專利名稱：：利用reg4蛋白診斷胰腺癌癥的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物科學領域，更具體地說，涉及癌癥i貪斷領域。特別是，本發(fā)明涉及利用REG4蛋白作為血清學標志診斷胰腺癌癥的方法，以及用于所述診斷的試劑和試劑盒。
背景技術：
：在西方世界，胰腺導管腺癌(PDAC)排在癌癥死亡原因的第五位，其在惡性腫瘤中死亡率最高，5年存活率只有4%(DiMagnoEP，"a/.,(l"9)Gastroenterology.;117(6):1464-84.，ZervosEE,"a/.,(2004)CancerControl.;ll(l):23-31.)。在美國，大約30,700名患者被診斷為胰腺癌癥，其中幾乎30,000名會死于該病(JemalA,"a/.，(2003)CACancerJClin.;53(l):5-26)。由于大多數(shù)PDAC患者在診斷時是晚期，目前尚無有效治療方法；只有手術切除能提供少許治愈的可能性，但是80%-90%接受手術的PDAC患者會復發(fā)及死于該病(DiMagnoEP,^"/.,(1999)Gastroenterology.;117(6):1464-84.，ZervosEE,&a/.，(2004)CancerCon加l.;ll(l):23-31)。一些外科方法和化學療法(包括5-FU或吉西他濱)，結合或不結合放射，能提高患者的生活質量(DiMagnoEP,a/.，(1999)Gastroenterology.;117(6):1464-84.，ZervosEE,&(2004)CancerControl.;11(1):23-31),但是那些療法對PDAC患者長期生存的作用非常有限，因為胰腺癌癥極具侵襲性和化療耐藥性。因此，大多數(shù)晚期PDAC患者的治療集中在姑息療法(palliativemeasures)(DiMagnoEP,a/.,(1999)Gastroenterology.;117(6):1464-84.，ZervosEE,"a/.,(2004)CancerControl.;11(1):23-31)。PDAC這種可怕的預后源于幾個原因，包括早期PDAC難以檢測(ZervosEE,^a/.,(2004)CancerControl.;11(1):23-31)。盡管在診斷影像學方面有一些進步，比如內鏡超聲檢查(EUS)或磁共振胰膽管造影術(MRCP),但是大多數(shù)患者直到疾病晚期才出現(xiàn)癥狀，因此，直到顯現(xiàn)癥狀才會接受影像學檢查。準確且容易的血清學試驗，例如前列腺癌癥中的前列腺特異性抗原(PSA)，可以促進沒有表現(xiàn)癥狀的早期PDAC的檢測，通過所迷試驗進行的篩查可以應用于大量群體以纟企測早期PDAC。早期胰腺癌癥手術切除可以提供相對有利的預后，5年存活率可達50%-60%,而晚期胰腺癌的存活率4又百分之幾(ZervosEE,efa/.,(2004)CancerControl.;11(1):23-31)?？紤]到PDAC的生物學侵襲性和對化學療法的抵抗，改善致命的PDAC的預后的最現(xiàn)實的策略之一是采用非侵入性血清學試驗來篩查高危人群，才企測手術切除可能治愈的早期PDAC。目前，CA19-9是唯一可商購的用于PDAC的血清學標志物，然而，大約10%-15%的個體由于其Lewis抗原體質而不分泌CA19-9，而且當胰腺癌癥處于早期且無癥狀的階段時CA19-9水平通常在正常范圍內，因此CA19-9的區(qū)分值專交差(SawabuN,"a/.，(2004)Pancreas.;28(3):263-7.,PleskowDK,"a/.,(1989)AnnInternMed.;110(9):704-9)。因此，迫切需要鑒定新型PDAC腫瘤標志物，利用所述血清學標志物如前列腺癌中的PSA，制定篩查策略以;險測早期胰腺癌。
發(fā)明內容本發(fā)明基于朋G^基因在胰腺癌癥中特異性過表達這一發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明人在進行全基因組cDNA《效陣列分析(NakamuraT,da/.,(2004)Oncogene.;23(13):2385-400,WO2004/031412)時，鑒定出數(shù)十種在PDAC細胞中上調的基因，對于本研究，本發(fā)明人集中于其中的朋G4(GenBank登錄號AY126670;SEQIDNO:13的核苷酸序列，編碼SEQIDNO:14的氨基酸序列)。本發(fā)明人關于20個顯微解剖的PDAC細胞群體的微陣列數(shù)據(jù)顯示了i^G4在經;險查、可提供信息的10個病例中高水平上調(NakamuraT,etal.,(2004)Oncogene;23(13):2385-400)，這次在經4全查的12個顯樣吏解剖的PDAC細胞群體(已經用于以前的微陣列分析)的6個中，用RT-PCR確認了REG4過表達(圖1A)。盡管在以前的研究中，朋G4也被稱為朋G/F(GenBank登錄號AA316525),但是REG4和REGIV是相同的分子。雖然本發(fā)明人已經鑒定了i^G4基因在胰腺癌癥組織中是上調的，但是，預期患有早期癌癥或具有良好預后的PDAC患者血中REG4水平有所提高這一發(fā)現(xiàn)對本發(fā)明來說是新穎的。而且，胰腺癌癥患者血中REG4的水平提高顯示，該基因和其蛋白作為新型診斷標志物(即全血、血清或血漿)可能是有用的。此外，本發(fā)明人建立了夾心ELISA,以檢測患有可切除PDAC的患者中的血清REG4。因此，本發(fā)明提供診斷受試者中的胰腺癌癥的方法，所述方法包括如下步驟測定源自受試者的血液樣品中REG4水平，將該水平與參比試樣(通常是正常對照)中觀察到的水平相比較。樣品中的高REG4水平表示該受試者患有胰腺癌癥或處于發(fā)生胰腺癌癥的危險中。術語"正常對照水平，，表示與正常、健康的個體，或與已知未患有胰腺癌癥的個體的群體相關的水平?？梢岳妹庖邷y定(例如ELISA)檢測REG4蛋白來測定REG4水平。源自受試者的血液樣品可來自于全血、血清和血漿，所述全血、血清和血漿來源于受試者，例如已知或懷疑患有胰腺癌癥的患者。另外，本發(fā)明提供進一步包括如下步驟的上述方法測定源自受試者的血液樣品中CA19-9的水平，將CA19-9水平與參比^樣(通常是正常對照)中觀察到的水平相比較。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過考慮RBQ^和CA19-9兩者的水平，可以更靈敏地鑒定患有胰腺癌癥的患者。此外，本發(fā)明還提供包含抗-REG4抗體的、用于檢測REG4的免疫測定試劑?？?REG4抗體可包括多克隆抗體和單克隆抗體，或者至少兩種識別彼此不同的REG4抗原決定簇的單克隆抗體。最后，本發(fā)明還提供檢測胰腺癌癥的試劑盒，包括(i)用于測定血液樣品中REG4水平的免疫測定試劑；和(ii)REG4的陽性對照樣品。所述試劑盒可進一步包括(iii)用于測定血液樣品中CA19-9水平的免疫測定試劑；和(iv)CA19-9的陽性對照樣品。根據(jù)以下的詳細說明和權利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將顯而易見。應該理解的是，上述
發(fā)明內容和以下的詳細說明都是優(yōu)選的實施方案，不限制本發(fā)明或本發(fā)明其它備選的實施方案。圖1顯示了(A)針對顯微解剖的PDAC細胞(1-12)中和爿CT5的mRNA表達的RT-PCR,與也經過顯微解剖的正常胰腺導管上皮細胞(N)比較；和(B),在利用抗-REG4抗體的免疫組織化學研究中，在一些PDAC細胞中強染色(上圖面，原始放大率x200)。在細胞質觀察到REG4的陽性染色。在正常胰腺組織中，腺泡細胞顯示弱染色(下圖面，原始放大率x200)，但在正常的導管上皮細胞和胰島細胞中不顯示染色。圖2顯示了用于REG4水平檢測的夾心ELISA的標準曲線。圖3顯示了123名健康人中REG4水平的分布。血清REG4濃度用ELISA方法測定。圖4顯示了7名患有可切除的PDAC患者術前和術后的血清REG4水平。白條，術前；黑條，術后。推定血清REG4的正常范圍為9.0ng/mL(虛線)以下。圖5顯示了用于測定REG4水平的改良夾心ELISA的標準曲線。圖6顯示了(A)利用REG4或CA19-9作為標志物的診斷結果表；和(B)REG4陽性群體和CA19-9陽性群體之間重疊的Venn圖。"+"4戈表陽性結果；"-，，代表陰性結果。有59個胰腺癌癥樣品，29個REG4陽性樣品和45個CA19-9陽性樣品。其中，22個樣品對REG4和CA19-9都呈陽性，7個樣品對REG4和CA19-9呈陰性。圖7顯示了利用每種用于測定REG4水平的抗REG4單克隆抗體(克隆21-1、24-1、34-1)的夾心ELISA的標準曲線。圖8描述了9名胰腺癌癥患者和28名健康人血清中REG4蛋白的檢測。本發(fā)明的具體實施例方式除非另有特定的說明，本說明書中使用的術語"一個(a)"或"一種(an)"和"該(the)"是指至少一個或至少一種。在本發(fā)明中，將REG4—REG源自再生中的胰島(regeneratingislet-derived)家力美(HartupeeJC,efa/.,(2001)BiochimBiophysActa.;1518(3):287-93)的一個新成員一鑒定為胰腺癌癥的生物標志物。本發(fā)明人已經報道了顯微解剖的胰腺癌癥細胞的全基因組cDNA微陣列(NakamuraT，(2004)Oncogene.;23(13):2385-400)。盡管在所述報道中，發(fā)現(xiàn)REG4在胰腺癌癥細胞中過表達，但沒有提供關于血中REG4水平如何與胰腺癌相關的證據(jù)。REG家族是與消化器官中組織再生和炎癥有關的分泌型分子(HartupeeJC，"a/"(2001)BiochimBiophysActa.;1518(3):287-93.,WatanabeT，a/"(19卯)JBiolChem.;265(13):7432-9"U翻M,da/"(1992)AdvExpMedBiol,;321:61-6;discussion67-9),而且REG家族在幾種胃腸道癌癥中是上調的(U腸M,da/"(1992)AdvExpMedBiol.;321:61-6;discussion67-9"LasserreC，a/.，(1992)CancerRes.;52(18):5089-95.,KamarainenM，e^/.，(2003)AmJPathol.;163(1):11-20),并可能作為營養(yǎng)因子或抗細胞凋亡因子在癌癥中發(fā)揮作用(LasserreC,"a/.,(1992)CancerRes.;52(18):5089-95),但是仍不清楚它們的病理生理學功能，特別是新成員REG4的功能和表達模式。本發(fā)明人已生產出REG4特異性抗體，并且通過利用抗REG4抗體的免疫組織化學驗證了其在PDAC細胞中的過表達。此外，本發(fā)明人建立了夾心ELISA系統(tǒng)以測量PDAC患者血清中的REG4水平，證明了REG4作為胰腺癌癥的新血清學標志物的應用。it斷胰月泉癌癥通過測量源自受試者的血液樣品中的REG4水平，可以確定受試者中胰腺癌癥的發(fā)生或者發(fā)展成胰腺癌癥的傾向(predisposition)。因此，本發(fā)明涉及確定(例如測量)血液樣品中REG4水平。在本發(fā)明中，診斷胰腺癌癥的方法還包括檢驗或檢測胰腺癌癥的方法?；蛘撸诒景l(fā)明中，診斷胰腺癌癥還指顯示受試者中患胰腺癌癥的懷疑、風險或可能性。任何血液樣品都可以用于4全測REG4水平，只要所述樣品中可^r測出愿G4基因或REG4蛋白。優(yōu)選地，所述血液樣品包含全血、血清和血漿。在本發(fā)明中，"血液樣品中REG4水平，，指已對全血中血細胞體積(corpuscularvolume)校正后血中存在的REG4的濃度。技術人員將認識到，個體間血中血細胞體積的比例變化很大。例如，全血中紅細胞的比例在男性和女性之間明顯不同。此外，個體間差異不容忽視。因此，某一物質在包含血細胞成分的全血中的表觀濃度，根據(jù)血細胞體積的比例不同而變化很大。例如，即使血清中的濃度一樣，有大量血細胞成分的樣品的測定值也會比有少量血細胞成分的樣品的值低。因此，為了比較血中成分的測定值，通常使用已經對血細胞體積進行了才交正的值。舉例來說，通過從全血中分離血細胞獲得血清或血漿，利用所述血清或血漿作為樣品測量血中成分，可以獲得已經消除來自血細胞體積的影響的測定值。因此，通?？梢詼y定血清或血漿中的濃度來作為本發(fā)明中REG4的水平。或者，可以首先將其測定為全血中的濃度，然后可校正來自血細胞體積的影響。用于測量全血液樣品中血細胞體積的方法是已知的。根據(jù)本方法診斷胰腺癌癥的受試者優(yōu)選哺乳動物，包括人、非人靈長目、小鼠、大鼠、犬、貓、馬和牛。本發(fā)明優(yōu)選受試者為人。在本發(fā)明中，受試者可以是懷疑患有胃腸系統(tǒng)(例如胰腺)癌癥的患者或者是健康個體?？梢岳帽景l(fā)明診斷患者以促進臨床決策。在另一實施方案中，也可以將本發(fā)明應用于健康個體以篩查胃腸系統(tǒng)(即胰腺)的癌癥。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過測量血液樣品中REG4蛋白的量或濃度來確定REG4水平。測定血液樣品中REG4蛋白量的方法包括免疫測定法。在本發(fā)明的診斷方法中，除了REG4的血液濃度夕卜，還可以測定CA19-9的血液濃度以檢測胰腺癌癥。因此，本發(fā)明4是供診斷胰腺癌癥的方法，其中，當REG4的血液濃度或CA19-9的血液濃度之一，或者兩者都高于健康個體時，則檢出胰腺癌癥。眾所周知，CA19-9是胰腺癌、結腸癌、胃癌和卵巢癌的血清學腫瘤標志物。CA19-9的表位是糖蛋白(黏蛋白)上的糖脂，其相當于有附加的唾液酸殘基的Lewis(a)血型決定簇。該抗原由針對在人結腸直腸癌細胞系中發(fā)現(xiàn)的決定簇所制備的單克隆抗體來定義。除了成人胰腺、唾液導管、胃和結腸上皮、胰液、胃液、唾液和胎糞外，在正常胎兒組織中也發(fā)現(xiàn)了這種抗原。CA19-9通過膽道系統(tǒng)從循環(huán)中移除。這種抗原在有基因型Lewis(a-b-)的人(相當于約5%的人口)中不表達。如上所述，已經將CA19-9用作診斷或檢測胰腺癌癥的血清學標志。但是CA19-9作為胰腺癌癥標記物的靈敏度，對于完全檢測胰腺癌癥而言還有一定不足。因此，需要提高診斷胰腺癌癥的靈敏度。在本發(fā)明中，提供一種用于胰腺癌癥的新型血清學標志物——REG4。通過本發(fā)明，可以改善胰腺癌癥的診斷或檢測方法的靈敏度。即，本發(fā)明提供一種診斷受試者中胰腺癌癥的方法，包括如下步驟(a)從待診斷的受試者收集血液樣品；(b)測定血液樣品中的REG4水平；(c)將步驟(b)中測定的REG4水平與正常對照的REG4水平相比較，其中與正常對照相比，血液樣品中的高REG4水平表示該受試者患有胰腺癌癥。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的診斷或檢測方法可進一步包括如下步驟(e)測定血液樣品中的CA19-9水平；(f)將步驟(e)中測定的CA19-9水平與正常對照的CA19-9水平相比較；和(g)判斷與正常對照相比血液樣品中高REG4水平和/或高CA19-9水平表示該受試者患有胰腺癌癥。通過REG4和CA19-9的組合，可以顯著提高檢測胰腺癌的靈敏度。例如，在下面討論的實際實施例所分析的組中，胰腺癌癥的CA19-9陽性率為約76.3%。與之相比，REG4和CA19-9的組合的陽性率增加至88.1%(圖6)。在本發(fā)明中，"REG4和CA19-9的組合"指用CA19-9水平和REG4水平中的任一種或者同時用兩者作為標記物。在優(yōu)選的實施方案中，可判斷CA19-9和REG4中任一種陽性的患者有較高的患胰腺癌組合的危險。應用REG4和CA19-9的組合作為胰腺癌癥血清學標志是新穎的。因此，與根據(jù)單獨測量CA19-9的結果進行的測定相比，本發(fā)明可大大改善檢測胰腺癌癥患者的靈敏度。這種改善背后的事實是，CA19-9陽性患者組和REG4陽性患者組不是完全一致的。進一步描述這個事實，具體如下。首先，根據(jù)CA19-9測量的結果有比標準值更低的值(即未患有胰腺癌癥)的患者中，實際上有一定比例的患者患有胰腺癌癥。所述患者稱為CA19-9假陰性患者。通過將基于CA19-9的檢測和基于REG4的檢測結合，可以從CA19-9假陰性患者中發(fā)現(xiàn)REG4值高于標準值的患者。換句話說，本發(fā)明提供一種手段，從因CA19-9的血液濃度低而被錯誤地確定為"陰性的"患者中，鑒定出事實上患有胰腺癌癥的患者。因此本發(fā)明提高檢測胰腺癌患者的靈敏度。通常，簡單地結合利用多種標記物測定的結果可以增加檢測靈敏度，但另一方面，其常常導致特異度降低。然而，本發(fā)明通過確定靈敏度和特異度之間的最佳平衡，已確定了一種特征性組合，其可以增加檢測靈敏度而不損害特異度。在本發(fā)明中，為了同時考慮CA19-9測量的結果，可以例如測量CA19-9的血液濃度并將其與標準值相比較(以與上述REG4的測定值與標準值之間的比較相同的方式)。例如，如何測量CA19-9的血液濃度并將其與標準值比較是已知的。此外，用于CA19-9的ELISA試劑盒也是商業(yè)上可得到的。這些在已知報道中描述的方法可用在本發(fā)明的方法中以診斷或4企測胰腺癌癥。在本發(fā)明中，REG4血液濃度的標準值可通過統(tǒng)計學方法確定。例如，可以測量健康個體中REG4的血液濃度，以通過統(tǒng)計學方法確定REG4的標準血液濃度。當形成統(tǒng)計學上充足的群體時，常常用相對于平均值2倍或3倍標準偏差(S.D.)范圍的值作為標準值。因此，相當于平均值+2xS.D.或平均值+3xS.D.的值可用作標準值。所述設定的標準值理論上分別包括90%和99.7%的健康個體?；蛘撸部梢愿鶕?jù)胰腺癌癥患者中REG4的實際血液濃度設定標準值。通常，以這種方法設定的標準值使假陽性的比例減到最小，所述標準值從滿足能夠使檢測靈敏度達到最大的條件的一定范圍的值中選擇。本說明書中，"假陽性比例"指健康個體中，REG4的血液濃度被判斷為高于標準值的患者的比例。相反，健康個體中，REG4的血液濃度被判斷為低于標準值的患者的比例表示特異度。即，假陽性比例和特異度的和總是1。"檢測靈敏度"指在已經確定存在胰腺癌癥的個體的群體里的所有胰腺癌癥患者中，REG4的血液濃度被判斷為高于標準值的患者的比例。此外，在本發(fā)明中，REG4的血液濃度被判斷為高于標準值的患者中胰腺癌癥患者的比例代表陽性預測值。另一方面，REG4的血液濃度被判斷為低于標準值的患者中健康個體的比例代表陰性預測值。所述這些值之間的關系總結于表l。正如如下所示的關系所表明的，靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值，這些值(它們都是評估胰腺癌癥的診斷準確度的指標)中每一個都隨著用于判斷REG4血液濃度水平的標準值而變化。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>正如已經提到的，通常設定一個標準值以使假陽性率低，靈敏度高。但是，由上述所示的關系也明顯可見，假陽性率與靈敏度之間有一個權衡取舍的關系。即，如果標準值降低，則檢測靈敏度增加。然而，由于假陽性率也增加，所以很難滿足具有"低假陽性率"的條件。鑒于這種情況，舉例來說，可以選擇產生下列預測結果(predictedresult)的值作為本發(fā)明的優(yōu)選標準值。假陽性率是50%或更低的標準值(即特異度不低于50%的標準值)。靈敏度不低于20%的標準值。在本發(fā)明中，可以利用接受者搡作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲線來設定標準值。ROC曲線是一個縱軸顯示檢測靈敏度，橫軸顯示假陽性率(即"1-特異度")的曲線圖。在本發(fā)明中，可通過連續(xù)地改變用于檢測REG4血液濃度高/低程度的標準值后，將靈敏度和假陽性率的變化作圖來獲得ROC曲線。用于獲得ROC曲線的"標準值"是一個臨時用于統(tǒng)計學分析的值。用于獲得ROC曲線的"標準值，，通?？梢栽谝粋€可覆蓋所有可選擇的標準值的范圍內連續(xù)地變化。例如，標準值可在被分析的群體中最小和最大的REG4測定值之間變化?；讷@得的ROC曲線，欲用于本發(fā)明的優(yōu)選的標準值可以選自滿足上述條件的范圍?；蛘?，可以根據(jù)ROC曲線選擇標準值，所述ROC曲線通過使標準值在包含大多數(shù)REG4測定值的范圍內變化而產生?？梢杂萌魏慰啥康鞍踪|的方法來測量血中的REG4。例如，本發(fā)明中可應用免疫測定、液相色譜法、表面等離子體共振(SPR)、質譜法等。在質譜法中，可通過使用合適的內標來定量蛋白質。例如，同位素標記的REG4可用作內標。血液中REG4的濃度可以由血液中REG4的峰強度和內標的峰強度確定。通常，基質輔助激光解吸電離(MALDI)方法用于蛋白質的質譜法。通過利用質譜法或液相色譜法的分析方法，也可以將REG4與其它腫瘤標志物(例如CA19-9)同時分析。本發(fā)明中一種優(yōu)選的測量REG4的方法是免疫測定。REG4的氨基酸序列是已知的(Genbank登錄號AY126670)。REG4的氨基酸序列顯示在SEQIDN0:14,編碼它的cDNA的核苷酸序列顯示在SEQIDNO:13。因此，本領域技術人員可以通過根據(jù)REG4的氨基酸序列合成必要的免疫原來制備抗體。利用肽合成儀可容易地合成用作免疫原的肽。所述合成肽可以通過與載體蛋白連接而用作免疫原。鑰孔血藍蛋白(KLH)、肌紅蛋白、白蛋白等可以用作載體蛋白。優(yōu)選的載體蛋白是KLH、牛血清白蛋白等。通常使用馬來酰亞胺苯曱酰-N-氛3虎3白醜亞胺國旨(maleimidobenzoyl-N—hydrosuccinimideester)方'法(下文纟宿寫為MBS方法)等將合成肽與載體蛋白連接。具體地，將半胱氨酸引入合成肽，利用半胱氨酸的SH基團通過MBS將所述肽與KLH交聯(lián)。可以在所述合成肽的N-末端或C-末端引入半胱氨酸殘基。或者，可以利用REG4的核香酸序列(Genbank登錄號AY126670)或其一部分制備REG4?？梢岳糜杀磉_REG4的組織制備的mRNAs來克隆包含必要的核苷酸序列的DNA?；蛘?，可以用商業(yè)上可得到的cDNA文庫作為克隆來源。獲得的REG4的遺傳重組體或其片段也可以用作免疫原。優(yōu)選用這種方式表達的REG4重組體作為免疫原，獲得用于本發(fā)明中的抗體。商業(yè)上可得到的REG4重組體(ProSpec-TanyTechnoGeneLtd.,ProductNo:PRO-424)也可以用作免疫原。將用這種方式獲得的免疫原與適當?shù)淖魟┗旌?，用來免疫動物。已知的佐劑包括弗氏完全佐?FCA)和不完全佐劑。以適當?shù)臅r間間隔重復免疫程序，直到確定抗體滴度增加。本發(fā)明中對免疫動物無特殊限定。具體地，可以應用通常用于免疫的動物例如小鼠、大鼠或兔。當獲得抗體為單克隆抗體時，可以使用有利于其生產的動物。例如在小鼠中，許多用于細胞融合的骨髓瘤細胞系是已知的，用于高概率地建立雜交瘤的技術也已是眾所周知的。因此，小鼠是用來獲得單克隆抗體的理想免疫動物。此外，免疫處理不限于體外處理。也可采用在體外對培養(yǎng)的免疫活性細胞進行免疫致敏的方法。轉化并克隆用這些方法獲得的抗體產生細胞。用于轉化抗體產生細胞以獲得單克隆抗體的方法不限于細胞融合。例如，通過病毒感染獲得可克隆的轉化體的方法是眾所周知的?？梢愿鶕?jù)產生用于本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤對REG4的反應性來對其進行篩選。具體地，首先利用針對用作免疫原的REG4(或其域肽)的結合活性作為指標來選擇抗體產生細胞。根據(jù)需要對通過所述篩選所選擇的陽性克隆進行亞克隆?？梢酝ㄟ^在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)已建立的雜交瘤并收集產生的抗體來獲得欲用于本發(fā)明的單克隆抗體。當雜交瘤是同種雜交瘤(homohybridoma)時，可以將它們在同系動物中腹膜內接種從而在體內培養(yǎng)。在此情況下，收集腹水作為單克隆抗體。當使用異種雜交瘤時，可以用棵鼠作為宿主在體內培養(yǎng)它們。除體內培養(yǎng)外，還經常在適當?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境下離體培養(yǎng)雜交瘤。例如，基本培養(yǎng)基例如RPMI1640和DMEM通常用作雜交瘤的培養(yǎng)基。可以將添加劑(例如動物血清)添加到所述培養(yǎng)基中以使抗體產生能力維持在高水平。當離體培養(yǎng)雜交瘤時，可收集培養(yǎng)上清作為單克隆抗體?？梢酝ㄟ^培養(yǎng)后與細胞分離，或者通過采用中空纖維的培養(yǎng)設備培養(yǎng)時連續(xù)收集，來收集培養(yǎng)上清。用飽和硫酸銨沉淀分離免疫球蛋白級分，并進一步用凝膠過濾、離子交換層析等純化，從而由作為腹水或培養(yǎng)上清收集的單克隆抗體制備用于本發(fā)明的單克隆抗體。此外，如果單克隆抗體是IgGs,則基于蛋白A或蛋白G柱親和層析的純化方法是有效的?？捎迷诒景l(fā)明的免疫測定中的單克隆抗體的一個例子是小鼠單克隆的克隆21-1抗體。更具體地說，優(yōu)選小鼠單克隆的克隆21-1抗體，或包含其可變區(qū)的抗體片段，作為用在本發(fā)明的免疫測定中的單克隆抗體。例如，單克隆的克隆21-1抗體，或具有與這種抗體等效的抗原結合活性的單克隆抗體，可作為固定化抗體用于基于夾心法的免疫測定。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，可以通過夾心法測量REG4，所述夾心法使用固定化到載體上的單克隆抗體和標記的多克隆抗體。這樣的抗體的組合是允許高靈#文度檢測REG4的優(yōu)選組合。單克隆的克隆21-1抗體的VH和VL的氨基酸序列分別顯示于SEQIDNOs:16和24。本領域技術人員可以基于所述氨基酸序列信息通過基因工程生產具有相同結合活性的單克隆抗體。此外，可以通過將VH和VL的CDR1、CDR2和CDR3移植到其它免疫球蛋白的框架中，來重建具有相等抗原結合活性的抗體?？寺?1-1的VH和VL的CDR由如下所示的氨基酸序列組成。每個氨基酸序列由如下顯示的SEQIDNO的核苦酸序列編碼。因此，用包含所述核苷酸序列的DNA取代其它免疫球蛋白的相應CDR,可以將克隆21-1的抗原結合活性移植到其它免疫球蛋白。重鏈核苷酸序列CDR1SEQIDNO:17CDR2SEQIDNO:19CDR3SEQIDNO:21輕鏈CDR1SEQIDNO:25CDR2SEQIDNO:27CDR3SEQIDNO:29氨基酸序列SEQIDNO:18SEQIDNO:20SEQIDNO:22SEQIDNO:26SEQIDNO:28SEQIDNO:30本發(fā)明提供的克隆21-1是一種新型單克隆抗體，其對于REG4的免疫測定是有用的。因此，本發(fā)明提供包含上述氨基酸序列作為CDRs的抗-REG4單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選包含SEQIDNOs:16和24的氨基酸序列，分別作為VH和VL的氨基酸序列?？梢詫⒕幋a氨基酸序列的DNA整合在適當?shù)谋磉_載體中從而表達在其可變區(qū)包含SEQIDNO:16和24的氨基酸序列的免疫球蛋白。通過將所述DNA連同編碼恒定區(qū)DNA—起表達，也可獲得帶有恒定區(qū)的免疫球蛋白。在本發(fā)明的免疫測定中，帶有恒定區(qū)的完整的免疫球蛋白可以用作抗體，或者帶有抗原結合區(qū)的免疫球蛋白片段也可以用作抗體?？蓪⑿盘栃蛄屑又量勺儏^(qū)的N-末端以從宿主細胞分泌表達產物。VH和VL的氨基酸序列(信號序列已加至所述氨基酸序列)分別顯示于SEQIDNO:32和34,編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列分別顯示于SEQIDNOs:31和33。另一方面，為了獲得作為多克隆抗體用于本發(fā)明的抗體，從免疫后抗體滴度增加的動物抽取血，分離血清以獲得抗血清。用已知的方法乂人抗血清純化免疫球蛋白，以制備用于本發(fā)明的抗體。REG4特異度抗體可以通過免疫親和層析(用REG4作為配體)和免疫球蛋白純化的聯(lián)用來制備。當針對REG4的抗體與REG4接觸時，抗體與抗原決定簇(表位)結合，抗體通過抗原-抗體反應識別抗原決定簇?？梢杂酶鞣N免疫測定方法檢測抗體與抗原的結合。免疫測定大致上可分為異源分析方法和同源分析方法。為了使免疫測定的靈敏度和特異度維持在較高水平，使用單克隆抗體是理想的。具體解釋本發(fā)明用各種免疫測定形式測量REG4的方法。首先，描述用異源免疫測定測量REG4的方法。在異源免疫測定中，需要一種機制，用于在將能結合REG4的抗體與不能結合REG4的抗體分離后，檢測能結合REG4的抗體。為了促進分離，通常使用固定化試劑。例如，首先制備其上已固定有識別REG4的抗體的固相(固定化抗體)。使REG4與所述固定化抗體結合，進一步使第二抗體與其反應。當將固相與液相分開并進一步洗滌時，必要時，第二抗體與REG4的濃度成比例地保留在固相上。通過標記第二抗體，可以測量源自標記的信號/人而對REG4定量?？梢允褂萌魏畏椒ㄊ箍贵w結合到固相。例如，抗體可物理吸附到疏水性材料上，例如聚笨乙烯?；蛘撸贵w可化學結合到多種表面具有官能團的材料上。此外，可以利用結合配體的結合伴侶來捕獲用該配體標記的抗體，使其結合到固相上。結合配體與其結合伴侶的結合包括抗生物素蛋白-生物素等?？梢栽诘谝豢贵w與REG4之間反應的同時或之前將固相與抗體偶聯(lián)。同樣地，不需要直接標記第二抗體。即，可以用針對抗體的抗體或用結合反應(例如抗生物素蛋白-生物素)間接標記第二抗體。樣品中REG4的濃度根據(jù)用已知REG4濃度的標準樣品獲得的信號強度來測定。可以使用任何抗體作為用于上述異源免疫測定的固定化抗體和第二抗體，只要所述抗體是識別REG4的抗體或其包含抗原結合位點的片段。因此，所述抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體，或者兩者的混合物或組合。例如，單克隆抗體和多克隆抗體的組合是本發(fā)明中優(yōu)選的組合?；蛘?，當兩種抗體都是單克隆抗體時，優(yōu)選組合識別不同表位的單克隆抗體。由于欲測量的抗原被夾在抗體之間，所以這樣的異源免疫測定稱為夾心法(sandwichmethods)。由于夾心法在測量靈壽文度和重現(xiàn)性方面有優(yōu)勢，所以它們是本發(fā)明中優(yōu)選的測量原理。于樣品中的REG4竟爭性抑制已知濃度的REG4與抗體的結合這樣一種現(xiàn)象的免疫測定。通過標記已知濃度的REG4并測定與抗體反應(或不反應)的REG4的量，可以確定樣品中REG4的濃度。當已知濃度的抗原和樣品中的抗原同時與抗體反應時，竟爭反應系統(tǒng)成立。此外，當使抗體與樣品中的抗原反應，其后與已知濃度的抗原起反應時，基于抑制反應系統(tǒng)的分析是可能的。在所述兩種類型的反應系統(tǒng)中，通過將抗體或者用作試劑成分的已知濃度的抗原中的任一種設定為標記成分，并將另一種設定為固定化試劑，可以構建可操作性優(yōu)異的反應系統(tǒng)。放射性同位素、熒光物質、發(fā)光物質、具有酶活性的物質、肉眼可觀測的物質、磁性可觀測的物質等用于所述異源免疫測定。這些標記物質的具體例子如下所示。具有酶活性的物質過氧化物酶，堿性磷酸酶，脲酶，過氧化氫酶，葡糖氧化酶，乳酸脫氫酶，或淀粉酶，等熒光物質異硫氰酸熒光素，四曱基羅丹明異硫氰酸鹽或酯，取代的羅丹明異硫氰酸鹽或酯，或二氯三。秦異硫氰酸鹽或酯，等放射性同位素氮，1251,或1311，等其中，非放射性標記例如酶是在安全性、可操作性、靈敏度等方面有利的標記。可以用已知方法例如高碘酸方法或馬來酰亞胺方法將酶標記與抗體或REG4連接。珠子、容器內壁、細顆粒、多孔載體、磁性粒子等用作固相?？梢詰美缇郾揭蚁?、聚碳酸酯、聚乙烯基曱苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚曱基丙烯酸酯、膠乳、明膠、瓊脂糖、玻璃、金屬、陶瓷等材料形成的固相。已將用于化學結合抗體等的官能團引入上述固體材料的表面上，這樣的固體材料也是已知的。已知的結合方法，包括化學結合(例如多聚-L-賴氨酸或戊二隧處理)和物理吸附，也可應用于固相和抗體(或抗原)。雖然在本說明書例示的所有異源免疫測定中都需要將固相與液相分離的步驟和洗滌步驟，但是可以利用免疫層析方法(這是夾心法的一種變化)容易地進行這些步驟。具體地，將欲固定的抗體固定到能利用毛細現(xiàn)象運送樣品溶液的多孔載體上，然后在其中利用所述毛細現(xiàn)象展開包含REG4和經標記的抗體的樣品混合物。展開期間，REG4與經標記的抗體反應，當其進一步與固定化抗體接觸時，其在那個位置被捕獲。不與REG4反應的經標記抗體不被固定化抗體捕獲而通過。結果，利用保留在固定化抗體位置的經標記的抗體的信號作為指標，可以檢測出REG4的存在。如果預先使經標記的抗體保留在多孔載體中的上游，則可僅通過滴加樣品溶液啟動和完成所有反應，可構建非常簡單的反應系統(tǒng)。在免疫層析方法中，可以結合肉眼可區(qū)分的標志成分(例如著色粒子)，以構建甚至不需要特殊讀取裝置的分析設備。此外，在免疫層析方法中，可調節(jié)REG4的檢測靈敏度。例如，通過調節(jié)如下所述的截斷值附近的檢測靈敏度，可以在超出截斷值時檢出上述標記成分。使用這樣一種設備，可以很簡單地判斷受試者是陽性的還是陰性的。采用可肉眼區(qū)分標記的構造，可以簡單地將血液樣品加樣于免疫層析設備而獲得必要的試驗結果。將用于調節(jié)檢測靈敏度的第二固定化抗體置于加樣位置和固定化抗體之間(特開平6-341989(公布未審查的日本專利申請))。當樣品中的REG斗從加樣位置向用于標記檢測的第一固定化抗體的位置展開時，被第二固定化抗體捕獲。第二固定化抗體飽和后，REG4可到達位于下游的第一固定化抗體的位置。結果，當樣品中包含的REG4濃度超過預定濃度時，在第一固定化抗體的位置檢測到與經標記的抗體結合的REG4。其次，說明同源免疫測定。與如上所述需要分離反應溶液的異源免疫學分析方法相對，還可利用同源分析方法測量REG4。同源分析方法允許檢測抗原-抗體反應產物，而無需將它們從反應溶液分離。一種代表性的同源分析方法是免疫沉淀反應，其中通過檢測抗原-抗體反應后產生的沉淀來定量分析抗原成分。多克隆抗體通常用于免疫沉淀反應。當應用單克隆抗體時，優(yōu)選使用能與不同REG4表位結合的多種類型的單克隆抗體。免疫學反應后的沉淀反應的產物可由肉眼觀測，或可通過光學測量轉換成數(shù)值數(shù)據(jù)。免疫學粒子凝集反應是一種通用的同源分析方法，利用抗體致敏的細顆粒在抗原作用下的凝集作為指標。與上述免疫沉淀反應中一樣，多克隆抗體或多種類型單克隆抗體的組合也可用在這種方法中。細顆粒的抗體致敏可以用抗體混合物致敏，或者可以通過混合分別用每種抗體致敏的粒子來制備這樣的細顆粒。用這種方式獲得的細顆粒一旦與REG4接觸就產生基質樣反應產物。反應產物可以作為粒子聚集來檢測。粒子聚集可由肉眼觀測或通過光學測定轉換成數(shù)值數(shù)據(jù)。基于能量轉移和酶引導作用(enzymechanneling)的免疫測定方法是已知的同源免疫測定法。在使用能量轉移的方法中，將具有供體/受體關系的不同的光學標記分別接到能夠識別抗原上靠近的表位的多種抗體上。當發(fā)生免疫反應時，兩個部分相互接近，發(fā)生能量轉移現(xiàn)象，其結果是產生熒光淬滅或者熒光波長的改變等信號。另一方面，酶引導作用為能夠結合鄰近的表位的多種抗體使用標記，其中所述標記是具有這樣的關系的酶的組合，即一種酶的反應產物是另一種酶的底物。當兩個部分由于免疫反應彼此靠近時，促進酶反應，從而它們的結合可以作為酶反應速率的變化被檢測到。在本發(fā)明中，可以從抽取自患者的血液制備用于測量REG4的血液。優(yōu)選的血液樣品是血清或血漿。測量前可將血清或血漿樣品稀釋?；蛘?，可以將全血作為樣品測量，然后可一交正得到的測定值以確定血清濃度。例如，全血中的濃度可通過測定同一血液樣品中血細胞體積的比例來校正至血清濃度。在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫測定包括ELISA。本發(fā)明人建立了夾心ELISA以;險測患有可切除PDAC的患者中血清REG4。然后將血液樣品中REG4水平與和標準樣品(例如正常對照樣品)有關的REG4水平相比較。短語"正常對照水平"指在未患有胰腺癌癥的群體的血液樣品中通常發(fā)現(xiàn)的REG4水平。優(yōu)選具有與試驗樣品相似性質的標準樣品。例如，如果試驗樣品包含患者血清，標準樣品也應是血清。來自于對照和試驗受試者的血液樣品中REG4水平可以同時測定，或者，作為選擇，可以根據(jù)分析先前從對照組收集的樣品中REG4水平得到的結果，用統(tǒng)計學方法測定正常對照水平。REG4水平還可以用于監(jiān)測胰腺癌癥的療程。在該方法中，由接受胰腺癌癥治療的受試者提供試驗血液樣品。優(yōu)選地，在治療前、治療期間或治療后的不同時間點從受試者獲得多個試驗血液樣品。然后可以將治療后樣品中REG4水平與治療前樣品中REG4水平相比較，或者，作為選擇，與標準樣品(例如正常對照水平)相比較。例如，如果治療后REG4水平比治療前REG4水平低，則可以做出治療有效的結論。同樣地，如果治療后REG4水平與正常對照REG4水平相似，則也可以^:出治療有效的結"^侖。"有效的"治療是導致受試者中REG4水平降低，或胰腺癌癥的大小、患病率或轉移潛能降低的治療。當預防性地應用治療時，"有效的"意味著治療延緩或阻止胰腺癌癥的發(fā)生，或減輕胰腺癌癥的臨床癥狀?？梢岳脴藴逝R床規(guī)程評估胰腺癌癥。此外，可以結合任何已知診斷和治療胰腺癌癥的方法來確定治療的有效性。例如，以組織病理學方法或通過鑒別癥狀異常來常規(guī)診斷胰腺癌癥。根據(jù)從如下所述實施例得到的結果，由本發(fā)明提供的胰腺癌血清學標志REG4在患有除了胰腺癌癥之外的癌癥的患者中也可以顯示高測定值。具體地，尤其對于胃癌癥和結腸癌癥觀察到較高的血液濃度。通過胃癌癥(OueN"""/.，(2005)J.Pathol"207(2):185-98)和結腸癌癥(VioletteS""a/.，(2003)Int.J.Cancer,103(2):185-93)中的免疫組織化學染色實際證實了較高的REG4表達。然而，利用其它診斷指標可以很容易地排除患有這些癌癥的可能性。因此，根據(jù)REG4或CA19-9和REG4的結合判斷為患有胰腺癌癥的患者也患有胃癌癥或結腸癌癥的可能性也可以很容易地排除。早期胰腺癌癥的診斷和檢測非常難，而其它胃腸(GI)惡性腫瘤的診斷或篩查已通過本領域眾所周知的內鏡或其它非侵入方法(如大便潛血和血清胃蛋白酶原)建立。如果應用本申請要求保護的方法來篩查GI疾病和檢測高水平的血清REG4，則可以應用內鏡程序——其已被承認為可靠且靈敏的方法一一來檢測GI疾病。如果內鏡檢查沒有在胃或結腸直腸中檢測出明顯的致病性病變，可以隨后應用侵入性或非侵入性診斷程序〔內鏡逆行胰膽管造影(ERCP)、內鏡超聲檢查(EUS)、磁共振胰膽管造影術(MRCP)等〕檢測早期胰腺癌癥。但現(xiàn)有技術沒有提供任何用于篩查早期胰腺癌癥的可靠工具。為了篩查其它GI惡性腫瘤，通常利用大便潛血和血清胃蛋白酶原。通過與其它血清學標志(例如CA19-9)和入侵性內鏡程序結合，本發(fā)明要求保護的方法是篩查胰腺癌癥的有用工具?？梢灶A先將根據(jù)本發(fā)明用于進行胰腺癌癥診斷的成分組合，作為檢測試劑盒提供。據(jù)此，本發(fā)明提供一種用于檢測胰腺癌癥的試劑盒，包括(i)用于才全測血液才羊品中REG4水平的免疫測定試劑；和(ii)REG4的陽性對照樣品。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可進一步包括(iii)用于斥企測血液樣品中CA19-9水平的免疫測定試劑；和(iv)CA19-9的陽性對照樣品。組成本發(fā)明試劑盒的免疫測定用試劑可以包括如上所述各種免疫測定所必需的試劑。具體地，免疫測定用試劑包括能識別待測量物質的抗體?？梢愿鶕?jù)免疫測定的測定形式修飾所述抗體。ELISA可用作本發(fā)明優(yōu)選的測定形式。在ELISA中，例如，通常應用固定到固相上的第一抗體和帶有標記的第二抗體。因此，用于ELISA的免疫測定試劑可以包括固定在固相載體上的第一抗體。細顆粒或反應容器內壁可以用作固相載體。磁性粒子可以用作細顆粒?；蛘?，多孔板(例如96孔微量培養(yǎng)板)常常用作反應容器。用于處理大量樣品的容器也是眾所周知的，其帶有高密度的、比96孔微量培養(yǎng)板體積小的孔。在本發(fā)明中，這些反應容器的內壁可以用作固相載體。用于ELISA的免疫測定試劑可進一步包括帶有標記的第二抗體。用于ELISA的第二抗體可以是直接或間接地與酶連接的抗體。將酶化學連接到抗體的方法是已知的。例如，可以酶切免疫球蛋白以獲得包括可變區(qū)的片段。通過使所述片段中包含的-SS-鍵還原成-SH基，可以附接上雙功能接頭。預先將酶與雙功能接頭連接，可以使酶與抗體片段連接?；蛘?，為了間接連接酶，例如，可以使用抗生物素蛋白-生物素結合。即，可以通過使生物素化的抗體與附接著有抗生物素蛋白的酶接觸，使酶間接地與抗體連接。另外，利用第三抗體(一種識別第二抗體的酶標抗體)可以使酶間接地與第二抗體連接。例如，如上述例示的那些酶可用作標記抗體的酶。本發(fā)明的試劑盒包括REG4的陽性對照。REG4的陽性對照包括預先測定了濃度的REG4。優(yōu)選濃度為，例如，在本發(fā)明的試驗方法中設定為標準值的濃度?；蛘?，也可以組合具有更高濃度的陽性對照。本發(fā)明中REG4的陽性對照還可包括預先測定了濃度的CA19-9。優(yōu)選包括REG4和CA19-9兩者的陽性對照作為本發(fā)明的陽性對照。因此，本發(fā)明提供一種用于檢測胰腺癌癥的陽性對照，其包括濃度超過正常值的REG4和CA19-9?；蛘撸景l(fā)明涉及包含濃度超過正常值的REG4和CA19-9的血液樣品在用于4企測胰腺癌癥的陽性對照的生產中的用途。已知CA19-9可以用作胰腺癌癥的指標；然而，REG4可以用作胰腺癌的指標是本發(fā)明獲得的新發(fā)現(xiàn)。因此，除包含CA19-9外還包含REG4的陽性對照是新穎的。本發(fā)明的陽性對照可以通過將濃度超過標準值的CA19-9和REG4添加到血液樣品中來制備。例如，包含濃度超過標準值的CA19-9和REG4的血清作為本發(fā)明的陽性對照是優(yōu)選的。本發(fā)明中的陽性對照優(yōu)選是液體形式的。在本發(fā)明中，使用血液樣品作為樣品。因此，用作對照的樣品也需要是液體形式?；蛘?，使用時以預先定量的液體溶解干燥的陽性對照，可以制備提供試驗濃度的對照。將干燥的陽性對照與溶解它所必需的一定量液體一起包裝，使用者可僅通過將它們混合而獲得必需的陽性對照。用作陽性對照的REG4可以是天然來源的蛋白質，或者其可以是重組蛋白。同樣地，對于糖抗原CA19-9，天然來源的糖抗原或化學合成的唾液酸化Lewis型糖抗原可以用作對照。不僅是陽性對照，陰性對照也可以組合在本發(fā)明的試劑盒中。用陽性對照或陰性對照來證實免疫測定顯示的結果是正確的。下述實施例意在闡明本發(fā)明，并幫助本領域普通技術人員制造和使用相同的發(fā)明。實施例并不意欲以任何方式另外限制本發(fā)明的范圍。除非另外限定，本說明書中使用的全部技術術語和科學術語均與本發(fā)明所屬
技術領域：
的普通技術人員一般理解的含義相同。盡管與本說明書中的所述類似或等同的方法和材料均可用于實施或檢驗本發(fā)明，但下文描述了合適的方法和材料。本說明書中引用的任何專利、專利申請和出版物均并入本文作為參考。在下文，將利用實施例對本發(fā)明進行具體描述，但是并不解釋成受其限制。實施例臨床樣品術前和術后(手術后一個月)血清樣品在適當?shù)闹橥庖?guī)則下得自7例因胰腺腺癌而接受胰十二指腸切除術的患者。來自PDAC的常規(guī)石蠟包埋組織切片在適當?shù)闹橥庖?guī)則下得自手術標本。血清樣本得自59名胰腺癌癥患者、35名其它胰腺疾病患者和56名正常健康供體。MG^的半定量RT-PCR分析PDAC細胞和正常胰腺導管上皮細胞的純化以前已有描述(NakamumT，"a/.,(2004)Oncogene.;23(13):2385-400);用基于T7的體外轉錄(EpicentreTechnologies,Madison,WI)對來自純化的細胞群體的RNA進行兩輪擴增。通過監(jiān)測作為定量對照的p-肌動蛋白G4c:re),本發(fā)明人制得了適合用于隨后PCR擴增的各單鏈cDNA的稀釋物。引物序列為5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3'(SEQIDNO:l)和5'-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3'(SEQIDNO:2)，用于5'-CCAATTGCTATGGTTACTTCAGG-3'(SEQIDNO:3)和5'-GAAAAACAAGCAGGAGTTGAGTG-3'(SEQIDNO:4),用于朋Gl所有反應在GeneAmpPCRsystem9700(PEAppliedBiosystems,Foster,CA)上，于如下條件下進行94。C預變性2min;和進行如下21個循環(huán)(用于爿C7S)或28個循環(huán)(用于朋G4):94°C30s，58°C30s和72°Clmin。重組hREG4(rhREG4)的產生(l)表達盒載體的構建構建了在CMV啟動子控制下利用IRES共表達靶基因和嘌呤霉素-EGFP融合蛋白的靶基因表達載體。KOD-Plus-(TOYOBO;KOD-201)用于基因擴增的所有PCR過程。首先，利用5'-TTAATTAACTCGAGGGATCCCCCTTCGAACAAAAACTCATC-3'(SEQIDNO:5)和5'陽GGCGAGAAAGGAAGGGAAG畫3'(SEQIDNO:6)通過PCR從pcDNA3.1/myc隱HisA(Invitrogen;V800-2)擴增出myc-HisTag基因，將其插入pBluescriptIISK+(TOYOBO)中的Smal位點，以構建pBlue/myc-His。然后，將用5'-ATCAGATCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'(SEQIDNO:7)和5'-ATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'(SEQIDNO:8)擴增的EGFP基因插入pBlue/myc-His中的EcoRV位點來制備pBlue/myc-His/EGFP。另外，利用5'-AATAGATATCCGCCCCTCTCCCTCCCC-3'(SEQIDNO:9)和5'畫AATAGGATCCGGCACCGGGCTTGCG-3'(SEQIDNO:10)從pQCXIP(Clontech;9136-l)擴增出IRES-噪呤霉素基因序列，然后用EcoRV和BamHI消化，并引入到pBlue/myc-His/EGFP的Pmel-Bglll位點中以構建pBlue/myc-His/IRES-Puro-EGFP。最后，用Pad和EcoRV酶切pBlue/myc-His/IRES-Puro-EGFP，用切得的myc-His/IRES-Puro-EGFP基因片段取代pQCXIP的PacI-EcoRV片段，以構建靶基因表達載體pQCXmfflPG。(2)REG4mH表達載體的構建利用5'-AATATTAATTAAGGAAGATGGCTTCCAGAAGCA-3'(SEQIDNO:ll)和5'-AATAGGATCCTGGTCGGTACTTGCACAGGA-3'(SEQIDNO:12)通過PCR擴增出REG4基因，然后將其插入pQCXmHIPG的Pacl-BamHI位點以構建pQC/REG4mH/IPG。(3)表達細胞系的建立應用PantropicRetroviralExpressionSystem(Clontech;K1063-l)建立4凡原表達細胞系。在膠原包被的100mm平皿上制得融合的GP2-293細胞(Clontech;K1063-1),利用Lipofectamine20004吏所述細胞與pQC/REG4mH/IPG和pVSV-G(Clontech;K1063-l)每種11.2嗎共轉染。48小時后，收集包含病毒顆粒的上清，超速離心(18,Q00rpm，1.5h，4。C)沉淀病毒，沉淀物懸于30juLTNE(50mMTris-HCl[pH7.8],130mMNaCl,1mMEDTA)，從而制備反轉錄病毒載體溶液。用150juL含8)ig/mL溴化己二曱銨(SIGMA;H-9268)的DMEM(SIGMA;D5796)-10%FBS稀釋5pL反轉錄病毒載體溶液，以制備含病毒顆粒的培養(yǎng)基。使293T細胞在96孔板中生長至約40%融合，將其中的培養(yǎng)基用所述制備的含病毒顆粒的培養(yǎng)基取代，從而將pQC/REG4mH/IPG導入細胞?；驅牒?，在含5嗎/mL嘌呤霉素(SIGMA;P-8833)的DMEM(SIGMA;D5796)-10%FBS中培養(yǎng)細胞以建立表達細胞系(REG4mH/293T)。(4)抗原的純化收集約1L所述已建立的表達細胞系的培養(yǎng)上清，對其利用TALON純化試劑盒(Clontech;K1253-l)純化帶His-標簽的蛋白。然后用PBS透析所述純化蛋白，并通過SDS-PAGE和Western印跡法(Westernblotting)確認。用ProteinAssayKitII(BioRad;500-0002JA)測定蛋白質濃度。將所述蛋白質當作純化抗原。多克隆抗體用佐劑(弗氏完全佐劑)乳化抗原溶液制得了用于注射的rhREG4蛋白。在兔中激發(fā)產生針對純化的全長rhREG4蛋白的多克隆抗-REG4抗體(anti-REG4pAb)(Medical&BiologicalLaboratories,Nagoya,Japan)?？寡宓挠H和提純如下進行。將Sepharose4B(Amersham)樹脂用溴化氰(bromocyan)溶液活化，并與rhREG4蛋白偶聯(lián)。將經過濾的抗血清加入上述樹脂后，用磷酸鹽緩沖液(pH8.0)洗滌3次。rhREG4特異性抗體用甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.3)洗脫，Tris-HCl(pH8.0)中和，用PBS透析。單克隆抗體(l)免疫BALB/c小鼠(4周齡，雌性)(JapanSLC)用作待免疫動物，用足墊法進行免疫。將100pL調節(jié)至0.1mg/ml的免疫原與佐劑(完全佐劑(FREUND)MitsubishiKagakulatronRM606-1)混合制得乳劑，分別向4只小鼠的兩個足墊注射50pL乳劑。每三天(間隔兩天)進行第二次和第三次(最終)免疫，第三次免疫三天后進行細胞融合。(2)細胞融合從兩只經免疫小鼠的雙足切下腫大的淋巴結，切開淋巴結，用鑷子等撟出細胞，離心收集從淋巴結獲得的細胞。然后按2:1至10:1的比例混入骨髓瘤細胞(P3U1)?；旌衔镫x心后，將用等體積RPMI(RPMI1640;SIGMACatNoR8758)稀釋過的50%PEG(PEG4000;MERCKCatNo1097270100)加至得到的沉淀中以進行細胞融合。洗滌后，將細胞懸于160mL補加了HAT添加物(x50)(GIBCOCatNo21060-017)的15%FBS-HAT培養(yǎng)基中，鋪入16個96孔板中，每孔200pL。三天后更換培養(yǎng)基，確認集落形成后(l-2周后)，利用免疫沉淀進行第一次篩選。。)免疫沉淀在深孔板的每個孔中準備50(iL用PBS洗滌過的蛋白GSepharose珠子，將350iLiL雜交瘤培養(yǎng)上清傾注到珠子上，4。C旋轉下反應l小時。用PBS洗滌后，向每孔加入350|iL培養(yǎng)上清(非特異性結合物質被蛋白GSepharose珠子所吸附)作為抗原，4°C旋轉下進行抗原-抗體反應1小時。再用PBS洗滌平板。向每孔加入30^L2x樣品緩沖液，煮沸以制備樣品，用Western印跡檢測帶標簽的抗原從而選擇能被免疫沉淀的克隆。(4)單克隆雜交瘤的制備用有限稀釋法克隆所選擇的雜交瘤以獲得單克隆雜交瘤。將雜交瘤鋪板于96孔板中，收集有單集落的孔的培養(yǎng)上清，通過上述的免疫沉淀確認了抗體活性。對活性得到確認的孔中的細胞進行增殖，獲得克隆21-1、24-1和34-l，它們在免疫沉淀中呈強陽性。(5)抗體純化將雜交瘤的培養(yǎng)上清以每秒一滴的速度上樣到蛋白A柱上以吸附抗體，用PBS/0.1%NaN3洗滌(直到用吸收分光光度計測量A280變?yōu)?.05或更低為止)，用0.5M精氨酸-鹽酸緩沖液(pH4.1)洗脫吸附的抗體。在洗脫步驟中，立即向洗脫樣品加入1/5體積的1MTris-HCl緩沖液(pH8.0)來中和。測量每個級分的A280后，將A280為0.1或更高的級分集中起來，在PBS中透析。透析后，根據(jù)下面的乂>式確定濃度濃度^A280x0.7[mg/mL]。免疫組織化學染色胰腺癌的組織微陣列切片(AccuMaxArray)購自Petagene公司(韓國漢城)，其中31個PDAC組織和2個內分泌肺瘤組織平行點樣兩份。將切片去石蠟化，并在pH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中于108。C高壓滅菌15分鐘。在曱醇稀釋的0.33%過氧化氬中溫育30分鐘從而抑制內源性過氧化物酶活性。用胎牛血清溫育封閉后，將切片與抗-REG4多克隆抗體室溫溫育1小時。PBS洗滌后，用過氧化物酶標記的抗小鼠免疫球蛋白(Envisionkit,DakoCytomation，Carpinteria，CA)進行免疫檢測。最后用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(Dako)使反應物顯影，用蘇木精對細胞進行復染。利用針對REG4的多克隆抗體對另一系列PDAC組織進行的免疫組織化學分析顯示在癌細胞細胞質有REG4的強烈信號，而胰腺中的腺泡細胞顯示了弱REG4的染色(圖1B)。另外，用其它31個PDAC組織的系列點樣進行的組織微陣列顯示，31個PDAC中有15個表達高水平的REG4(數(shù)據(jù)未顯示)。64個PDAC中共35個(55%)顯示由抗-REG4抗體陽性染色(數(shù)據(jù)未顯示)。這個結果與先前顯微解剖細胞的RNA研究的結果一致。ELISA試驗系統(tǒng)(l)用于抗體評價的夾心ELISA系統(tǒng)將C8MAXINUNC-ImmunoBreakApartModule(NUNC)用作夾心ELISA的微量培養(yǎng)板。將抗-REG4單克隆抗體(克隆21-1、24-1和M-l)用0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到10嗎/mL后，加入微量培養(yǎng)板(50|uL/孔)，4°C靜置過夜，以通過物理吸附固定每種抗體。用1%BAS/PBS封閉(室溫2小時)后，棄封閉液，剩余物風干制得試驗板。樣品用反應緩沖液(PBS,0.1%Tween20，1%BSA,pH7.3)3希釋5倍后，加入試'驗板(50^L/孔)，室溫反應1小時。用洗滌緩沖液(0.13%Tween20,0.15MNaCl/10mMNaH2P04)洗滌4次后，用酶標抗體稀釋劑(1%BAS，0.135MNaC1/20mMHEPES)將HRP標記的抗-REG4多克隆抗體調節(jié)至1.5嗎/mL，每孔加入50^L。室溫反應1小時后，用洗滌緩沖液洗板4次。每孔加入50iaL酶底物溶液(MossInc.;TMBUltraSensitiveSubstrate)顯色，30分鐘后，每孔加入50)uL0.36NH2S04終止顯色反應。測量吸光度(A450/A620),根據(jù)每個抗體的校正曲線計算血清中的REG4濃度(圖7)。利用上述夾心ELISA系統(tǒng)，測定了來自于9例胰^^癌癥患者和28例Y建康受試者的樣品中REG4的濃度，以評價每個克隆的抗體滴度。與克隆21-1相比，克隆24-1和34-1的檢測靈敏度低(圖7)，并且胰腺癌癥患者樣品中的REG4僅在克隆21-1中能檢測到(圖8)。此外，在利用克隆21-1的夾心ELISA系統(tǒng)測量的樣品中，REG4的濃度顯示出在胰腺癌癥患者中的值比健康受試者中高，證實來自于健康受試者和胰腺癌癥患者的樣品中REG4濃度有顯著性差異(PO.05)(圖8)?？寺?1-1中可變區(qū)的氨基酸序列和每個CDR,以及編碼它們的DNA的核苷酸序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>進一步，發(fā)現(xiàn)重鏈和輕鏈具有信號序列，分別示于SEQIDNO:32和34。編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA的核苷酸序列(其包括信號序列)示于SEQIDNO:31和33。(2)夾心ELISA系統(tǒng)將C8MAXINUNC-ImmunoBreakApartModule(NUNC)用作夾心ELISA系統(tǒng)的孩史量培養(yǎng)板。用0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將抗-REG4單克隆抗體(克隆21-1)稀釋到10昭/mL后，加入微量培養(yǎng)板(100^L/孔)，4°C靜置過夜，以通過物理吸附來致敏抗體。封閉(室溫2小時)后，棄封閉液，使剩余物干燥制得試驗板。將來自患者的血清用已加入0.5嗎/mL生物素化的抗-PEG4多克隆抗體的樣品稀釋劑(PBS,0.1%Tween20,1%BSA，pH7.3)稀釋5倍。反應15分鐘后，將血清加到試驗板(100liL/孔)，反應2小時。洗滌5次后，加入8000倍稀釋的HRP標記的鏈霉抗生物素蛋白(Amersham;RPN4401)(100pL/孔)，反應1小時，然后洗滌5次。每孔加入100pLTMB底物溶液(MOSSInc.;TMBUltraSensitiveSubstrate)顯色。15分鐘后，每孔加入100|iL0.18M硫酸以終止顯色反應，利用吸光度(A450/A620)測定獲得自所述7例患者的術前和術后血清中REG4的濃度。進一步改良了上述夾心ELISA系統(tǒng)，利用下述夾心ELISA系統(tǒng)測定了59例胰腺癌癥患者、35例炎癥性胰腺疾病患者和56例健康受試者血清中REG4的濃度。C8—MAXINUNC-ImmunoBreakApartModule(NUNC)用作微量培養(yǎng)板。用0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將抗-REG4單克隆抗體(克隆21-l)稀釋到10jig/mL后，加入微量培養(yǎng)板(50iliL/孔)，4。C靜置過夜，以通過物理吸附致敏抗體。用P/。BSA/PBS封閉(室溫2小時)后，棄封閉液，使剩余物干燥制得試驗板。將來自患者的血清用已加入0.5|ig/mL生物素化的抗-PEG4多克隆抗體的樣品稀釋劑(PBS,0.1%Tween20,1%BSA,pH7.3)牙希釋5倍。反應15分鐘后，將血清加到試驗板(50(iL/孔)，反應1小時。用洗滌緩沖液(0.13%Tween20,0.15MNaC1/10mMNaH2P04)洗滌4次后，用反應緩沖液(同上述)將REG4特異的多克隆抗體調節(jié)至0.25pg/mL，每孔加50|iL,室溫反應l小時。用洗滌緩沖液洗滌4次后，加入用酶標抗體稀釋劑(1%BSA,0.135MNaC1/20mMHEPES)稀釋150,000倍的HRP標記的鏈霉抗生物素蛋白(Amersham;RPN4401)(50^L/孔)，室溫反應1小時，然后用洗滌緩沖液洗滌4次。每孔加入50TMB底物溶液(MOSSInc.;TMBUltraSensitiveSubstrate),室溫靜置30分鐘顯色。每孔加入500.36N硫酸終止顯色反應，然后測量吸光度(A450/A620),利用校正曲線測定血清中REG4的濃度(圖5)。(3)用ELISA測量的血清REG4水平REG4是一種分泌性蛋白。本發(fā)明人利用其生產的抗體通過免疫沉淀證實了REG4蛋白分泌到胰腺癌癥細胞系的培養(yǎng)基中(數(shù)據(jù)未顯示)。為了測量胰腺癌癥患者血清中REG4水平，本發(fā)明人利用對人REG4顯示最強的親和力的小鼠單克隆抗體(克隆21-1)和對人REG4的兔多克隆抗體建立了夾心ELISA系統(tǒng)。夾心ELISA的性能特征(標準曲線)顯示于圖2。此外，本發(fā)明人利用這些抗體建立了改良夾心ELISA。改良夾心ELISA的性能特征(標準曲線)顯示于圖5。為了確定REG4升高作為診斷標準(diagnostictest)的靈敏度，本發(fā)明人測量了123個健康人的血清REG4，界定了一個9.0ng/ml的截斷值(cutoffva]ue)，即比在所述健康對照中的平均REG4水平高2倍SD的水平(圖3)。隨后本發(fā)明人分析了來自7例患有可手術的胰腺腺癌患者的術前和術后血清(圖4)。所述7例中有4例顯示術前REG4水平超過9.0ng/ml(病例2、3、4和5)，所述4例的REG4水平在其腫瘤被切除4周后下降到REG4水平的正常范圍。這些結果提示血清REG4來源于胰腺癌癥組織，且REG4是胰腺癌癥的潛在血清學標志。其余病例顯示術前和術后REG4都低于9.0ng/ml。此外，本發(fā)明人利用改良夾心ELISA測量了59個胰腺癌癥病例、35個其它胰腺疾病病例和56個正常健康人的血清REG4。胰腺癌癥病例和正常健康人之間(p<0.01)以及胰腺癌癥病例和其它胰腺疾病病例之間(p〈0.05)有顯著性差異。為了確定REG4升高作為診斷標準的靈敏度，本發(fā)明人界定了一個3.78ng/ml的截斷值，即比所述健康對照中的平均REG4水平高3倍SD的水平。結果，判定59個胰腺癌癥病例中的29個(49.2%)、35個其它胰腺疾病病例中的10個(28.6。/。)和56個正常健康對照中的1個(1.8%)為陽性。另一方面，通過用于檢測CA19-9(截斷值25ng/ml)的ELISA系統(tǒng)(CA19-9EIAKit;CanAgDiagnosticsAB)，判定了59個胰腺癌癥病例中的45個(76.3%)、35個其它胰腺疾病病例中的13個(37.1%)和56個正常健康對照中的5個(8.9。/。)為陽性。59個胰腺癌癥病例中的52個(88.1%)、35個其它胰腺疾病病例中的19個(54.3%)和56個正常健康人中的6個(10.7%)中，兩種蛋白中至少一種是陽性的(圖6)。本發(fā)明中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大約一半的PDAC顯示了REG斗蛋白的過表達，通過本發(fā)明人構建的ELISA系統(tǒng)可以檢測到一些PDAC患者中血清REG4。在表2中，本發(fā)明人總結了其檢查的7個病例中REG4、CA19-9和CEA的臨床病理學特征和術前血清水平，所述7個病例中的4例顯示比正常健康對照更高的血清REG4水平(超過9.0ng/ml)。有趣地是，血清REG4在患有早期或非侵襲性胰腺癌癥的患者(病例3和病例4)中處于高水平，在存活時間更長的患者(病例3、4和5)中也處于高水平，表明更有可能血清REG4可檢測在PDAC患者中哪些人預計有早期癌癥或良好的預后。血清CA19-9和CEA未發(fā)現(xiàn)這些早期或非侵襲性病例，血清REG4可能是篩查胰腺癌癥的一種有希望的血清學標志。表2血清學標志物水平和臨床病理學特征<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>')正常范圍<9.0ng/ml2)正常范圍<36U/ml3)正常范圍<5.0ng/ml,每種標志物在正常范圍以上的值加下劃線4)M:月血清REG4作為PDAC腫瘤標志物的靈敏度和特異度應通過分析大量研究來確定。一些以前的研究報道了REG4在結腸直腸癌癥(VioletteS，(2003)IntJCancer.;103(2):185-93)、胃癌癥(OueN,"a/.,(2005)CancerRes.;64(7):2397-405)和炎性腸病(HartupeeJC,"a/.，(2004)BiochimBiophysActa.;1518(3):287-93)中的表達，需要進一步的研究來檢驗是否血清REG4可以將胰腺癌癥與這些疾病區(qū)分開。此外，慢性胰腺炎是本發(fā)明人欲與PDAC的區(qū)別良性疾病之一。考慮到REG家族可能與組織再生有關，本發(fā)明人還需要分析來自于慢性胰腺炎患者的血清。然而，胰腺癌癥，特別是早期PDAC，非常難于檢測，而其它可能與高水平血清REG斗相關的腸或胃的病變用內鏡檢查很容易檢測，即使血清REG4在這些消化道疾病中升高，仍然認為血清REG4測量對篩查胰腺癌有價值。像其它腫瘤標志物一樣，血清REG4可能沒有足夠能力檢測所有PDAC病例或將PDAC區(qū)別于其它疾病，但是將血清REG4與其它腫瘤標志物(例如CA19-9)或診斷性影像學結合，則可能為我們提供有望檢測PDAC的早期或前期病變并更有效地篩查這些疾病的方法。工業(yè)實用性本發(fā)明涉及REG4水平在胰腺癌癥患者的血清中與正常對照相比有所升高這一發(fā)現(xiàn)。因此，REG4蛋白作為診斷標志物(即血清)有實用性。本發(fā)明利用REG4水平作為指標，提供診斷癌癥患者和監(jiān)測癌癥治療進展的方法?，F(xiàn)有技術未能提供用于胰腺癌癥的合適的血清學標志物。本發(fā)明的新型血清學標志物REG4可以提高檢測胰腺癌癥的靈敏度。此外，REG4和CA19-9的結合有助于提高檢測胰腺癌癥的靈敏度。盡管已經詳細地并且參考本發(fā)明的具體實施方案描述了本發(fā)明，但很明顯本領域技術人員可對本發(fā)明進行各種變化和修改而不背離本發(fā)明的精神和范圍。除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語都與本發(fā)明所屬
技術領域：
中的普通技術人員所常規(guī)理解的意思相同。盡管在實施或檢驗本發(fā)明時可使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但適當?shù)姆椒ê筒牧先绫菊f明書下面的描述。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻都全文并入本文作為參考。在存在沖突的情況下，以包括定義的本說明書為準。另外，本文描述的材料、方法和實施例僅是為了說明而非限制本發(fā)明。已經參考具體實施例和優(yōu)選實施方案說明了本發(fā)明。應該理解的是，本發(fā)明并不意欲受到上述說明的限定，而由附加的權利要求及其等同物限定。權利要求1.一種診斷受試者中胰腺癌癥的方法，包括如下步驟(a)提供來自于待診斷的受試者的血液樣品；(b)測定所述血液樣品中的REG4水平；(c)將步驟(b)中測定的REG4水平與正常對照的REG4水平相比較，其中與正常對照相比，所述血液樣品中的高REG4水平表示該受試者患有胰腺癌癥。2.權利要求1的方法，其中所述血液樣品選自下組全血、血清和血漿。3.權利要求1的方法，其中所述REG4水平通過4企測血液樣品中的REG4蛋白來測定。4.權利要求3的方法，其中利用免疫測定檢測所述REG4蛋白。5.權利要求4的方法，其中所述免疫測定是ELISA。6.權利要求4的方法，其中所述免疫測定是夾心法，其利用固定化在載體上的抗-REG4單克隆抗體。7.權利要求6的方法，其中所述單克隆抗體含有VH鏈和VL鏈，每條VH鏈和VL鏈包含被框架氨基酸序列隔開的CDR氨基酸序列，稱作CDR1、CDR2和CDR3,每條VH鏈和VL鏈中各CDR的氨基酸序列選自下組VHCDRl:SEQIDNO:18VHCDR2:SEQIDNO:20VHCDR3:SEQIDNO:22VLCDRl:SEQIDNO:26VLCDR2:SEQIDNO:28和VLCDR3:SEQIDNO:30,或者包含其抗原結合區(qū)的片段。8.權利要求7的方法，其中所述VH包含SEQIDNO:16的氨基酸序列，VL包含SEQIDNO:24的氨基酸序列。9.權利要求1的方法，進一步包括如下步驟(e)測定血液樣品中的CA19-9水平；(f)將步驟(e)中測定的CA19-9水平與正常對照的CAI9-9水平相比較，其中與正常對照相比，血液樣品中的高REG4水平和/或高CA19-9水平表示該受試者患有胰腺癌癥。10.—種用于檢測血液樣品中REG4的免疫測定試劑，該試劑包括抗-reg4抗體。11.權利要求10的試劑，其中所述單克隆抗體固定化在載體上。12.權利要求11的試劑，其中抗-reg4抗體包括含有vh鏈和vl鏈的單克隆抗體，每條vh鏈和vl鏈包含被框架氨基酸序列隔開的cdr氨基酸序列，稱作cdr1、cdr2和cdr3，每條vh鏈和vl鏈中各cdr的氨基酸序列選自下組vhcdr1:segidno:18vhCDR2:seqidno:20vhcdr3:seqidno:22vlcdr1:seqidno:26vlcdr2:seqidno:28和vlcdr3:seqidno:30，或者包含其抗原結合區(qū)的片段。13.權利要求12的試劑，其中所述vh包含seqidno:16的氨基酸序列，vl包含seqidno:24的氨基酸序列。14.一種用于檢測胰腺癌癥的試劑盒，該試劑盒包括(i)用于;f僉測血液樣品中REG4水平的免疫測定試劑；和(ii)reg4的陽性對照樣品。15.權利要求14的試劑盒，其進一步包括(iii)用于檢測血液樣品中CA19-9水平的免疫測定試劑；和(iv)CA19-9的陽性對照樣品。16.權利要求15的試劑盒，其中所述陽性對照樣品對reg4和ca19-9都呈陽性。17.權利要求16的試劑盒，其中所述陽性對照樣品為液體形式。18.—種用于檢測胰腺癌癥的陽性對照血液樣品，該血液樣品包含超過正常水平的reg4和ca19-9。19一種含有vh鏈和vl鏈的抗-reg4單克隆抗體，其中每條vh鏈和VL鏈包含被框架氨基酸序列隔開的CDR氨基酸序列，稱作CDR1、CDR2和CDR3，每條VH鏈和VL鏈中各CDR的氨基酸序列選自下組VHCDR1:SEQIDNO:18VHCDR2:SEQIDNO:20VHCDR3:SEQIDNO:22VLCDR1:SEQIDNO:26VLCDR2:SEQIDNO:28和VLCDR3:SEQIDNO:30,或者包含其抗原結合區(qū)的片段。20.權利要求19的單克隆抗體，其中所述VH包含SEQIDNO:16的氨基酸序列，所述VL包含SEQIDNO:24的氨基酸序列。全文摘要REG4——REG家族的一個新成員，被鑒定為胰腺腺癌的生物標志物。本發(fā)明提供夾心ELISA以檢測患有可切除的胰腺癌癥(即PDAC)患者中血清REG4。本發(fā)明還提供一種利用REG4作為血清學標志診斷胰腺癌的方法。文檔編號C07K16/18GK101438167SQ20078001592公開日2009年5月20日申請日期2007年2月28日優(yōu)先權日2006年3月2日發(fā)明者中川英刀,中村佑輔,中鶴修一申請人:腫瘤療法科學股份有限公司