本發(fā)明涉及一種用于eb病毒熒光定量pcr檢測(cè)的引物和探針組、及試劑盒，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在早期嬰幼兒時(shí)體液免疫功能還沒有發(fā)育完善，處于相對(duì)低水平，或在eb病毒感染早期，抗體檢測(cè)也為陰性，且抗體檢測(cè)也容易受到類風(fēng)濕因子的干擾而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，所以eb的抗體檢測(cè)不能很好地客觀反映嬰幼兒的eb病毒感染的真實(shí)情況。

但隨著實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)技術(shù)的臨床應(yīng)用，eb病毒dna作為eb感染的分子生物學(xué)標(biāo)記，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、精確性高的優(yōu)點(diǎn)，醫(yī)生可以根據(jù)病人體內(nèi)病毒載量的多少可以推測(cè)病人eb病毒的感染狀況，及時(shí)有效的進(jìn)行抗病毒治療，對(duì)于避免濫用抗生素和及時(shí)緩解病情都具有積極意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種用于eb病毒熒光定量pcr檢測(cè)的引物和探針組，該引物和探針組可配合對(duì)eb病毒特異性的核酸片段體現(xiàn)出良好的擴(kuò)增效率。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種試劑盒，該試劑盒通過特異性的引物和探針、在陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品的監(jiān)控下，與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行同步測(cè)定，測(cè)得的結(jié)果具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種用于eb病毒熒光定量pcr檢測(cè)的引物和探針組，包括，

上游引物eb-f：5’ccggtgtgttcgtatatggag3’，如seqidno.1所示；

下游引物eb-r：5’gggagacgactcaatggtgta3’，如seqidno.2所示；

探針eb-p：5’tgcccttgctattccacaatgtcgtctt3’，如seqidno.3所示；探針的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。

進(jìn)一步地，引物和探針根據(jù)eb病毒的基因組序列中的靶片段進(jìn)行設(shè)計(jì)，該靶片段的序列如seqidno.4所示；該靶片段位于eb病毒的基因組的高保守區(qū)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種用于eb病毒熒光定量pcr檢測(cè)的試劑盒，包括：核酸提取液、紅細(xì)胞裂解液、pcr反應(yīng)液、、混合酶液、陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品；pcr反應(yīng)液包括引物和探針；

引物為：上游引物eb-f：5’ccggtgtgttcgtatatggag3’，如seqidno.1所示；下游引物eb-r：5’gggagacgactcaatggtgta3’，如seqidno.2所示；

探針為：eb-p：5’tgcccttgctattccacaatgtcgtctt3’，如seqidno.3所示；探針的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)；

陰性質(zhì)控品包括不含eb病毒dna片段的重組質(zhì)粒；

臨界陽(yáng)性質(zhì)控品和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品均包括含有eb病毒dna片段的重組質(zhì)粒；

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品包括含有eb靶片段的重組質(zhì)粒，該靶片段的序列如seqidno.4所示。進(jìn)一步地，核酸提取液包括體積百分比0.1-1％的np-40和1-10％的chelex-100。

進(jìn)一步地，紅細(xì)胞裂解液包括質(zhì)量百分濃度20-50％的蔗糖和體積百分比1-5％的tritonx-100。

進(jìn)一步地，pcr反應(yīng)液包括濃度為0.2-0.4mm含dutp的dntp、2-7mm的mgcl2、5-20mm的kcl、0.2-1μm的引物和0.1-0.3μm的探針；上游引物和下游引物等量；

進(jìn)一步地，混合酶液包括1-5u的hotstarttaq酶和0.1-0.5u的ung酶。

進(jìn)一步地，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品包括：

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1：含有濃度為1.0×10⁴copy/ml的eb靶片段的重組質(zhì)粒；

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2：含有濃度為1.0×10⁵copy/ml的eb靶片段的重組質(zhì)粒；

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品3：含有濃度為1.0×10⁶copy/ml的eb靶片段的重組質(zhì)粒；

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品4：含有濃度為1.0×10⁷copy/ml的eb靶片段的重組質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，試劑盒進(jìn)行pcr的反應(yīng)體系為：42℃，2min；94℃，2min；94℃，10sec，58℃，1min，45個(gè)循環(huán)；數(shù)據(jù)的采集定在58℃。

進(jìn)一步地，重組質(zhì)粒為pge重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的待檢樣本包括但不限于全血。

本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理如下：

熒光定量pcr是一種在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定核酸序列進(jìn)行定量分析的方法。本發(fā)明利用一對(duì)靶核酸序列的特異性引物和探針，采用一步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr，通過pcr技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核酸序列片斷的擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(r)和熒光淬滅基團(tuán)(q)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，在pcr擴(kuò)增過程中，dna聚合酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片斷上的熒光探針酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)可以被檢測(cè)，熒光信號(hào)量的變化與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而可以通過熒光強(qiáng)弱來判斷待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在。

臨床樣本與設(shè)定不同濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品同步進(jìn)行熒光定量pcr，通過ct值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算出樣本的具體含量。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的引物和探針組可配合對(duì)eb病毒特異性的核酸片段體現(xiàn)出良好的擴(kuò)增效率；

2、本發(fā)明的試劑盒與熒光pcr檢測(cè)技術(shù)相配合，通過特異性的引物和探針、在陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品的監(jiān)控下，與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行同步測(cè)定，操作簡(jiǎn)便，無需電泳，防止產(chǎn)物被污染，測(cè)得的結(jié)果具有超高的靈敏度和高準(zhǔn)確度。

附圖說明

圖1為擴(kuò)增曲線圖；

圖2為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3為最低檢出限樣本擴(kuò)增曲線圖；

具體實(shí)施方式

下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：

實(shí)施例1：

一、預(yù)配置試劑和設(shè)備的準(zhǔn)備：

1、核酸提取液：核酸提取液含體積百分比0.5％的np-40和5％的chelex-100；

2、紅細(xì)胞裂解液：紅細(xì)胞裂解液含質(zhì)量百分濃度20％的蔗糖和體積百分比2％的tritonx-100；

3、pcr反應(yīng)液體系：取pcr反應(yīng)液，在冰上或4℃融化；然后取出混合酶液，將所有組分輕微搖晃混勻并低速簡(jiǎn)短離心；每20μl的pcr反應(yīng)液體系含pcr反應(yīng)液19.5μl和混合酶液0.5μl。

pcr反應(yīng)液含濃度為0.4mm的dntp(dntp中含有dutp)、4.5mm的mgcl2和10mm的kcl、0.4μm的上游引物、0.4μm的下游引物和0.2μm的探針；

其中：

上游引物eb-f：5’ccggtgtgttcgtatatggag3’；

下游引物eb-r：5’gggagacgactcaatggtgta3’；

探針為：eb-p：5’tgcccttgctattccacaatgtcgtctt3’；探針的5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)；

混合酶液含濃度2.5u的hotstarttaq酶和0.1u的ung酶(尿嘧啶-n-糖基化酶)；

ung酶+dntp中的dutp，組合的系統(tǒng)能夠防止實(shí)驗(yàn)室的假陽(yáng)性結(jié)果，提高該試劑盒的可靠性。pcr反應(yīng)中最常見、最重要的污染物是pcr產(chǎn)物，pcr試劑盒以dutp部分取代dttp，所以pcr產(chǎn)物都是含有du的dna鏈。在pcr開始前增加42℃的保溫步驟，ung酶即可將反應(yīng)體系中已有的u-dna污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這步的條件下dna鏈斷裂,，消除由于污染pcr產(chǎn)物產(chǎn)生的擴(kuò)增，從而保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性。同時(shí)在變性階段，ung酶被滅活，不會(huì)再降解新擴(kuò)增的產(chǎn)物u-dna，從而保證熒光定量pcr的正常進(jìn)行。

4、陰性質(zhì)控品：為不含eb病毒dna片段的pge重組質(zhì)粒；

5、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品：為含有eb病毒dna片段的pge重組質(zhì)粒；

6、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品：為含有eb病毒dna片段的pge重組質(zhì)粒；

7、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品：

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1：含有濃度為1.0×10⁴copy/ml的eb靶片段的重組質(zhì)粒；

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2：含有濃度為1.0×10⁵copy/ml的eb靶片段的重組質(zhì)粒；

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品3：含有濃度為1.0×10⁶copy/ml的eb靶片段的重組質(zhì)粒；

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品4：含有濃度為1.0×10⁷copy/ml的eb靶片段的重組質(zhì)粒。

靶片段的序列如seqidno.4所示。

需要使用的設(shè)備有：

金屬浴，采用微電腦控制和半導(dǎo)體制冷技術(shù)制造的一款恒溫金屬浴儀器，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的水浴裝置；

熒光pcr檢測(cè)儀，abi熒光定量pcr儀，廠家：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

二、樣本處理：

取出紅細(xì)胞裂解液，使其溫度平衡至室溫，混勻；取出加入抗凝劑的全血樣本，充分混勻；利用帶濾芯的吸頭在1ml紅細(xì)胞裂解液中加入400μl全血樣本，上下顛倒10次充分混勻，放置5min同時(shí)輕搖2-4次；然后放入離心機(jī)，12000rpm離心2min，棄去上清液，去沉淀；向沉淀中加入1ml紅細(xì)胞裂解液，重懸至無明顯塊狀沉淀，12000rpm離心2min，棄去上清液取沉淀；用1ml生理鹽水洗滌白細(xì)胞沉淀，12000rpm離心5min，棄去上清液取沉淀；在管內(nèi)加入200μl核酸提取液，重懸沉淀物；95℃加熱10min，高轉(zhuǎn)速離心10min；小心吸取上清液置于另一滅菌的離心管中，暫時(shí)儲(chǔ)存于4℃待檢，核酸溶液長(zhǎng)期儲(chǔ)存溫度為-18℃。

三、質(zhì)控品處理：

陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品3和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品4各100μl，置于100μl的核酸提取液中，充分混勻，100℃金屬浴處理10min，12000rpm離心5min，備用。

四、分裝反應(yīng)孔：

試劑盒中設(shè)有至少1個(gè)樣本反應(yīng)孔，1個(gè)陰性反應(yīng)孔、1個(gè)臨界陽(yáng)性反應(yīng)孔、1個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)孔、1個(gè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)1反應(yīng)孔、1個(gè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)2反應(yīng)孔、1個(gè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)3反應(yīng)孔、1個(gè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)4反應(yīng)孔、1個(gè)陰性對(duì)照反應(yīng)孔；每個(gè)反應(yīng)孔中加入20μl的核酸提取液，然后分別取20μl經(jīng)處理的樣本；陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品4，加入各自的反應(yīng)孔中，其中陰性對(duì)照反應(yīng)孔不加入任何樣本或dna。

五、反應(yīng)：

將試劑盒放入熒光pcr檢測(cè)儀中進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系為42℃，2min；94℃，2min；94℃，10sec，58℃，1min，45個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)收集設(shè)定為fam熒光素，數(shù)據(jù)的采集定在58℃。

六、檢測(cè)結(jié)果分析：

將4個(gè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1、2、3、4的濃度輸入，得到圖像如圖1所示，圖1中1為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1，2為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2，3為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品3，4為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品4，5為強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、6為臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，7為樣本，8為陰性質(zhì)控品，9為陰性對(duì)照，10為閾值。分析圖像后調(diào)節(jié)baseline的start值、end值和threshold值：start值位于3-15之間，end值位于5-20之間，調(diào)整陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線使其平直或低于閾值線，再進(jìn)行結(jié)果分析：

1)陰性質(zhì)控品目的基因擴(kuò)增曲線ct值應(yīng)為undet；

2)臨界陽(yáng)性質(zhì)控品的ebdna定量結(jié)果應(yīng)約為5×10³copies/ml；

3)強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品的ebdna定量結(jié)果應(yīng)約為5×10⁶copies/ml；

4)根據(jù)4個(gè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.98。

5)以上5個(gè)條件需在同一次試驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則認(rèn)為檢測(cè)結(jié)果不能正確地反映樣本實(shí)際情況，需重新進(jìn)行檢測(cè)。滿足以上條件后方可進(jìn)行以下結(jié)果判斷：

(1)儀器顯示undet表示待檢樣品為陰性；

(2)結(jié)果顯示樣本ebdna拷貝數(shù)在1×10²－6.0×10⁸copies/ml時(shí)，定量結(jié)果有效，可直接報(bào)告相應(yīng)的定量數(shù)值；

(3)結(jié)果顯示樣本拷貝數(shù)大于6.0×10⁸copies/ml，可直接報(bào)告為大于6.0×10⁸copies/ml，也可將核酸樣本做10倍梯度稀釋后重新測(cè)定，測(cè)定后根據(jù)稀釋倍數(shù)校準(zhǔn)；

(4)結(jié)果顯示典型擴(kuò)增曲線，ebdna拷貝數(shù)低于1×10²copies/ml時(shí)，檢測(cè)結(jié)果有效，定量數(shù)值僅供參考；

(5)待檢樣本ebdna的拷貝數(shù)小于30copies/ml時(shí)，不能100％檢出。

實(shí)施例2：

試劑盒靈敏度測(cè)試：

將濃度為100copies/ml的eb全血樣本，用eb陰性全血樣本稀釋至30copies/ml，標(biāo)記為最低檢出限樣本，制備16個(gè)最低檢出限重復(fù)樣本。樣本的處理方法同實(shí)施例1，將16個(gè)最低檢出限重復(fù)樣本分別放入16個(gè)樣本反應(yīng)孔中，采用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。得到的擴(kuò)增曲線如圖3所示，數(shù)據(jù)如表格1所示。

表格116個(gè)最低檢出限樣本檢測(cè)結(jié)果

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>江蘇默樂生物科技股份有限公司

<120>一種用于eb病毒熒光定量pcr檢測(cè)的引物和探針組、及試劑盒

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