(WHO)表 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),2012年中國新增患者約占全球新增肝癌病例的一半,相應(yīng)的死亡率約占世界范 圍內(nèi)的51%。被批準(zhǔn)上市用于晚期肝癌臨床治療的分子靶向藥物索拉非尼,作為化學(xué)藥物 顯示出巨大的潛力,使晚期肝癌的治療困境得到明顯改善。但是肝癌的發(fā)生是多因素多基 因多途徑交叉對(duì)話復(fù)雜通路調(diào)控的,具體機(jī)制目前仍不明確,針對(duì)某個(gè)單一靶點(diǎn)或信號(hào)通 路治療往往難以遏制腫瘤進(jìn)展。無論是合成的西藥、還是我國的傳統(tǒng)中藥,普遍存在短期有 效、多次用藥、見效緩慢、靶向性差和靶點(diǎn)單一的缺點(diǎn)。因此,尋求通過多靶點(diǎn)、多途徑的抗 腫瘤藥物是當(dāng)前研宄的熱點(diǎn)?;蛑委煹某霈F(xiàn)給肝癌的治療帶來了希望,也給這類疾病的 臨床治療提供了新思路。
[0003] rAAV載體系由細(xì)小病毒家族的腺相關(guān)病毒改造而來,載體因其基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、理 化性質(zhì)穩(wěn)定、宿主范圍廣、在體內(nèi)外長(zhǎng)期高效表達(dá)、免疫原性及遺傳毒性低以及可規(guī)?;?產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),已成為目前基因治療領(lǐng)域中非常有前景的基因病毒載體。截止2015年1月,進(jìn) 入臨床申報(bào)的基因治療有2206項(xiàng),rAAV應(yīng)用于臨床試驗(yàn)的研宄有127項(xiàng),占所有載體的 5. 9% (http://www. abedia. com/wiley/) 〇 2012年,歐盟最終批準(zhǔn)了首個(gè)可以上市的基因 治療藥物Glybera,用于治療一種極其罕見的遺傳性疾病一一脂蛋白脂肪酶缺乏癥(LPLD), 成為基因治療領(lǐng)域的重大推動(dòng)力。此外,與研宄較深入的單鏈AAV2相比,AAV8具有免疫原 性低、肝臟革E向性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),自身互補(bǔ)型AAV(self-complementary AAV,scAAV)是一種自身 互補(bǔ)型腺相關(guān)病毒載體,其基因組本身以雙鏈形式存在,與常規(guī)的單鏈AAV (ssAAV)載體相 比,具有高效快速表達(dá)的特點(diǎn),可以顯著降低在治療過程中其載體本身所誘發(fā)的免疫反應(yīng)。 因而scrAAVS被認(rèn)為是肝臟相關(guān)疾病基因治療最具前景的載體。
[0004] Kallistatin(KAL),一種內(nèi)源性的血管生成抑制因子,不僅能抑制血管生成、血管 舒張,還具有顯著的抗氧化、抗炎癥及抗腫瘤的多重功效。研宄表明,ssrAAV2-KAL可顯著抑 制肝癌的增殖,但由美國賓州大學(xué)主持進(jìn)行的治療血友病的ssrAAV2基因藥物I/II期臨床 研宄卻發(fā)生了嚴(yán)重的細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研宄選取易于定量檢測(cè)的分泌型螢光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)作為報(bào)告基因,以scrAAV2載體作比較,探討scrAAV2/8_KAL在體內(nèi)外對(duì) 肝癌的治療作用,以尋求一種更安全有效、靶向性更強(qiáng)的治療肝癌的基因藥物應(yīng)用于臨床。 該項(xiàng)研宄成果,迄今尚未見有相關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明提供了一種靶向治療肝癌的基因藥物(scrAAV8-KAL)。
[0006] 本發(fā)明提供了 scrAAV8-KAL的制備方法。
[0007] 本發(fā)明提供了基因治療藥物scrAAV8_KAL在制備抗肝癌藥物的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明提供了以所述基因治療藥物scrAAV8-KAL為有效成分與藥學(xué)上可接受的 一種或多種載體組成的藥物組合物。
[0009] 本發(fā)明提供了所述組合物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明主要包括以下步驟:
[0011] (1)載體質(zhì)粒是血清型AAV2的r印基因,AAV8的cap基因。治療基因選擇內(nèi)源性 的血管生成抑制因子Kallistatin(KAL),基因表達(dá)框選擇CB作為啟動(dòng)子,土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄 后基因表達(dá)調(diào)控元件是WPRE。
[0012] (2)三質(zhì)粒磷酸鈣轉(zhuǎn)染法制備scrAAV2/2-Gluc、scrAAV2/8-Gluc作為參比,底物 腔腸素(coelenterazine)檢測(cè)Gluc體外轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,同時(shí)生產(chǎn)基因藥物ssrAAV2/8_KAL、 scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL、scrAAV2/9-KAL ;
[0013] (3)采用MTT法檢測(cè)基因藥物scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL對(duì)細(xì)胞增殖的影響, PI、Dye eFluor670(Ki-67)流式細(xì)胞儀檢測(cè)基因藥物對(duì)細(xì)胞周期、增殖的影響;
[0014] (4)劃痕法、Western Blot和小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯不,scrAAV2/8組可以明顯 抑制SMMC-7721迀移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制HUVEC小管形成能力;
[0015] (5)不同免疫背景小鼠(Balb/c、C57BL/6)體內(nèi)以不同血清型scrAAV-KAL給藥,不 同時(shí)間點(diǎn)小鼠尾靜脈采血,Elisa檢測(cè)血清、組織中KAL表達(dá)量,36周后血清和肝臟中KAL 依然高表達(dá);
[0016] (6)本發(fā)明所述肝癌治療用基因藥物scrAAV2/8-KAL高低劑量,rAAV適用于腹腔 注射、靜脈注射、瘤內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、口服等途徑給藥。scrAAV2/8尾靜脈注射組 的血清以及肝臟內(nèi)KAL表達(dá)量最高,而且呈劑量依賴性。
[0017] (7) Balb/c 小鼠體內(nèi)尾靜脈注射 ssrAAV2/8-KAL、scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL, 2周、6周、12周檢測(cè)組織中KAL的mRNA、蛋白水平表達(dá)量,為進(jìn)一步的人體藥代動(dòng)力學(xué)研宄 提供數(shù)據(jù)。
[0018] (8)體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn),建立H印G2肝癌皮下移植瘤模型,采用瘤內(nèi)注射形式進(jìn)行給 藥,每隔三天觀察記錄腫瘤大小。7周后通過腫瘤體積,重量以及組織中KAL蛋白分布情況, 評(píng)價(jià)scrAAV2/8-KAL的抗腫瘤效果。腫瘤組織免疫組化染色結(jié)果表明,基因藥物對(duì)!fepG2 的增殖侵襲具有抑制作用,scrAAV2/8-KAL作用大于scrAAV2/2-KAL。
【附圖說明】:
[0019] 圖I :ssrAAV和scrAAV載體介導(dǎo)的病毒基因組的元件組成
[0020] 其中:CAG-ssrAAV ;CB-scrAAV.
[0021] 圖2 :不同血清型scrAAV-Gluc在HUVEC、不同肝(癌)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率
[0022] 其中:2DG-scrAAV2/2-Gluc 組;8DG-scrAAV2/8-Gluc.
[0023] 圖3 : scrAAV-KAL選擇性殺傷不同細(xì)胞
[0024] 圖 4 :scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL 抑制細(xì)胞增殖
[0025] 其中:DYE染色組:綠色一正常組;紅色一scrAAV2/2-KAL組;藍(lán) 色一scrAAV2/8-KAL ;黃色一scrAAV2/9-KAL.
[0026] Ki-67 組:藍(lán)色一正常組;紅色一scrAAV2/2-KAL 組;綠色一scrAAV2/8-KAL ;黃 色一scrAAV2/9-KAL.
[0027] 圖 5 :scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL 對(duì)細(xì)胞周期阻滯作用
[0028] 圖6 :scrAAV-KAL抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞的迀移
[0029] 圖7 :scrAAV-KAL抑制SMMC-7721肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
[0030] 圖8 :rAAV-KAL抑制HUVEC細(xì)胞的小管形成
[0031] 其中:a-正常組;b--ssrAAV2/8-KAL 組;c--scrAAV2/2-KAL 組; d-scrAAV2/8-KAL 組;e-scrAAV2/9-KAL.
[0032] 圖9 :不同血清型、給藥途徑、給藥劑量在不同免疫背景小鼠體內(nèi)scrAAV-KAL的體 外長(zhǎng)效表達(dá)
[0033] 其中:a-Balb/c小鼠尾靜脈注射PBS對(duì)照組(NC)、scrAAV2/8_Gluc對(duì)照組 (8DG)、scrAAV2/2-KAL 組(2DK)、scrAAV2/8-KAL 組(8DK) ;b-Balb/c 小鼠尾靜脈注射高 (8DK-H)低劑量組;c-Balb/c小鼠尾靜脈注射(8DK)、肌肉注射組(8DK-M)、腹腔注射組 (8DK-IP)