專利名稱：試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)地均質(zhì)(即非固相)測定樣品中的一或幾種脫氧核糖核苷激酶的試劑盒和方法，其用于診斷疾病、失調(diào)、感染(病毒性和細(xì)菌性)或癌癥。
背景技術(shù)：
脫氧核糖核苷激酶真核細(xì)胞中存在至少三種脫氧核糖核苷激酶，胸苷激酶I和2 (TKl和TK2)、脫氧胞苷激酶(dCK)和脫氧鳥苷激酶(dGK)。存在著編碼兩種不同胸苷激酶的兩種人類基因座?？梢栽诩?xì)胞的胞漿中發(fā)現(xiàn)胸苷激酶。胸苷激酶2定位于線粒體并參與線粒體DNA合成。TK2具有與胸苷激酶I不同的氨基酸序列、底物特異性和表達(dá)譜。從細(xì)胞周期的Gl期末期開始和貫穿S期，胸苷激酶I的活性最為明顯。TK和dCK負(fù)責(zé)通過補(bǔ)救途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞中的TTP和dCTP池。所述TK酶在三磷酸腺苷(ATP)的存在下催化胸苷向單磷酸胸苷(TMP)轉(zhuǎn)化。在整個(gè)細(xì)胞周期都發(fā)現(xiàn)脫氧胞苷激酶的活性，并且主要在淋巴來源的細(xì)胞中鑒定到其活性。TK2定位于線粒體中并與dCK具有對dC幾乎相等的親和力。疾病的診斷在20世紀(jì)80年代早期，表明胸苷激酶活性不僅可以從受各種腫瘤疾病影響的患者的血清中檢測到，而且與健康人類個(gè)體(其中通常表現(xiàn)出非常低的TK活性)有廣泛的差
巳升。目前廣泛接受使用TK作為血液癌癥疾病診斷和預(yù)后的單一腫瘤標(biāo)記物。在某些情況下，TK已顯示出直接的診斷能力。TK和其他脫氧核糖核苷激酶的活性早已與疾病相關(guān)聯(lián)，這由Eriksso等人(2002)和由Topolcan與Holubec (2008)在綜述中有所總結(jié)。已將TK2和線粒體疾病相聯(lián)系。檢測脫氧核糖核苷激酶的測定放射性底物，如3H-胸苷，已被廣泛用于在過濾結(jié)合測定中確定TK和dCK的活性。對于常規(guī)的臨床診斷，基于放射性的測定不是個(gè)有吸引力的選擇。在最近幾年中，已作過幾種嘗試以開發(fā)不基于放射性的測定，所有這些測定在一個(gè)方面或其他方面更好。以下是在不同的脫氧核糖核苷激酶的檢測中所使用的一組方法、測定和試劑組合物。在EP1385005中，提出基于疊氮胸苷(AZT)的競爭性單磷酸化的不基于放射性的TK活性測定。這項(xiàng)技術(shù)已由Diasorin S. r.1.進(jìn)一步開發(fā)成自動的兩步驟的LIAISONS:發(fā)光診斷測定。在該兩步的測定中，首先由樣品中存在的TK將AZT磷酸化為單磷酸化的AZTMP。接著從綴合至異氨基苯二酰肼(AZTMP ABEI)的AZTMP檢測發(fā)光，所述綴合至異氨基苯二酰肼的AZTMP與固體表面底物上的TK磷酸化AZTMP競爭結(jié)合抗AZTMP抗體。該兩步驟測定的主要缺點(diǎn)是動態(tài)讀取受限。另一缺點(diǎn)是使用修飾的核苷底物代替天然的胸苷。
在W02009/063254中公開了通過使用單磷酸化的Br_dU的用于確定樣品中TK活性的半均質(zhì)方法，所述單磷酸化的Br-dU通過HPLC分離并通過UV檢測。該方法的缺點(diǎn)是用修飾的底物進(jìn)行所述反應(yīng)和以分離步驟進(jìn)行檢測。US2008/248472公開了固相測定，其通過試劑混合物中的脫氧核糖核苷激酶互補(bǔ)樣品中TK活性以產(chǎn)生Br-dUTP (天然TTP的衍生物)。隨后使用RNA依賴的DNA聚合酶通過引物延伸摻入所述Br-dUTP。固相結(jié)合的RNA模板由單體rA建成，長200-400個(gè)單體，并被連至固相。在ELISA中使用堿性磷酸酶綴合的抗[Br]dU抗體在第二步驟檢測摻入的[Br]U來最終確定TK活性。用許多手動交互步驟進(jìn)行這個(gè)兩步驟的測定是繁瑣的并且執(zhí)行所述測定花費(fèi)過長的時(shí)間。尚未提出用于測量樣品中dCK活性的可靠的檢測。附圖簡述

圖1顯示了產(chǎn)生TTP和dCTP的補(bǔ)救途徑圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法的檢測系統(tǒng)2的原理圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法的檢測系統(tǒng)3的原理圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法的檢測系統(tǒng)I的原理圖5通過實(shí)時(shí)熒光捕獲獲得的熒光曲線獲得實(shí)施例3的hrTKl標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的閾值水平
Cto 圖6實(shí)施例3的hrTKl標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的平均Ct值在對數(shù)標(biāo)度上的線性回歸。圖7實(shí)施例4的hrdCK標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的平均Ct值在對數(shù)標(biāo)度上的線性回歸。圖8實(shí)施例7多重hrTKl與hrdCK在對數(shù)標(biāo)度上的線性回歸。圖9犬血清樣品中的TKl測量和實(shí)施例8中使用的hrTKl標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)在對數(shù)標(biāo)度上的線性回歸。圖10通過實(shí)時(shí)熒光捕獲獲得的線性歸一化的熒光曲線獲得實(shí)施例9的閾值水平
Cto 圖11實(shí)施例9的致病性犬血清和hrTKl標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的平均Ct值在對數(shù)標(biāo)度上的線性回歸。圖12通過實(shí)時(shí)熒光捕獲獲得的線性和動態(tài)管歸一化的熒光獲得實(shí)施例10的閾值水平Ct。圖13實(shí)施例10的hrTKl標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的平均Ct值在對數(shù)標(biāo)度上的線性回歸。定義本說明書中的所有術(shù)語和詞語應(yīng)當(dāng)按照其正常含義和在相關(guān)領(lǐng)域中的使用來解釋。為了明確起見，以下更具體地討論一些術(shù)語。除非另有說明，在整個(gè)發(fā)明中互換地使用胸苷和脫氧胸苷。坦JIli定是非固相測定，其在延伸引物-模板系統(tǒng)時(shí)產(chǎn)生信號，需要最少的引物延伸后操作。這些測定無需分離步驟。所述反應(yīng)完全在溶液中發(fā)生，沒有珠或固相附著干擾低親和力的相互作用。均質(zhì)測定方法對藥物發(fā)現(xiàn)中所需的通量和測定小型化是必要的。在任何均質(zhì)測定中，在測量過程中存在所述測定的所有組分。排除分離步驟是這些測定方法的主要優(yōu)點(diǎn)，但由于測定成分的非特異性測量這也存在困難(來源http://WWW.genomicglossaries. com/content/Assays. asp, 2010 年 4 月 28 日檢索)。
脫氧核糖核苷是包括連接至五碳糖脫氧核糖的含氮堿基的分子。脫氧核糖核苷通常被簡單地稱為結(jié)合至脫氧核糖的堿基。天然的脫氧核糖核苷被定義為未修飾的脫氧核糖核苷。這些的實(shí)例包括胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、胸苷和肌苷。天然的脫氧核糖核苷是在野生型活生物體(如人類)中存在的形式的脫氧核糖核苷。修飾的脫氧核糖核苷也稱為核苷類似物，是在葡基胺或核酸堿基(nucleobase)上有任何種類修飾的脫氧核糖核苷。在醫(yī)藥中，幾種核苷類似物用作抗病毒劑或抗癌劑。修飾的脫氧核糖核苷的實(shí)例是疊氮胸苷(AZT)、溴-脫氧尿苷(Br-dU)、碘-脫氧尿苷、乙烯基-脫氧胸苷和氟-脫氧尿苷。 DNA依賴性DNA聚合酶是催化脫氧核糖核苷三磷酸以單鏈DNA為模板組裝為脫氧核糖核酸的酶。在一些文獻(xiàn)中，DNA依賴性DNA聚合酶也可稱為DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。DNA依賴性DNA聚合酶可以具有三種不同的酶活性(a)5’至3’聚合酶活性,在模板DNA指導(dǎo)下催化由脫氧核糖核苷5’ -三磷酸產(chǎn)生的單核苷酸單元添加至引物鏈的3’ -羥基末端；(b)僅在雙鏈體DNA上的5’至3’核酸外切酶的活性；(c)主要在單鏈DNA上有活性的3’至5’核酸外切酶，其可以選擇性地去除不匹配的末端核苷酸。注意除DNA聚合酶I外,Taq DNA聚合酶和來自Thermus thermof ilus的Tth聚合酶是至今鑒定的僅有的具有5’ 一3’核酸外切酶活性的DNA依賴性聚合酶。DNA樽板分子是作為DNA依賴性DNA聚合酶的模板的ssDNA分子。DNA引物分子是短的DNA分子，其與DNA模板分子的區(qū)段互補(bǔ)并作為DNA依賴性DNA聚合酶的DNA聚合的引物。`完整的形式當(dāng)本發(fā)明中所使用的DNA探針是根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的任何聚合酶反應(yīng)之前的形式時(shí)，稱其為完整的形式。補(bǔ)救合成涂徑示于圖1，是合成TTP和dCTP的途徑之一。TTP和dCTP是胸苷和脫氧胞苷的相應(yīng)的脫氧核糖核苷三磷酸。這些首先通過在脫氧核糖核苷激酶的幫助下從例如ATP轉(zhuǎn)移一個(gè)磷酸基團(tuán)(會產(chǎn)生相應(yīng)的單磷酸TMP或dCMP)來產(chǎn)生。dTMP激酶和胞嘧啶核苷酸(cytidylate)激酶催化形成相應(yīng)的二磷酸核苷,TDP和dCDP。核苷二磷酸激酶轉(zhuǎn)變二磷酸鹽為最終的三磷酸核苷。RNA依賴性DNA聚合酶是催化脫氧核糖核苷三磷酸在第一鏈合成過程中以單鏈RNA為模板組裝為脫氧核糖核酸的酶。所用的縮寫ATP 腺苷5’ -三磷酸AZTMP疊氮-胸苷單磷酸BrdU 溴脫氧尿苷dCDP 脫氧胞苷二磷酸dCK 脫氧胞苷激酶EC 2. 7.1. 21 ；ATP:胞苷_5’ -磷酸轉(zhuǎn)移酶dCMP 脫氧胞苷單磷酸dCMPK胞嘧啶核苷酸激酶EC 2. 7. 4. 14 ；ATP:dCMP磷酸轉(zhuǎn)移酶
dsDNA 雙鏈 DNAhrdCK人重組脫氧核糖核苷激酶hrTKl人重組胸苷激酶IMMX MasterMix [無樣品的試劑混合物]NdPK 核苷二磷酸激酶EC 2. 7. 4. 6 ；ATP:核苷二磷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶hrTKl人重組胸苷激酶IssDNA 單鏈 DNATDP 脫氧胸腺嘧啶二磷酸TK 胸苷激酶EC 2. 7.1. 21 ；ATP:胸苷_5’ -磷酸轉(zhuǎn)移酶TMPK dTMP 激酶EC 2. 7. 4. 9 ；ATP: TMP 磷酸轉(zhuǎn)移酶TMP 脫氧胸苷單磷酸發(fā)明概述 本發(fā)明旨在提供用于檢測脫氧核糖核苷激酶活性的通用的和改進(jìn)的方法和試劑盒。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)仍有基于活性的脫氧核糖核苷激酶活性測定試劑盒和方法的需要，所述試劑盒和方法不僅可以檢測樣品中的TK，也可以用于dCK測試(例如在癌癥治療中監(jiān)測藥物抗性的發(fā)展)，并且其在性能上是穩(wěn)健的、快速、簡單、用戶友好而且對臨床使用是安全的。使用dCK作為診斷工具用于癌癥疾病管理尚未發(fā)現(xiàn)其臨床應(yīng)用。然而，在癌癥治療中使用的幾種核苷類似物(例如阿糖胞苷和較新的吉西他汀)是由dCK活化的，因此找到用于簡單的確定抗性發(fā)展的有效的解決是最重要的，因?yàn)橐阎剐耘cdCK缺乏相聯(lián)系。本發(fā)明在權(quán)利要求中總結(jié)。發(fā)明詳述Taq DNA聚合酶是來自嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)的DNA依賴性DNA聚合酶。Taq聚合酶(或簡單地Taq)具有65_75°C的最佳溫度區(qū)間。所述Taq DNA聚合酶也具有5’至3’核酸酶活性。出乎意料地發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶在37°C下對于引物延伸和5’至3’核酸酶活性的剩余活性足以從熒光雙重標(biāo)記的探針(其一標(biāo)記轉(zhuǎn)移其能量(猝滅)至以熱而不是光釋放能量的另一標(biāo)記)釋放5’結(jié)合的熒光標(biāo)記物。與之前提出的對脫氧核糖核苷激酶的檢測方法相比，因此可以實(shí)時(shí)地測量脫氧核糖核苷激酶的活性而不是確定終點(diǎn)的酶活性。核酸擴(kuò)增測定系統(tǒng)中的實(shí)時(shí)檢測除具有提高的靈敏度外，還具有快速、提高的分辨率和更好的精度的優(yōu)點(diǎn)。也認(rèn)為對均質(zhì)脫氧核糖核苷激酶活性測定來說，為了與目前市場上的測定競爭，它必須能夠從健康的志愿者(如0. 5U/1-7U/1)中從測定開始的5小時(shí)內(nèi)測量這些活性。在之前的嘗試中，使用Taq DNA聚合酶在37°C下引物延伸和5’ -核酸酶反應(yīng)不幸地沒有獲得結(jié)果。因此，認(rèn)為并假設(shè)所述Taq DNA聚合酶的引物延伸反應(yīng)和5’核酸酶反應(yīng)可以被大腸桿菌的DNA依賴性DNA聚合酶I的相同的活性所替代，從而保持均質(zhì)測定的實(shí)時(shí)方面。令人失望的是不能使用該DNA聚合酶I，因?yàn)樵撁阜翘禺惖蒯尫?’結(jié)合的熒光團(tuán)。因此，再次認(rèn)為對兩種反應(yīng)只使用一種孵育溫度的真正的實(shí)時(shí)方法必須被放棄而用兩步驟的改變溫度的方法代替，即(1)11^或(10^的產(chǎn)生必須在371下發(fā)生，(2)所述引物延伸以及5’-核酸酶熒光團(tuán)的釋放必須在更高的溫度下(例如在51°C下)孵育以支持Taq DNA聚合酶的活性。期望這能工作，因?yàn)樗鯰aq DNA聚合酶在51°C下應(yīng)當(dāng)保留其最高活性的大約40%。此外，認(rèn)為應(yīng)當(dāng)保留其工業(yè)實(shí)用性，因?yàn)橥ㄟ^編程實(shí)時(shí)PCR儀器來執(zhí)行溫度改變，可以使得溫度改變的兩步驟測定對測試供應(yīng)商和操作者來說是不可見的。所以首先構(gòu)建引物-模板-探針系統(tǒng)以協(xié)調(diào)至用于51°C下雜交的最佳熱力學(xué)特性?？紤]到MgCl2的濃度，計(jì)算所述探針的Tm將達(dá)到69°C。在第一個(gè)嘗試中僅測量TK活性，令人驚訝的是37°C溫育步驟已產(chǎn)生釋放的和歸一化的熒光的好的線性圖，其來自所包括的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，即分別來自2000pg、200pg、20pg和2pg hrTKl的活性。獲得0. 9669的R2值。來自51°C反應(yīng)的釋放的和歸一化的熒光的線性圖甚至更差，不過仍然可讀。因此，得出的結(jié)論是用于檢測樣品中TK的可能的實(shí)時(shí)測定方法近在咫尺。更令人驚訝的是第一個(gè)實(shí)驗(yàn)指示在Ih內(nèi)測量低至從正常的健康志愿者的血清樣品中發(fā)現(xiàn)的TK活性的可能性。這代表從最初的初步說明改進(jìn)了 4h。所述hrTKl的比活性評估為2.1 ii mol/min/mg。該測定只保留描述實(shí)時(shí)PCR的線性和平穩(wěn)(飽和)階段。在37°C下實(shí)時(shí)檢測TK活性的驚人效果直接解決與兩步驟溫度改變方法相關(guān)的其他兩個(gè)問題。第一，TK顯示特征性的TTP抑制。這可能使兩步驟測定難以對含有高TK活性的樣品進(jìn)行，即需要稀釋步驟。現(xiàn)在可以將其省略，因?yàn)樗a(chǎn)生的TTP或dCTP持續(xù)地被所述Taq DNA聚合酶通過將TTP或dCTP摻入引物-模板系統(tǒng)來去除。第二，Taq DNA聚合酶在較高溫度(如51°C)下的非常高的聚合速率(在72°C下35-100nt每秒)可能引起在實(shí)時(shí)解析測定結(jié)果的一些嚴(yán)重的問題，因?yàn)檩^高的TK活性值(甚至低至10U/1)會從測定開始的幾分鐘內(nèi)顯現(xiàn)從而嚴(yán)重地限制分辨率。同時(shí)，由于信號分辨率的需要而僅可 以使用有限量的Taq DNA聚合酶U/反應(yīng)，健康志愿者的活性在能檢測到信號前可能需要幾小時(shí)?？傊_了非顯而易見的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在可以將其變?yōu)橛糜跈z測脫氧核糖核苷激酶活性的工業(yè)可應(yīng)用的測定和方法，圖5。在隨后的實(shí)驗(yàn)中(實(shí)施例3)驗(yàn)證了所述測定的靈敏度。總之，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)天然的底物胸苷(T)和/或脫氧胞苷(dC)或其混合物，和DNA依賴性DNA聚合酶是測量脫氧核糖核苷激酶(如TK或dCK)催化濃度所需要的必要的試劑。這可以在含有用于TK或dCK活性測定的其他已知組分的均質(zhì)混合物中進(jìn)行。通過用反應(yīng)混合物中存在的其他核苷激酶(如dTMP激酶或胞嘧啶核苷酸激酶)和核苷二磷酸激酶的活性互補(bǔ)樣品中的TK或dCK催化活性，使得該測定性能穩(wěn)健、操作快速和簡單并且在臨床上是安全的。這些試劑可以方便地納入試劑盒和緩沖液中，用于產(chǎn)生TTP或dCTP，伴隨使用引物-模板-檢測物(detector)系統(tǒng)的引物延伸，各自有固定的濃度。在本文的剩余部分中，無樣品的反應(yīng)混合物中的試劑稱為母液混合物(master mix),縮寫為MMX。在MMX中也可以包括DNA依賴性DNA聚合酶。表I總結(jié)了用于測定脫氧核糖核苷激酶的方法的試劑盒組分的現(xiàn)有技術(shù)情況?？傊?，之前的脫氧核糖核苷激酶試劑盒權(quán)利要求沒有包括DNA依賴性DNA聚合酶和天然的T和/或dC底物或其混合物，或其使用方法。表1:現(xiàn)有技術(shù)試劑盒組分與本發(fā)明比較
權(quán)利要求
1.包含DNA依賴性DNA聚合酶和至少一種天然的脫氧核糖核苷的試劑盒。
2.包含DNA依賴性DNA聚合酶和檢測系統(tǒng)的試劑盒，所述檢測系統(tǒng)包含DNA模板分子、DNA引物分子和熒光部分，所述熒光部分能夠從所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA中被置換出或結(jié)合至所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA。
3.權(quán)利要求1或2的試劑盒，還包含至少一種磷酸轉(zhuǎn)移酶。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的試劑盒,還包括至少一種天然的或修飾的脫氧核糖核苷。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述至少一種天然的脫氧核糖核苷選自脫氧胸苷和/或脫氧胞苷或其混合物。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述至少一種修飾的脫氧核糖核苷選自修飾的胸苷和修飾的胞苷，例如BrdU和/或IdU,或其混合物。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述熒光部分偶聯(lián)至單鏈DNA探針。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述熒光部分和一猝滅部分偶聯(lián)至單鏈DNA探針。
9.權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述熒光部分是雙鏈DNA表面結(jié)合或嵌入分子，例如 PicoGreeruEva 染料或 SYBR GreenI。
10.權(quán)利要求7或8的試劑盒，其中結(jié)合至所述單鏈DNA探針的熒光部分在所述探針處于其完整形式時(shí)是猝滅的。
11.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述DNA依賴性DNA聚合酶具有5’至3’核酸外切酶活性，例如Taq DNA聚合酶或Tth聚合酶。
12.權(quán)利要求7或8的試劑盒，其中結(jié)合至所述單鏈DNA探針的熒光部分當(dāng)處于其完整形式并雜交至其靶模板時(shí)達(dá)到最大熒光。
13.用于測量樣品中脫氧核糖核苷激酶活性的方法，其特征在于a.使樣品在容器中與反應(yīng)混合物接觸，所述反應(yīng)混合物包含DNA依賴性DNA聚合酶、至少一種脫氧核糖核苷和檢測系統(tǒng)，所述檢測系統(tǒng)包含DNA模板分子、DNA引物分子和熒光部分，所述熒光部分能夠摻入所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA、從所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA中被置換出或結(jié)合至所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA ；b.孵育所述容器；c.測量來自所述熒光部分的信號；d.使來自所述熒光部分的信號與所述樣品中的脫氧核糖核苷激酶活性相關(guān)聯(lián)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述至少一種脫氧核糖核苷是天然的或修飾的脫氧核糖核苷或其混合物。
15.權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種天然脫氧核糖核苷選自脫氧胸苷和/或脫氧胞苷或其混合物。
16.權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)的方法,其中所述至少一種修飾的脫氧核糖核苷選自修飾的胸苷和修飾的胞苷，例如BrdU和/或IdU,或其混合物。
17.權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述熒光部分偶聯(lián)至單鏈DNA探針。
18.權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)的方法，其中所述熒光部分和一猝滅部分偶聯(lián)至單鏈DNA探針。
19.權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述熒光部分是雙鏈DNA表面結(jié)合或嵌入分子，例如 PicoGreen、Eva 染料或 SYBR Green I。
20.權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)的方法，其中結(jié)合至所述單鏈DNA探針的熒光部分在所述探針處于其完整形式時(shí)是猝滅的。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述DNA依賴性DNA聚合酶具有5’至3’核酸外切酶活性，例如Taq DNA聚合酶或Tth聚合酶。
22.權(quán)利要求17或18的方法，其中結(jié)合至所述單鏈DNA探針的熒光部分當(dāng)處于其完整形式并雜交至其靶模板時(shí)達(dá)到最大熒光。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含DNA依賴性DNA聚合酶和至少一種天然的脫氧核苷的試劑盒，并涉及包含DNA依賴性DNA聚合酶和檢測系統(tǒng)的試劑盒，所述檢測系統(tǒng)包含DNA模板分子、DNA引物分子和熒光部分，所述熒光部分能夠被置換出或能夠結(jié)合至所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA。其還涉及用于測量樣品中脫氧核糖核苷激酶活性的方法，其特征在于；(i)使樣品在容器中與反應(yīng)混合物接觸，所述反應(yīng)混合物包含DNA依賴性DNA聚合酶、至少一種脫氧核糖核苷和檢測系統(tǒng)，所述檢測系統(tǒng)包含DNA模板分子、DNA引物分子和熒光部分，所述熒光部分能夠摻入所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA、從所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA中被置換出或結(jié)合至所述DNA依賴性聚合酶合成的dsDNA；(ii)孵育所述容器；(iii)測量來自所述熒光部分的信號；和使來自所述熒光部分的信號與所述樣品中的脫氧核糖核苷激酶活性相關(guān)聯(lián)。
文檔編號C12N9/12GK103038361SQ201180024021
公開日2013年4月10日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者P·斯托爾漢德斯克, J·倫納斯特蘭德 申請人:P·斯托爾漢德斯克, J·倫納斯特蘭德