本發(fā)明屬于植物病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)百合斑駁病毒的lamp引物組、試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

百合斑駁病毒(lilymottlevirus，lmov)是馬鈴薯y病毒屬(potyvirus)成員，基因組為單分子正鏈rna，約9.6kb，編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約350kda的多聚蛋白，通過(guò)自我剪切后形成外殼蛋白cp、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體蛋白ci等10個(gè)不同大小的功能蛋白。

lmov僅侵染百合科的郁金香屬和百合屬植物，可由摩擦接種或由蚜蟲(chóng)非持續(xù)性傳播感染寄主，引起百合斑駁病。該病的相關(guān)報(bào)道最早見(jiàn)于1944年，癥狀主要表現(xiàn)為百合葉片有斑駁條紋甚至壞死斑，后期發(fā)展為花、葉片卷曲畸形，開(kāi)碎色花，并常伴隨植株矮小、花與球莖的減產(chǎn)等。由于扦插和分球等無(wú)性繁殖手段是百合種球生產(chǎn)的主要方式，使得百合一旦感染lmov病毒后，在開(kāi)放的環(huán)境中，病毒就會(huì)在該范圍內(nèi)積累擴(kuò)散傳播，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。百合斑駁病毒在我國(guó)百合主要產(chǎn)區(qū)的自然發(fā)病率在20～30％，有些甚至達(dá)到70％，從荷蘭引進(jìn)的種球帶毒率就在30％以上。

目前針對(duì)lmov，傳統(tǒng)的診斷方法主要有：病毒分離以及免疫學(xué)方法診斷抗原，包括常規(guī)的rt-pcr、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)以及基因芯片技術(shù)。

pcr技術(shù)雖然操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，但是，pcr檢測(cè)中某些關(guān)鍵性限制因素極易造成假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)。在lmov的rna病毒逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，極易受到rna酶的污染，出現(xiàn)假陰性。而在pcr過(guò)程中，樣品的非特異性擴(kuò)增都有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。而且，rt-pcr反應(yīng)體系中含有各種復(fù)雜的基質(zhì)，使得整個(gè)反應(yīng)受多方面影響。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)是外源基因所表達(dá)的特殊形式及蛋白質(zhì)的檢測(cè)采用的主要方法。在對(duì)樣品的加工中，蛋白質(zhì)很容易遭到破壞，從而影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性?？乖贵w反應(yīng)的專一性，但不同百合植株中抗原會(huì)有所差異，更是給實(shí)驗(yàn)增加難度。

另外，目前普遍看好的基因芯片技術(shù)存在難以推廣應(yīng)用的障礙?；蛐酒谱靼嘿F外，還需價(jià)格高昂的激光共聚焦掃描儀。在操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，對(duì)操作人員的專業(yè)要求也比較高，這極大的限制了該技術(shù)的推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是由notomi在2000年提出的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)主要依靠一種具有鏈置換特性的bstdna聚合酶(bacillusstearothermophilusdnapolymerase)和四條能夠識(shí)別靶序列上六個(gè)特異區(qū)域的引物，在恒溫條件下就能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)條帶的10⁹-10¹⁰倍擴(kuò)增。4條引物fip/bip、f3/b3需在靶基因上的6個(gè)不同部位完全匹配才進(jìn)行擴(kuò)展，具有高特異性。

此外，lamp比傳統(tǒng)pcr靈敏度高，還少受培養(yǎng)介質(zhì)和生物學(xué)物質(zhì)的影響。lamp陽(yáng)性擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生大量的類似花椰菜結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物和白色焦磷酸絮狀沉淀，可以采取多種檢測(cè)方法，如凝膠電泳電泳檢測(cè)和濁度儀定量檢測(cè)。濁度儀根據(jù)產(chǎn)物渾濁度的不同對(duì)原始核酸分子進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。還可以直接肉眼檢測(cè)或者在反應(yīng)體系加入熒光染料，觀察變色情況。

該方法成本低廉，操作簡(jiǎn)單，只需臺(tái)水浴鍋、pcr儀就可在基層推廣，lamp技術(shù)因其快速、高效、特異性好、靈敏度高和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于病原菌、寄生蟲(chóng)、病毒、疾病和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展應(yīng)用空間。

然而，百合斑駁病毒是rna單鏈病毒，容易發(fā)生變異，而且不同變異株之間會(huì)有許多突變位點(diǎn)，因此，利用lamp技術(shù)檢測(cè)百合斑駁病毒的難點(diǎn)在于保守序列的選擇和引物的設(shè)計(jì)，方法靈敏度較高時(shí)，還需要嚴(yán)格的防污染措施來(lái)避免假陽(yáng)性結(jié)果。

目前，lamp技術(shù)還沒(méi)有被應(yīng)用于百合斑駁病毒的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種檢測(cè)百合斑駁病毒的lamp引物組、試劑盒及檢測(cè)方法，該引物特異性強(qiáng)，與常見(jiàn)侵染百合的7種病毒無(wú)交叉，靈敏度高，可在模板純度只有10¹拷貝數(shù)下進(jìn)行擴(kuò)增，依此建立的百合斑駁病毒的lamp診斷方法，具有反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果判定方便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一種用于檢測(cè)百合斑駁病毒的lamp引物組，其包括外引物f3和b3，內(nèi)引物fip和bip，從5’端到3’端，具體序列如下：

f3:5’-aatggcgtgtggctcatg-3’；

b3:5’-ggtgagatttcgctgaaggc-3’；

fip:5’-cgtcggttttgcgtgttcaagttttttggacggagatcagcaagtt-3’；

bip:5’-gcgcatttctcaaacctcgctgttttcgtacctaggcatgtacggt-3’。

本發(fā)明提供一種包含所述lamp引物組的百合斑駁病毒的lamp檢測(cè)試劑盒。

進(jìn)一步，所述lamp檢測(cè)試劑盒含有l(wèi)amp反應(yīng)體系，該lamp反應(yīng)體系包括：內(nèi)引物fip、內(nèi)引物bip、外引物f3、外引物b3、10×buffer、mg²⁺、dntps、甜菜堿和bstdna聚合酶，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度之比范圍為1-16：1。

進(jìn)一步，所述的lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip0.8-1.6μm，內(nèi)引物bip0.8-1.6μm，外引物f30.1-0.8μm，外引物b30.1-0.8μm，mg²⁺1.0-2.0mm，dntps0.2-0.4mm，甜菜堿0.4-0.8m，bstdna聚合酶0.16-0.48u/μl，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度比為1-16：1。

優(yōu)選地，lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip0.8-1.0μm，內(nèi)引物bip0.8-1.0μm，外引物f30.5-0.8μm，外引物b30.5-0.8μm，mg²⁺1.3-1.7mm，dntps0.3-0.4mm，甜菜堿0.4-0.6m，bstdna聚合酶0.32-0.48u/μl，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度比范圍為1-16：1。

更優(yōu)選地，lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip0.8μm，內(nèi)引物bip0.8μm，外引物f30.8μm，外引物b30.8μm，mg²⁺1.5mm，dntps0.4mm，甜菜堿0.4m，bstdna聚合酶0.32u/μl。

一種百合斑駁病毒的lamp快速檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)提取待測(cè)樣品rna，將總rna的50ng-5μg用全式基因逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cdna；

2)配制lamp反應(yīng)體系

以ddh2o為陰性對(duì)照，以包含百合斑駁病毒目的序列的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，配制lamp反應(yīng)體系；

所述lamp反應(yīng)體系中，各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip0.8-1.6μm，內(nèi)引物bip0.8-1.6μm，外引物f30.1-0.8μm，外引物b30.1-0.8μm，10×buffer，mg²⁺1.0-2.0mm，dntps0.2-0.4mm，甜菜堿0.4-0.8m，bstdna聚合酶0.16-0.48u/μl，逆轉(zhuǎn)錄獲得的cdna模板1μl，其中，內(nèi)引物與外引物的濃度之比為1-16：1；

3)進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)

lamp擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)程序?yàn)椋?7-62℃30-60min，80-85℃3-5min；

4)鑒定擴(kuò)增結(jié)果

步驟3)lamp擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑sybrgreeni染料，觀察顏色變化：顯色為綠色的樣品為陽(yáng)性，含有百合斑駁病毒；顯色為橘色的樣品為陰性，不含百合斑駁病毒；

或者取lamp擴(kuò)增產(chǎn)物，在goldview染色的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在凝膠成像儀器的紫外光下顯影觀察，若出現(xiàn)特征性的梯狀條帶，則樣品為陽(yáng)性，含有百合斑駁病毒；無(wú)條帶出現(xiàn)的樣品為陰性，不含百合斑駁病毒。

進(jìn)一步，所述lamp反應(yīng)體系中，各成分的成分的終濃度為：內(nèi)引物fip0.8-1.0μm，內(nèi)引物bip0.8-1.0μm，外引物f30.5-0.8μm，外引物b30.5-0.8μm，mgcl21.3-1.7mm，dntps0.3-0.4mm，甜菜堿0.4-0.6m，bstdna聚合酶0.32-0.48u/μl，逆轉(zhuǎn)錄獲得的cdna模板1μl。

將本發(fā)明所述的lamp引物用于百合斑駁病毒的rt-lamp檢測(cè)中。

進(jìn)一步，所述的rt-lamp檢測(cè)反應(yīng)體系中，以待測(cè)樣品rna為模板，反應(yīng)體系中各成分的終濃度為：內(nèi)引物fip1.6-2.0μm，內(nèi)引物bip1.6-2.0μm，外引物f30.5-0.8μm，外引物b30.5-0.8μm，10×buffer，mg²⁺1.3-1.7mm，dntp0.3-0.4mm，甜菜堿0.4-0.6m，bst酶0.27-0.55u/μl，dtt0.15-0.2mm，逆轉(zhuǎn)錄酶3-4u/μl，待測(cè)樣品rna20ng-5μg，反應(yīng)程序?yàn)椋?0-65℃30-60min，80-85℃3-5min。

本發(fā)明的lamp或rt-lamp反應(yīng)體系中，10×buffer的添加遵循本領(lǐng)域中的常規(guī)添加原則，通常為反應(yīng)總體積的十分之一。

本發(fā)明根據(jù)百合斑駁病毒(lmov)cp基因序列(genbank登錄號(hào)為aj564637.1)，在選擇保守區(qū)域時(shí)避開(kāi)所有的突變位點(diǎn)，使引物具有高特異性，設(shè)計(jì)篩選出2對(duì)引物，其為內(nèi)引物fip、bip和外引物f3、b3。

利用本發(fā)明的fip、bip、f3和b3引物，在恒溫條件下，經(jīng)過(guò)高活性鏈置酶bst酶的作用，dna不斷循環(huán)擴(kuò)增，主要可分2個(gè)階段，啟動(dòng)階段和循環(huán)擴(kuò)增階段，lamp擴(kuò)增原理參見(jiàn)圖1和圖2。

在啟動(dòng)階段，引物向雙鏈dna的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，釋放單鏈。如圖1所示，雙鏈dna模板在等溫(60-65℃)的條件下，內(nèi)部引物fip退火，fip中的f2序列跟模板鏈上flc位點(diǎn)結(jié)合，在具有鏈置換活性的dna聚合酶作用下啟動(dòng)核酸的合成。外部引物f3與模板f3c區(qū)域結(jié)合并延伸，置換出完整的fip連接的互補(bǔ)單鏈，并置換釋放一條單鏈dna；單鏈dna一端自動(dòng)形成環(huán)的結(jié)構(gòu)，可作為bip引物的模板，bip啟動(dòng)鏈的合成，隨后b3引物退火，同模板鏈雜交，引導(dǎo)鏈置換反應(yīng)產(chǎn)生一條雙鏈dna和一條兩端成環(huán)的單鏈dna，形成一個(gè)啞鈴環(huán)的結(jié)構(gòu)；此后，3’端自動(dòng)引導(dǎo)dna的合成，快速形成一種莖環(huán)的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)作為lamp反應(yīng)中循環(huán)反應(yīng)的起始結(jié)構(gòu)，進(jìn)入lamp反應(yīng)的循環(huán)擴(kuò)增階段。

第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段，主要由內(nèi)部引物fip和bip作用，如圖2所示：以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，引物fip退火，與莖環(huán)的f2c區(qū)結(jié)合，開(kāi)始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，迅速以3’末端的b1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行dna合成延伸及鏈置換，形成長(zhǎng)短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的dna，bip引物上的b2區(qū)域與其雜交，啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增，且產(chǎn)物dna長(zhǎng)度增加一倍。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同莖長(zhǎng)度莖結(jié)構(gòu)的dna和帶有許多環(huán)的類似花椰菜結(jié)構(gòu)dna的混合物，且產(chǎn)物dna為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列，因此lamp電泳條帶為一系列不同大小的梯狀條帶。

本發(fā)明對(duì)lamp反應(yīng)溫度和反應(yīng)體系進(jìn)行了詳盡、可靠的研究。由于反應(yīng)中bstdna聚合酶的最佳反應(yīng)溫度為60℃左右，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生較大影響，本發(fā)明對(duì)百合斑駁病毒的lamp反應(yīng)溫度在55℃-65℃之間進(jìn)行了篩選優(yōu)化，確定合適的退火溫度范圍為：57-62℃，在該溫度范圍內(nèi)，lamp反應(yīng)效率和產(chǎn)物產(chǎn)量較高。

lamp反應(yīng)中，不同的引物比例的擴(kuò)增效率不同，本發(fā)明對(duì)引物比例進(jìn)行優(yōu)化篩選，最終確定的內(nèi)引物與外引物比例范圍為1-16：1，在該引物比例范圍內(nèi)，可以使用凝膠電泳法檢測(cè)出明顯的陽(yáng)性梯狀條帶。

本發(fā)明對(duì)lamp反應(yīng)體系中各物質(zhì)的終濃度進(jìn)行了四因素三水平優(yōu)化，最終確定各物質(zhì)的終濃度范圍為：dntps0.2-0.4mm，甜菜堿0.4-0.8m，bstdna聚合酶0.16-0.48u/μl，在該濃度范圍內(nèi)，能獲得良好的反應(yīng)效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。

利用本發(fā)明的lamp引物組，可以直接采用樣品中提取的總rna進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫實(shí)驗(yàn)rt-lamp，利用逆轉(zhuǎn)錄酶revertraace(toyobo)和bst酶，將lamp和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，極大地縮短了反應(yīng)時(shí)間。以rna作為模板，減少了將rna逆轉(zhuǎn)錄成cdna的步驟，既減少了逆轉(zhuǎn)錄的中間過(guò)程和人為操作帶來(lái)的誤差，又克服了以往lamp易出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。

與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明的百合斑駁病毒lamp引物特異性強(qiáng)，與常見(jiàn)侵染百合的7種病毒，具體包括百合無(wú)癥病毒樣品、黃瓜花葉病毒樣品、蘋(píng)果莖溝病毒樣品、南芥菜花葉病毒樣品、蠶豆萎蔫病毒樣品、百合x(chóng)病毒樣品和水仙花葉病毒樣品，經(jīng)過(guò)測(cè)試，不會(huì)產(chǎn)生交叉感染。

本發(fā)明的lamp檢測(cè)方法特異性好，靈敏度高，在百合斑駁病毒的診斷中，可在模板純度只有10¹拷貝數(shù)下進(jìn)行擴(kuò)增，具有反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果判定方便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

將本發(fā)明的lamp引物組和反應(yīng)體系制成lamp試劑盒，在試劑盒中設(shè)置陰性對(duì)照以證明反應(yīng)體系未被百合斑駁病毒目的序列污染，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照以對(duì)比測(cè)定結(jié)果的正確性，進(jìn)行l(wèi)mov的lamp可視化快速檢測(cè)，操作簡(jiǎn)捷，向產(chǎn)物中直接加入熒光染料，依據(jù)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果的可視化、易判定、易于推廣應(yīng)用。

本發(fā)明可用于環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增(rt-lamp)，直接檢驗(yàn)百合樣品總rna，減少實(shí)驗(yàn)假陰性或假陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生，在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)，更加經(jīng)濟(jì)節(jié)約，高效，非常易于臨床推廣。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中l(wèi)amp擴(kuò)增中第1擴(kuò)增階段示意圖。

圖2為本發(fā)明中l(wèi)amp擴(kuò)增中第2擴(kuò)增階段示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中l(wèi)amp擴(kuò)增結(jié)果可視化結(jié)果示意圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中l(wèi)amp擴(kuò)增結(jié)果電泳檢測(cè)示意圖。

圖5為對(duì)比例的lamp擴(kuò)增示意圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中l(wèi)amp靈敏度電泳結(jié)果示意圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中pcr靈敏度電泳結(jié)果示意圖。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中l(wèi)amp靈敏度可視化結(jié)果示意圖。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例5中l(wèi)amp特異性電泳示意圖。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例5中l(wèi)amp特異性可視化結(jié)果示意圖。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例6中rt-lamp電泳結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1一種用于檢測(cè)百合斑駁病毒的lamp引物組的獲得

根據(jù)genbank中查找到lmov的coatproteingene(cp)序列(genbank登錄號(hào)為aj564637.1)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)原理如下：

由于lamp主要依靠鏈置換而成，所以靶序列長(zhǎng)度應(yīng)小于300bp，若是大于500bp將很難擴(kuò)增，本發(fā)明根據(jù)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域(3’端的f3c、f2c和flc區(qū)以及5’端的bl、b2和b3區(qū))，設(shè)計(jì)了4條特異性引物fip、bip、f3和b3。

fip引物為上游內(nèi)部引物(forwardinnerprimer)，由tttt序列鏈接f2區(qū)和f1c區(qū)域組成，f2區(qū)與靶基因3’端的f2c區(qū)域互補(bǔ)，f1c區(qū)與靶基因5’端的flc區(qū)域序列相同。bip引物為下游內(nèi)部引物(backwardinnerprimer)，由tttt序列連接b1c和b2區(qū)域組成，b2區(qū)與靶基因3’端的b2c區(qū)域互補(bǔ)，b1c域與靶基因5’端的blc區(qū)域序列相同。

f3引物為上游外部引物(forwardouterprimer)，由f3區(qū)組成，并與靶基因的f3c區(qū)域互補(bǔ)。b3引物為下游外部引物(backwardouterprimer)，由b3區(qū)域組成，和靶基因的b3c區(qū)域互補(bǔ)。

具體序列如下：

f3:5’-aatggcgtgtggctcatg-3’；

b3:5’-ggtgagatttcgctgaaggc-3’；

fip:5’-cgtcggttttgcgtgttcaagttttttggacggagatcagcaagtt-3’；

bip:5’-gcgcatttctcaaacctcgctgttttcgtacctaggcatgtacggt-3’。

實(shí)施例2一種百合斑駁病毒的lamp檢測(cè)方法

1)使用總rna提取試劑盒(上海博滿生物科技有限公司)，并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取感染百合斑駁病毒的百合植株樣品總rna。

2)將提取的50ng-5μg總rna使用全式基因逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cdna；

3)配制lamp反應(yīng)體系

設(shè)置陰性對(duì)照(ddh2o)體系和陽(yáng)性對(duì)照(包含百合斑駁病毒目的序列的質(zhì)粒)體系，設(shè)置陰性對(duì)照以證明反應(yīng)體系未被百合斑駁病毒目的序列污染，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照以對(duì)比測(cè)定結(jié)果的正確性。

為防止實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，配制lamp反應(yīng)體系和兩個(gè)對(duì)照體系時(shí)，進(jìn)行分區(qū)操作。

配制反應(yīng)體系時(shí)，不添加模板，先將ddh2o、dntps、10×buffer、fip、bip、f3、b3和甜菜堿配制好，分成三組，分別加入陰性對(duì)照(ddh2o)、待測(cè)樣品cdna模板和陽(yáng)性對(duì)照(包含百合斑駁病毒目的序列的質(zhì)粒)，加入陰性對(duì)照的成為陰性對(duì)照體系，加入待測(cè)樣品的成為反應(yīng)體系，加入陽(yáng)性對(duì)照的成為陽(yáng)性對(duì)照體系，將各體系的混合物渦旋混勻、瞬離，在95℃水浴鍋中加熱5min，再冰浴5min后，再加入bst酶，其中，bst酶需與dna模板和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒隔離放置。

25μl的lamp反應(yīng)體系中，包括：ddh2o5.9μl，濃度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip4.0μl，濃度10μm的引物bip4.0μl，濃度10μm的引物f30.5μl，濃度10μm的引物b30.5μl，濃度5m甜菜堿2.1μl，逆轉(zhuǎn)錄所得cdna1μl，8u/μl的bst酶1.5μl。

4)進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)

配制好反應(yīng)體系后進(jìn)行l(wèi)amp擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?8.5℃59min，

80℃3min；

5)鑒定擴(kuò)增結(jié)果

步驟3)lamp擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2μlsybrgreeni染料，觀察顏色變化：顯色綠色的樣品為陽(yáng)性，含有百合斑駁病毒；顯色橘色的樣品為陰性，不含百合斑駁病毒，結(jié)果參見(jiàn)圖3。

或者取5μllamp擴(kuò)增產(chǎn)物在goldview染色的2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后在凝膠成像儀器的紫外光下顯影觀察。出現(xiàn)特征性梯狀條帶的樣品為陽(yáng)性，含有百合斑駁病毒；無(wú)條帶出現(xiàn)的樣品為陰性，不含百合斑駁病毒，結(jié)果參見(jiàn)圖4。

由圖3-4可以看出，電泳結(jié)果和顯色結(jié)果表明百合斑駁病毒(lmov)和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(p)均顯示為陽(yáng)性結(jié)果，陰性對(duì)照(n)均表現(xiàn)為陰性結(jié)果，且百合斑駁病毒的lamp可視化快速檢測(cè)與電泳結(jié)果一致。

對(duì)比例

除lamp反應(yīng)體系與本實(shí)施例不同外，其余操作及反應(yīng)條件與實(shí)施例2相同。

其中，所用的lamp反應(yīng)體系為：ddh2o9.5μl，濃度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip0.5μl，濃度10μm的引物bip0.5μl，濃度10μm的引物f32.0μl，濃度10μm的引物b32.0μl，濃度5m甜菜堿3μl，8u/μl的bst酶1μl，逆轉(zhuǎn)錄所得cdna1μl。

所擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果參見(jiàn)圖5，其中，泳道lmov為使用本對(duì)比例反應(yīng)體系來(lái)檢測(cè)百合斑駁病毒。

結(jié)果表明，利用對(duì)比例的反應(yīng)體系，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，梯狀條帶在紫外光下幾乎不能識(shí)別，反應(yīng)效率很低。

實(shí)施例3百合斑駁病毒的lamp檢測(cè)試劑盒組裝

1、包裝規(guī)格：200次

2、試劑盒組成表1：

表1

*：內(nèi)含buffer、dntpmix和甜菜堿。

3、運(yùn)輸及保存方法：

低溫運(yùn)輸，避光保存。短期使用放至4℃避光保存，長(zhǎng)期保存請(qǐng)置于-20℃或-80℃冰箱避光保存。

4、使用注意事項(xiàng)：

(1)全部的物品，凡是接觸過(guò)病毒材料的，為不將實(shí)驗(yàn)室污染和對(duì)檢測(cè)人員造成影響都需要被合理處理。

(2)把整個(gè)實(shí)驗(yàn)分區(qū)域進(jìn)行操作，嚴(yán)禁器材和試劑倒流，以免污染。

(3)顯色劑低毒，應(yīng)于室溫條件避光保存，操作時(shí)應(yīng)戴上手套。

(4)注意不要讓試劑盒中的各個(gè)成分受到污染，可進(jìn)行分裝使用。

(5)操作過(guò)程中移液取樣、定時(shí)等全部過(guò)程必須精確。嚴(yán)格遵守操作說(shuō)明可以獲得最好的結(jié)果。

實(shí)施例4靈敏度驗(yàn)證

本實(shí)施例將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證過(guò)lmov的質(zhì)粒按照靠拷貝數(shù)進(jìn)行稀釋實(shí)驗(yàn)，分別按照l(shuí)mov質(zhì)粒10⁷拷貝、10⁶拷貝、10⁵拷貝、10⁴拷貝、10³拷貝、10²拷貝、10¹拷貝分別進(jìn)行l(wèi)amp和pcr檢測(cè)。

lamp反應(yīng)體系：ddh2o6.5μl，濃度2.5mm的1×dntps4.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip2.0μl，濃度10μm的引物bip2.0μl，濃度10μm的引物f32.0μl，濃度10μm的引物b32.0μl，濃度5m甜菜堿2μl，逆轉(zhuǎn)錄所得cdna1μl，8u/μl的bst酶1.0μl。

pcr反應(yīng)體系：ddh2o17μl，濃度2.5mm的1×dntps2.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的引物f31.0μl，濃度10μm的引物b31.0μl，濃度逆轉(zhuǎn)錄所得cdna1μl，5u/μl的taqdna聚合酶0.5μl。

pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10min，進(jìn)入pcr反應(yīng)循環(huán)：95℃變性60s，51℃退火40s，72℃延伸35s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃總延伸7min。

lamp反應(yīng)程序和結(jié)果顯示方法參見(jiàn)實(shí)施例2，pcr結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè)，目的片段長(zhǎng)為188bp，檢測(cè)結(jié)果如圖6-8所示，其中，10⁷為lmov質(zhì)粒10⁷拷貝，10⁶為lmov質(zhì)粒10⁶拷貝，10⁵為lmov質(zhì)粒10⁵拷貝，10⁴為lmov質(zhì)粒10⁴拷貝，10³為lmov質(zhì)粒10³拷貝，10²為lmov質(zhì)粒10²拷貝，10¹為lmov質(zhì)粒10¹拷貝，n為陰性對(duì)照。

圖6-7結(jié)果表明，本發(fā)明的lamp可以檢驗(yàn)出10¹而pcr只能檢驗(yàn)出10³拷貝，說(shuō)明本發(fā)明lamp檢測(cè)法能夠檢測(cè)出的最低濃度比pcr檢測(cè)低2個(gè)數(shù)量級(jí)，這證明本發(fā)明中l(wèi)amp方法具有極高的靈敏度。

由于使用lamp技術(shù)檢測(cè)百合斑駁病毒的靈敏度較高，采用良好的防污染措施可避免假陽(yáng)性結(jié)果。

同時(shí)，由圖8可以看出，百合斑駁病毒的lamp可視化快速檢測(cè)與電泳結(jié)果一致，且呈一定的梯度變化。

實(shí)施例5特異性驗(yàn)證

百合在田間栽培過(guò)程中，常因病毒侵染，導(dǎo)致百合葉片過(guò)早脫落花芽和花早衰，壽命縮短等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，在侵染百合的病毒中，除百合斑駁病毒外，還有黃瓜花葉病毒(cucumbermosaicvirus,cmv)、百合無(wú)癥病毒(lilysymptomlessvirus,lsv)等。據(jù)沈淑琳統(tǒng)計(jì)，侵染百合的病毒種類有14種，王繼華統(tǒng)計(jì)有16種。

本實(shí)施例為驗(yàn)證lamp引物的特異性，除百合斑駁病毒外，選取常見(jiàn)侵染百合的7種病毒進(jìn)行測(cè)試，具體包括百合無(wú)癥病毒樣品、黃瓜花葉病毒樣品、蘋(píng)果莖溝病毒樣品、南芥菜花葉病毒樣品、蠶豆萎蔫病毒樣品、百合x(chóng)病毒樣品和水仙花葉病毒樣品。

本實(shí)施例采用含lamp引物的試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系為：ddh2o6.2μl，濃度2.5mm的1×dntps3.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip3.8μl，濃度10μm的引物bip3.8μl，濃度10μm的引物f30.25μl，濃度10μm的引物b30.25μl，濃度5m甜菜堿3μl，逆轉(zhuǎn)錄所得cdna模板1μl，8u/μl的bst酶1.2μl。

結(jié)果判定方法參見(jiàn)實(shí)施例2，電泳結(jié)果圖9，顯色結(jié)果圖10，其中，lmov為百合斑駁病毒cdna，p為lmov質(zhì)粒，n為陰性對(duì)照，lsv為百合無(wú)癥病毒樣品，cmv為黃瓜花葉病毒樣品，asgv為蘋(píng)果莖溝病毒樣品，armv為南芥菜花葉病毒樣品，bbwv為蠶豆萎蔫病毒樣品，lvx為百合x(chóng)病毒樣品，nmv為水仙花葉病毒樣品。

電泳結(jié)果圖9和顯色結(jié)果圖10表明，百合斑駁病毒(lmov)和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(p)均顯示為陽(yáng)性結(jié)果，陰性對(duì)照(n)和其他感染百合的病毒樣品均表現(xiàn)為陰性結(jié)果，且，百合斑駁病毒的lamp可視化快速檢測(cè)與電泳結(jié)果一致。

因此，本發(fā)明百合斑駁病毒的lamp可視化快速檢測(cè)試劑盒的特異性好，不會(huì)與其他病毒產(chǎn)生交叉感染，同時(shí)說(shuō)明，加入熒光染料后，可視化結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

實(shí)施例6利用lmov的lamp檢測(cè)試劑盒進(jìn)行rt-lamp檢測(cè)

百合斑駁病毒lmov為rna病毒，在現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行常規(guī)pcr檢測(cè)時(shí)，需要先提取總rna，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cdna進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明直接采用樣品中提取的總rna，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫實(shí)驗(yàn)rt-lamp，將lamp和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，具體步驟如下：

全部反應(yīng)體系共29.5μl，包括：ddh2o0μl，濃度2.5mm的1×dntps4.0μl，10×buffer(含mg²⁺)2.5μl，濃度10μm的fip4.0μl，濃度10μm的引物bip4.0μl，濃度10μm的引物f32.0μl，濃度10μm的引物b32.0μl，濃度5m甜菜堿2μl，8u/μl的bst酶2.0μl，5mmdtt1μl，待測(cè)樣品rna50ng，100u/μl的revertraace(toyobo)1μl。

將所有反應(yīng)體系于冰上加入pcr管后，渦旋，混勻，然后立即放入pcr儀。

rt-lamp反應(yīng)程序：65℃59min，80℃3min。

產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)梯狀條帶，若出現(xiàn)梯狀條帶，則證明rt-lamp實(shí)驗(yàn)成功，結(jié)果參見(jiàn)圖11，其中，rna表示百合斑駁病毒rna經(jīng)過(guò)rt-lamp所得產(chǎn)物，n為陰性對(duì)照。

由圖11可見(jiàn)，百合斑駁病毒lmovrna經(jīng)過(guò)rt-lamp反應(yīng)后顯示為陽(yáng)性，說(shuō)明本發(fā)明rt-lamp方法檢測(cè)百合斑駁病毒具有良好的特異性。

由于百合斑駁病毒本身屬于易降解的rna病毒，易受到空氣或者是實(shí)驗(yàn)器具上rna酶的作用，所以在提取和逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中要時(shí)時(shí)刻刻小心rna酶的污染，給實(shí)驗(yàn)增加了很多繁瑣的步驟，如使用的移液器等器具需用depc-h2o處理，槍頭要多次滅菌等等，即使再小心，也易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

而本發(fā)明則可極大的減輕這些繁瑣的步驟，直接采用樣品中提取的總rna進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫實(shí)驗(yàn)rt-lamp，將lamp和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，利用逆轉(zhuǎn)錄酶revertraace(toyobo)和bst酶極大地縮短了反應(yīng)時(shí)間。以rna作為模板，既減少了逆轉(zhuǎn)錄的中間過(guò)程和人為操作帶來(lái)的誤差，又克服了以往lamp易出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。