本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)和基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體是一種新型的用于15種人乳頭瘤病毒亞型分型的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)屬于乳頭瘤病毒科，是一種小分子的、無被膜包被的環(huán)狀雙鏈dna病毒，基因組長約8000堿基對(duì)(bp)，分為3個(gè)功能區(qū)，即早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(e區(qū))、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(l區(qū))和非轉(zhuǎn)錄區(qū)(長控制區(qū)，lcr)。人乳頭瘤病毒通過直接或間接接觸污染物品或性傳播感染人類。該病毒不但具有宿主特異性，而且具有組織特異性，只能感染人的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞，引起人類皮膚的多種乳頭狀瘤或疣及生殖道上皮增生性損傷。

對(duì)于感染生殖道和肛門的人乳頭瘤病毒，根據(jù)各基因型別致病力大小或致癌危險(xiǎn)性大小可分為低危型和高危型兩大類。在有性生活史的女性中生殖道人乳頭瘤病毒感染具有普遍性，據(jù)統(tǒng)計(jì)70％～80％的女性在其一生中會(huì)有至少一次的人乳頭瘤病毒感染，但大多數(shù)感染為自限性，超過90％的感染的女性會(huì)出現(xiàn)一種有效的免疫應(yīng)答，在沒有任何長期的健康干預(yù)時(shí)在6到24個(gè)月之間可以清除感染。而持續(xù)性的高危型人乳頭瘤病毒感染則是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的主要原因。全球范圍的研究結(jié)果顯示，在99.7％的宮頸癌患者體內(nèi)檢測(cè)到高危型人乳頭瘤病毒dna的存在，其中人乳頭瘤病毒16型、18型、45型和31型感染占80％。低危型人乳頭瘤病毒一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān)，極少引起浸潤癌。國家cfda也已經(jīng)頒布了人乳頭瘤病毒(hpv)核酸檢測(cè)及基因分型試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則，說明人乳頭瘤病毒檢測(cè)具有十分重要的臨床意義。

根據(jù)hpv的同源性，已發(fā)現(xiàn)120多種型別。目前，市場(chǎng)上已經(jīng)存在一些對(duì)人乳頭瘤病毒進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，但是這些試劑盒通常是借助于熒光或者膜雜交的方式完成檢測(cè)。

納米金探針法區(qū)分不同亞型的病毒的步驟主要有以下三個(gè)階段，而這三個(gè)階段均是在同管閉管條件下完成的。第一階段：模板擴(kuò)增，通過引物對(duì)、擴(kuò)增酶的參與，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)模板的高靈敏擴(kuò)增；第二階段：通過探針和內(nèi)切酶的參與，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)模板向信號(hào)分子的的高效率轉(zhuǎn)化；第三階段：通過納米金探針實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)分子的高分辨識(shí)別。但由于涉及到多種型別的區(qū)分，檢測(cè)時(shí)復(fù)雜，耗時(shí)耗力。

同時(shí)，市場(chǎng)上尚沒有將數(shù)學(xué)排列組合的算法與納米金探針法檢測(cè)方法相結(jié)合的人乳頭瘤病毒分型方法，只需要普通的pcr循環(huán)儀器就能以較少的管數(shù)分型更多的人乳頭瘤病毒亞型數(shù)，如以6管檢測(cè)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)15種亞型的人乳頭瘤病毒分型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的提供一種15種hpv亞型的分型試劑盒和分型方法，其為將數(shù)學(xué)排列組合的算法與納米金探針法檢測(cè)方法相結(jié)合，在無需增加通量的情況下、實(shí)現(xiàn)以較少的檢測(cè)反應(yīng)管數(shù)(6管)區(qū)分15種的hpv亞型，這一方式在分型數(shù)量越多時(shí)所起到的作用就越顯著。

實(shí)現(xiàn)以上目的的技術(shù)方案如下。

一種15種hpv亞型的分型試劑盒，包括以下至少5個(gè)檢測(cè)管，其中，

第一管包含有對(duì)應(yīng)的檢測(cè)引物和針對(duì)5種型號(hào)的探針；

第二管包含有對(duì)應(yīng)的檢測(cè)引物和針對(duì)4種型號(hào)的檢測(cè)探針，第二管中所針對(duì)的探針的型號(hào)只有一種與第一管中的型號(hào)相同；

第三管包含有對(duì)應(yīng)的檢測(cè)引物和針對(duì)5種型號(hào)的探針，第三管中所針對(duì)的檢測(cè)探針的型號(hào)只有一種與第一管中的型號(hào)相同，且只有一種與第二管中的型號(hào)相同；

第四管包含有對(duì)應(yīng)的檢測(cè)引物和針對(duì)5種型號(hào)的檢測(cè)探針，第四管中所針對(duì)的檢測(cè)引物和探針的型號(hào)只有一種與第一管中的型號(hào)相同，且只有一種與第二管中的型號(hào)相同，且只有一種與第三管中的型號(hào)相同；

第五管包含有對(duì)應(yīng)的檢測(cè)引物和針對(duì)5種型號(hào)的檢測(cè)探針，第五管中所針對(duì)的檢測(cè)探針的型號(hào)只有一種與第一管中的型號(hào)相同，只有一種與第三管中的型號(hào)相同，且只有一種與第四管中的型號(hào)相同。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括有第六管，所述第六管包含對(duì)應(yīng)的檢測(cè)引物和針對(duì)陽性對(duì)照的檢測(cè)探針。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述15種hpv亞型為6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、和58。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第一管包含11、16、31、35、43的檢測(cè)探針；第二管包含6、16、52、53的檢測(cè)探針；第三管包含31、33、45、52、58的檢測(cè)針；第四管包含35、39、42、53、58的檢測(cè)探針；第五管包含18、39、43、45、56的檢測(cè)探針；第六管包含陽性對(duì)照，為β-actin的檢測(cè)引物和探針；或者所述第一管包含6、33、35、42、52的檢測(cè)探針；第二管包含11、35、43、53的檢測(cè)探針；第三管包含18、33、53、56、58的檢測(cè)針；第四管包含31、39、43、52、58的檢測(cè)探針；第五管包含16、31、42、45、56的檢測(cè)探針；第六管包含陽性對(duì)照，為β-actin的檢測(cè)引物和探針。

本發(fā)明所述分型試劑盒和檢測(cè)方法，利用了一種對(duì)設(shè)施條件要求低、結(jié)果判讀簡單、成本低廉的新型體外診斷方法(納米金可視化檢測(cè)方法)，將數(shù)學(xué)排列組合的數(shù)學(xué)模型與體外診斷方法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了高靈敏、低成本、閉管且簡便的人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)。

本發(fā)明具有以下有益效果：

采用本發(fā)明中人乳頭瘤方法實(shí)現(xiàn)了不同學(xué)科的交叉，將數(shù)學(xué)排列組合的數(shù)學(xué)模型與體外診斷方法相結(jié)合實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏、低成本且簡便的人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)。不僅整個(gè)檢測(cè)無需使用熒光探針，試劑存放無需避光，不必?fù)?dān)心熒光衰減的問題，因此存放條件更加穩(wěn)定。

利用本發(fā)明中的分型方法和分型試劑盒能夠在不增加檢測(cè)反應(yīng)通量的情況下，實(shí)現(xiàn)以較少的檢測(cè)反應(yīng)管數(shù)區(qū)分15種人乳頭瘤病毒亞型，降低了操作的復(fù)雜度和檢測(cè)成本。

附圖說明

下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，不用于限定有權(quán)利要求所界定的本發(fā)明范圍。

圖1是實(shí)施例1中15種hpv亞型的分型試劑盒各管中亞型分布的示意圖。

圖2是實(shí)施例2中6管檢測(cè)反應(yīng)區(qū)分15乳頭瘤病毒亞型的檢測(cè)特異性結(jié)果。

圖3是實(shí)施例3中6管檢測(cè)反應(yīng)區(qū)分15種人乳頭瘤病毒亞型的檢測(cè)靈敏度結(jié)果。

圖4是實(shí)施例4中6管檢測(cè)反應(yīng)區(qū)分15種人乳頭瘤病毒亞型的檢測(cè)結(jié)果。

圖5實(shí)施例5中6管反應(yīng)區(qū)分15種人乳頭瘤病毒亞型組合方式。

圖6是實(shí)施例5中6管反應(yīng)區(qū)分15種人乳頭瘤病毒亞型的檢測(cè)樣本結(jié)果。

具體實(shí)施方式

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

本發(fā)明所述的一種新型人乳頭瘤病毒亞型分型方法，通過一種特定的數(shù)列組合，實(shí)現(xiàn)以最少的管數(shù)盡可能多的分型人乳頭瘤病毒亞型。借助于一種定性的納米金探針法檢測(cè)方法，將這種數(shù)學(xué)排列組合算法與分子診斷技術(shù)相結(jié)合，在不增加檢測(cè)反應(yīng)通量的情況下，實(shí)現(xiàn)以最少的反應(yīng)管數(shù)區(qū)分更多的人乳頭瘤病毒亞型，以降低檢測(cè)操作難度和檢測(cè)成本。這一方式在分型數(shù)量越多時(shí)所起到的作用就越顯著。

以6管區(qū)分15亞型的人乳頭瘤病毒為例，對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)原理進(jìn)行描述。對(duì)于待檢測(cè)的15亞型人乳頭瘤病毒，其中，人乳頭瘤病毒亞型可以是以下亞型6、11、16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82、40、42、43、54、61、70、72、81、55、62、64、67、69、71、73、83、84中的任意15種。

實(shí)施例115種hpv亞型的分型試劑盒

本實(shí)施例選擇其中6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15種亞型。

本實(shí)施例所述15種hpv亞型的分型試劑盒，包括有以下五個(gè)檢測(cè)管一個(gè)對(duì)照管，其中，

第一管包含有5種型號(hào)的檢測(cè)引物和探針，具體為包含11、16、31、35、43的檢測(cè)探針；第二管包含有4種型號(hào)的檢測(cè)引物和探針，第二管中所針對(duì)的檢測(cè)探針的型號(hào)只有一種與第一管中的型號(hào)相同，具體為第二管包含6、16、52、53的檢測(cè)探針；

第三管包含有5種型號(hào)的檢測(cè)引物和探針，第三管中所針對(duì)的檢測(cè)探針的型號(hào)只有一種與第一管中的型號(hào)相同，且只有一種與第二管中的型號(hào)相同，具體地，第三管包含31、33、45、52、58的檢測(cè)探針；

第四管包含有5種型號(hào)的檢測(cè)引物和探針，第四管中所針對(duì)的檢測(cè)探針的型號(hào)只有一種與第一管中的型號(hào)相同，且只有一種與第二管中的型號(hào)相同，且只有一種與第三管中的型號(hào)相同，具體為第四管包含35、39、42、53、58的檢測(cè)探針

第五管包含有5種型號(hào)的檢測(cè)引物和探針，第五管中所針對(duì)的檢測(cè)探針的型號(hào)只有一種與第三管中的型號(hào)相同，且只有一種與第四管中的型號(hào)相同，具體為第五管包含18、39、43、45、56的檢測(cè)探針；

第六管包含陽性對(duì)照，為β-actin的檢測(cè)引物和探針，針對(duì)樣本中的β-actin基因模板。具體請(qǐng)參見圖1。

所述六管檢測(cè)引物和6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15種亞型的檢測(cè)探針如下：

名稱序列(5’→3’)

管1引物組合

f1actgtggtagataccacmcgyagtacmaayatgwcseqidno.1

r1cataattgaaaaataaaytgtaaatcrwaytcytcseqidno.2

管2引物組合

f2actgtggtagataccacccgtagtacyaacwtkacseqidno.3

r2cataattgaaaaataaattgyamatcataytcytcseqidno.4

管3引物組合

f3actgtggtagataccacymgwagtacwaayttaacseqidno.5

r3cataattgaaaaataaaytgyarwtcataytcttcseqidno.6

管4引物組合

f4actgtggtagataccacyagraryachaacatgacseqidno.7

r4cataattgaaaaataaaytgtarttcatattcctcseqidno.8

管5引物組合

f5actgtggtagataccactcscagyaccaatytwwcseqidno.9

r5cataattgaaaaataaaytgcaaatcawattcctcseqidno.10

管6引物組合

f7ctgctgctatgcctcat；seqidno.11

r7tagaggacaaacgggcaacat；seqidno.12

亞型探針

hairpinprobe

gtggtactgcactcgtctcggttttccgagacgagtcctcggcgcgaatattgat

seqidno.29

金標(biāo)記通用探針

aunp-1sh-aaaaaaaaatgattatcaseqidno.30

aunp-2accacaagacaaaaaaaa-shseqidno.31。

人乳頭瘤分型分管檢測(cè)方式還受到引物探針本身相互干擾的影響，檢測(cè)過程中需要考慮到實(shí)際分型檢測(cè)中的試劑干擾，通過本發(fā)明所設(shè)計(jì)的探針和引物，可以實(shí)現(xiàn)5管檢測(cè)管對(duì)15種人乳頭瘤病毒亞型分型。

實(shí)施例26管測(cè)反應(yīng)區(qū)分15乳頭瘤病毒亞型的檢測(cè)特異性

本實(shí)施例中分別采用實(shí)施例1中所述15種hpv亞型的分型試劑盒的引物和探針配制反應(yīng)液，總體積為20μl，每樣本檢測(cè)分為6管進(jìn)行，每管的檢測(cè)組分分別為：1μm引物、1μm探針和hairpinprobe、1μlaunp-1和aunp-2、0.5utaqdna聚合酶，2u內(nèi)切酶a，0.2mmdntp，分別向該體系中加入對(duì)應(yīng)人乳頭瘤病毒亞型的待測(cè)靶標(biāo)分子，其濃度為10⁴拷貝，最后一管加入β-actin片段，反應(yīng)體系構(gòu)成為反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

本發(fā)明方法檢測(cè)不同亞型的人乳頭瘤病毒的步驟主要有以下三個(gè)階段，而這三個(gè)階段均是在同管閉管條件下完成的。第一階段：模板擴(kuò)增，通過引物對(duì)、擴(kuò)增酶的參與，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)模板的高靈敏擴(kuò)增；第二階段：通過探針和內(nèi)切酶的參與，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)模板向信號(hào)分子的的高效率轉(zhuǎn)化；第三階段：通過納米金探針實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)分子的高分辨識(shí)別。

反應(yīng)結(jié)束后拍照，結(jié)果示于圖2中。圖2的結(jié)果顯示，第一管包含11、16、31、35、43的檢測(cè)探針，檢測(cè)時(shí)分別加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15種亞型的待檢靶標(biāo)分子，結(jié)果僅有11、16、31、35、43亞型呈現(xiàn)陽性；第二管包含6、16、52、53的檢測(cè)探針，檢測(cè)時(shí)分別加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15種亞型的待檢靶標(biāo)分子，結(jié)果僅有6、16、52、53亞型呈現(xiàn)陽性；第三管包含31、33、45、52、58的檢測(cè)針，檢測(cè)時(shí)分別加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15種亞型的待檢靶標(biāo)分子，結(jié)果僅有31、33、45、52、58亞型呈現(xiàn)陽性；第四管包含35、39、42、53、58的檢測(cè)探針，檢測(cè)時(shí)分別加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15種亞型的待檢靶標(biāo)分子，結(jié)果僅有35、39、42、53、58亞型呈現(xiàn)陽性；第五管包含18、39、43、45、56的檢測(cè)探針，檢測(cè)時(shí)分別加入6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15種亞型的待檢靶標(biāo)分子，結(jié)果僅有18、39、43、45、56亞型呈現(xiàn)陽性；第六管包含陽性對(duì)照，為β-actin的檢測(cè)引物和探針，該體系同時(shí)檢測(cè)β-actin基因的靶標(biāo)分子，結(jié)果均呈陽性。本發(fā)明試劑盒6管檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果均與預(yù)期相符，分別能夠特異性的檢測(cè)出對(duì)應(yīng)的人乳頭瘤病毒亞型，表明檢測(cè)特異性良好。

實(shí)施例3實(shí)施例1所述15種hpv亞型的分型試劑盒的檢測(cè)靈敏度

本實(shí)施例中分別采用實(shí)施例1中的引物和探針配制反應(yīng)液，總體積為20μl，每樣本檢測(cè)分為6管進(jìn)行，每管的檢測(cè)組分分別為：1μm引物、1μm探針和hairpinprobe、1μlaunp-1和aunp-2、0.5utaqdna聚合酶，2u內(nèi)切酶a，0.2mmdntp，向該體系中分別加入10⁵、10⁴、10³、10²、10、1及0拷貝的不同亞型的待測(cè)靶分子，管1分別加入11、16、31、35、43亞型不同濃度的模板分子；管2分別加入6、16、52、53亞型不同濃度的模板分子；管3分別加入31、33、45、52、58亞型不同濃度的模板分子；管4分別加入35、39、42、53、58亞型不同濃度的模板分子；管5分別加入18、39、43、45、56亞型不同濃度的模板分子。反應(yīng)體系構(gòu)成為反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應(yīng)結(jié)束后拍照，結(jié)果示于圖3中。圖3的結(jié)果顯示本發(fā)明試劑盒檢測(cè)人乳頭瘤病毒亞型的檢測(cè)靈敏度，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到100-1000拷貝之間。

實(shí)施例4實(shí)施例1所述15種hpv亞型的分型試劑盒的檢測(cè)臨床樣本結(jié)果

本實(shí)施例中分別采用實(shí)施例1中的引物和探針配制反應(yīng)液，總體積為20μl，每樣本檢測(cè)分為6管進(jìn)行，每管的檢測(cè)組分分別為：1μm引物、1μm探針和hairpinprobe、1μlaunp-1和aunp-2、0.5utaqdna聚合酶，2u內(nèi)切酶a，0.2mmdntp，向該體系中分別加入不同亞型的待測(cè)樣本，其濃度為10⁴拷貝，反應(yīng)體系構(gòu)成為反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應(yīng)結(jié)束后拍照，結(jié)果示于圖4中。圖4的結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒能夠通過6管檢測(cè)反應(yīng)區(qū)分待檢樣本中15種人乳頭瘤病毒亞型。

實(shí)施例56管檢測(cè)反應(yīng)區(qū)分15乳頭瘤病毒亞型的區(qū)別于實(shí)施例1的組合方式及檢測(cè)樣本結(jié)果

本實(shí)施例中舉例了另一種組合方式，所述第一管包含6、33、35、42、52的檢測(cè)探針；第二管包含11、35、43、53的檢測(cè)探針；第三管包含18、33、53、56、58的檢測(cè)針；第四管包含31、39、43、52、58的檢測(cè)探針；第五管包含16、31、42、45、56的檢測(cè)探針；第六管包含陽性對(duì)照，為β-actin的檢測(cè)引物和探針。具體如圖5所示。

所述六管檢測(cè)引物和6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、58等15種亞型的檢測(cè)探針與實(shí)施例1相同。

本實(shí)施例中分別采用實(shí)施例1中的引物和探針配制反應(yīng)液，總體積為20μl，按照?qǐng)D5的組合方式，每樣本檢測(cè)分為6管進(jìn)行，每管的檢測(cè)組分分別為：1μm引物、1μm探針和hairpinprobe、1μlaunp-1和aunp-2、0.5utaqdna聚合酶，2u內(nèi)切酶a，0.2mmdntp，向該體系中分別加入不同亞型的待測(cè)樣本，其濃度為10⁴拷貝，反應(yīng)體系構(gòu)成為反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，2min；94℃，5s，72℃，40s，35循環(huán)；72℃，2min；63℃，10min；55℃，30min；10℃，2min。

反應(yīng)結(jié)束后拍照，結(jié)果示于圖6中。圖6的結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒能夠通過6管檢測(cè)反應(yīng)區(qū)分待檢樣本中15種人乳頭瘤病毒亞型。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>廣州市寶創(chuàng)生物技術(shù)有限公司

<120>一種新型的15種人乳頭瘤病毒亞型分型試劑盒和方法

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