專利名稱：一種唾液蛋白樣品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬電泳蛋白質(zhì)樣品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種有關(guān)全唾液蛋白質(zhì)的制備 方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，唾液的臨床診斷價(jià)值逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。唾液通過(guò)非侵入方式獲得、對(duì)機(jī) 體無(wú)創(chuàng)傷、可用于大樣本篩查、利于縱向動(dòng)態(tài)觀察。因此，越來(lái)越多的臨床工作者將唾液蛋 白質(zhì)組學(xué)的策略應(yīng)用于生理和病理狀態(tài)下唾液蛋白質(zhì)種類和功能的研究。但由于唾液中含 有大量粘蛋白，會(huì)造成蛋白質(zhì)組學(xué)工作中樣品制備的困難和分離分析的誤差，影響實(shí)驗(yàn)重 復(fù)性。人類的唾液粘蛋白是蛋白質(zhì)和碳水化合物的共價(jià)復(fù)合物，可分為兩類，即高相對(duì) 分子質(zhì)量粘蛋白(MGl)和低相對(duì)分子質(zhì)量粘蛋白(MG2)。MGl分子量大于lOOOkDa，MG2分 子量為200-250kDa。此類糖蛋白具有優(yōu)良的組織覆蓋作用，以潤(rùn)滑、維持口腔粘膜完整性。 但由于唾液粘蛋白性質(zhì)粘稠、含量豐富(約占總蛋白7% -20% )、分子量大，在唾液蛋白質(zhì) 組樣品制備和分離分析中，會(huì)造成實(shí)驗(yàn)誤差，影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。例如粘蛋白粘稠的性質(zhì)會(huì)使 上樣量產(chǎn)生誤差；粘蛋白的大分子量會(huì)阻塞電泳凝膠孔徑影響分離效果；粘蛋白作為一種 高豐度蛋白，會(huì)影響蛋白樣品中其它低豐度蛋白的上樣量。所以在唾液蛋白質(zhì)組蛋白樣品 制備過(guò)程中，必須給予去除。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種唾液蛋白樣品的制 備方法，主要通過(guò)稀乙酸沉淀去除粘蛋白而實(shí)現(xiàn)。所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)收集唾液； 2)將收集的唾液于4°C，800g離心15min，吸取上清液；3)加入體積濃度為0. 05% -5%的 稀乙酸，混勻；4)4°C，14000g離心60min，吸取上清液；5)將上清液放入透析袋中用雙蒸水 透析5h;6)濃縮，得到唾液蛋白樣品。所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟3)中加入的稀乙酸的體 積濃度為0. -0. 5%。所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟3)中加入的稀乙酸的體 積濃度為0. 15%。所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟3)中加入的稀乙酸體積 為步驟2)中吸取的上清液體積的1-4倍。所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟3)中加入的稀乙酸體積 為步驟2)中吸取的上清液體積的2倍。所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟6)所用的濃縮劑為聚乙 二醇 20000。
本發(fā)明采用稀乙酸沉淀法去除粘蛋白后制備唾液蛋白樣品，并與傳統(tǒng)丙酮沉淀法 相比較，具有蛋白回收率高、制備時(shí)間短、安全無(wú)毒、增加低豐度蛋白上樣量、圖譜清晰易于 分析等優(yōu)點(diǎn)，比丙酮沉淀法更有利于提高基于雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)路線唾液蛋白質(zhì)組學(xué)的 穩(wěn)定性、重復(fù)性。


圖1為稀乙酸沉淀法制備的唾液蛋白樣品雙向電泳銀染圖譜；圖2為丙酮沉淀法制備的唾液蛋白樣品雙向電泳銀染圖譜。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例中，所用的藥品和儀 器如下丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、甘氨酸、TRIS、CHAPS、SDS、碘乙酰氨、固相pH干 膠條(IPG strip pH4-7，24cm)等均為 GE healthcare 公司產(chǎn)品；2_D Quant Kit 蛋白定量 試劑盒購(gòu)自Amersham Biosciences公司；透析袋(截留分子量3500)購(gòu)自上海捷瑞生物工 程公司；冰乙酸、聚乙二醇(分子量20000)、丙酮為國(guó)產(chǎn)分析純。UV8500雙束紫外分光光度 儀購(gòu)自HITACHI公司；EttanTM IPGphorTM等電聚焦電泳儀，EttanTM DALTSix垂直板電泳 儀,UMAX ImageScanner凝膠掃描儀,均購(gòu)自 Amersham Biosciences 公司；VariοSkan Flash 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自熱電Thermo公司。實(shí)施例1、唾液樣品收集6例唾液樣品來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室健康女性研究生。年齡24 29歲。唾液收集時(shí)間 為上午9:00-12:00，收集前2h開(kāi)始禁食水。用清水漱口后靜坐于椅子上，前5min內(nèi)的唾 液自然吞下后開(kāi)始收集，口腔唾液積聚至一定量后，將其吐入放置于冰浴中的50ml離心管 內(nèi)，共采集唾液樣品6ml (每組3ml)，采集時(shí)間為5-lOmin。實(shí)施例2、唾液蛋白樣品制備與測(cè)定方法一將實(shí)施例1中收集的樣品離心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，加入兩倍 體積0. 15%的稀乙酸，混勻，再次離心60min(4°C，14000Xg)，吸取上清液，放入透析袋中 用雙蒸水透析5h，然后應(yīng)用聚乙二醇20000濃縮至300 μ 1左右。方法二 將實(shí)施例1中收集的樣品離心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，再次離心 60min(4°C，14000Xg)，吸取上清液，取預(yù)冷至4°C的丙酮，按照4 1的比例(丙酮樣 品)，倒入樣品中，混勻，-20 V保存24h后，取出樣品，離心60min (4°C，14000 X g)，棄上清， 可見(jiàn)離心管底部有白色綿絮狀物質(zhì)，用300 μ 1裂解液(30mmOl/LTris-HCl，8mOl/L尿素， 4% CHAPS, pH8. 5)溶解沉淀。將方法一和方法二制備的樣品蛋白用2-D Quant Kit蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì) 濃度?？傎|(zhì)量=蛋白樣品濃度X總體積?？倳r(shí)間=從第一步離心開(kāi)始到300μ1蛋白樣品 制備完成的時(shí)間。雙向凝膠電泳實(shí)驗(yàn)分別將方法一和方法二制備的樣品和水化液(8mol/L尿素， 2% CHAPS, 13mmol/LDTT,0. 5% IPG buffer, 0. 002%溴酚藍(lán))混合后共 450ul (每塊膠總蛋 白上樣量為300 μ g)，采用膠內(nèi)泡漲的方法上樣。等電聚焦參數(shù)30V，12h ；500V, Ih ； 1000V, Ih ；8000V, 8h。等電聚集后，膠條于平衡液1 (1 % DTT，50mmol/LTris-cl, 6M尿素，30 %甘油，2% SDS，0. 002%溴酚藍(lán))、平衡液2(4%碘乙酰氨，50謹(jǐn)01/1!^8(1，611尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚藍(lán))中各平衡15min后轉(zhuǎn)移到第二向12. 5 % SDS-PAGE膠上，用0. 5 %瓊 脂糖封頂，進(jìn)行第二向電泳，參數(shù)設(shè)定為10W，45min ；40W，6h。直到溴酚藍(lán)染料遷移至膠的 底部邊緣結(jié)束電泳。取出凝膠轉(zhuǎn)移到染色盒里進(jìn)行硝酸銀染色，使用UMAX ImageScarmer凝膠掃描儀 及LabScan軟件進(jìn)行掃描。采用SPSS 16. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Z 士S)表示，均數(shù) 比較用t檢驗(yàn)作兩組組間比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下稀乙酸沉淀法制備得到的蛋白總質(zhì)量顯著高于丙酮沉淀法，而提取蛋白總時(shí)間顯 著低于丙酮沉淀法。相關(guān)的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。表1.兩種蛋白制備方法蛋白質(zhì)總質(zhì)量及總時(shí)間的比較(n = 6,X 士S)
注與丙酮沉淀法比較:*P < 0.05，**P <0.01。由表1中可以看出，稀乙酸沉淀法的蛋白提取率與蛋白提取時(shí)間均顯著優(yōu)于丙酮 沉淀法。兩種方法蛋白回收率的差異可能是由于丙酮作為一種有機(jī)溶劑在沉淀蛋白時(shí)可能 并不完全，部分蛋白質(zhì)可能仍留在上清液中被去除而損失；0. 15%的稀乙酸在沉淀粘蛋白 的同時(shí)，對(duì)溶液中其它蛋白質(zhì)并無(wú)影響。由圖1中也可以看出稀乙酸沉淀法組蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù) 要明顯多于丙酮沉淀法組，特別是在凝膠左下角(酸性端、低分子量區(qū))，而丙酮沉淀法組 凝膠的上區(qū)和中區(qū)分別有兩塊橫向染色陰影，根據(jù)分子量推測(cè)即是MG1和MG2。稀乙酸沉淀 法組由于去除了粘蛋白這一高豐度蛋白，相對(duì)增加了其它低豐度蛋白的上樣量，使這些蛋 白點(diǎn)得以在凝膠顯示，并且圖譜清晰度較高，便于軟件統(tǒng)計(jì)分析。此外，相對(duì)于丙酮特殊的 辛辣氣味、多系統(tǒng)毒性、易燃性，稀乙酸有安全無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)然，稀乙酸沉淀法在保留了大部分蛋白質(zhì)的同時(shí)，也保留了部分雜質(zhì)(包括生 物大分子如核酸等，小分子如鹽離子等)。其中生物小分子類可以通過(guò)雙蒸水透析去除，大 分子化合物仍然混雜在蛋白質(zhì)樣品中。但由于這些生物大分子含量較低，在整個(gè)蛋白質(zhì)組 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)蛋白質(zhì)的分離、分析、鑒定影響不大。所以綜合分析其利弊得失，稀乙酸沉淀 法具有蛋白回收率高、制備時(shí)間短、安全無(wú)毒、增加低豐度蛋白上樣量、圖譜清晰易于分析 等優(yōu)點(diǎn)，比丙酮沉淀法更有利于提高基于雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)路線唾液蛋白質(zhì)組學(xué)的穩(wěn)定 性、重復(fù)性。實(shí)施例3、乙酸體積與濃度對(duì)唾液蛋白樣品制備的影響一、實(shí)驗(yàn)方法如下(1)唾液樣本收集唾液收集時(shí)間為上午9:00-12:00，收集前2h開(kāi)始禁食水。用清水漱口后靜坐于椅 子上，前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開(kāi)始收集，口腔唾液積聚至一定量后，將其吐入放置于 冰浴中的50ml離心管內(nèi)，共采集唾液樣品12ml (每管100 yl，每組6管)。
(2)不同體積稀乙酸沉淀法唾液蛋白樣品制備收集的樣品離心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，分別加入12倍、8倍、4倍、2倍、 1. 5倍、1倍、0. 5倍、0倍體積0. 15%的稀乙酸，混勻，再次離心60min (4°C，14000 X g)，吸取
上清液。(3)不同濃度乙酸沉淀法唾液蛋白樣品制備收集的樣品離心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，分別加入200 yl乙酸溶液，體積 濃度分別為 100%,25%,5%U%>0. 5%,0. 15%,0. 1%,0. 05%,0. 01 %、0%，混勻，再次離 心 60min (4°C，14000 X g)，吸取上清液。(4)樣品蛋白濃度測(cè)定及總質(zhì)量計(jì)算樣品蛋白用Bradford法蛋白定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京凱基生物科技公司)測(cè) 定蛋白質(zhì)濃度?？傎|(zhì)量=蛋白樣品濃度X總體積。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有數(shù) 據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(7 士S)表示，均數(shù)比較用單因素方差分析(One-Way AN0VA)作多組 間比較。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)不同體積稀乙酸沉淀法提取蛋白質(zhì)的總質(zhì)量比較表2.不同體積稀乙酸沉淀法提取蛋白質(zhì)的總質(zhì)量比較(n = 6，文士S) 注與空白對(duì)照組比較:*P<0. 05,**P<0.01 ；與2倍體積組比較:AP<0. 05, AAP < 0. 01。從表2可知，隨著稀乙酸體積的逐漸增大，蛋白質(zhì)總質(zhì)量有逐漸減少的趨勢(shì)。與 空白對(duì)照組相比，體積比1、1.5、2、4、8、12各組蛋白質(zhì)總質(zhì)量均顯著下降(P < 0.05，P < 0. 01)；與體積比2組相比，體積比1、1. 5、4、8、12各組蛋白質(zhì)總質(zhì)量均無(wú)顯著差異。(2)不同濃度乙酸沉淀法提取蛋白質(zhì)的總質(zhì)量比較表3顯示，隨著乙酸濃度的逐漸增大，蛋白質(zhì)總質(zhì)量先有逐漸減少的趨勢(shì)，在 0.5%乙酸組達(dá)到最低點(diǎn)后有逐漸上升的趨勢(shì)。與空白對(duì)照組相比，0. 15%,0.5%,1%> 5%、25%各組蛋白質(zhì)總質(zhì)量均顯著下降(P < 0. 05，P < 0. 01)；與0. 15%組相比，0. 05%, 0. 1%,0. 5%、1%、5%、25%各組蛋白質(zhì)總質(zhì)量均無(wú)顯著差異。表3.不同濃度乙酸沉淀法提取蛋白質(zhì)的總質(zhì)量比較(n = 6，1 士S)
6 注與空白對(duì)照組比較*P < 0. 05,**P < 0.01 ；與0. 15%乙酸組比較AP < 0. 05，aaP < 0. 01。臨床上粘蛋白定性檢查(Rivalta試驗(yàn))原理為粘蛋白是多糖和蛋白質(zhì)形成的復(fù) 合物，其PH為3-5，亦稱酸性糖蛋白，其在大量稀乙酸溶液中呈白色云霧狀沉淀。在本次體 積梯度實(shí)驗(yàn)中，雖然與體積比2組相比，體積比1、1.5、4、8、12各組蛋白質(zhì)總質(zhì)量均無(wú)顯著 差異，但可以觀察到隨著稀乙酸體積的逐漸增大，去除粘蛋白后蛋白質(zhì)溶液總質(zhì)量有逐漸 減少的趨勢(shì)，即稀乙酸體積越大，其去除粘蛋白的效率越高。但在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還需進(jìn)行透析 濃縮，倘若稀乙酸體積過(guò)大，就會(huì)增加實(shí)驗(yàn)成本、延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。所以綜合分析其利弊得失， 我們選取稀乙酸體積比2組作為最優(yōu)體積比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在本次濃度梯度實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì) 照組相比，0. 15 %、0. 5 %、1 %、5 %、25 %各組蛋白質(zhì)總質(zhì)量均顯著下降，而以上各組間蛋白 質(zhì)總質(zhì)量均無(wú)顯著差異。但在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還需進(jìn)行透析以去除鹽離子，倘若稀乙酸濃度過(guò) 大，就會(huì)增加溶液中鹽離子的濃度不利于實(shí)驗(yàn)；同時(shí)也會(huì)降低溶液中的PH可能會(huì)對(duì)溶液中 其它蛋白質(zhì)產(chǎn)生不利影響。所以綜合分析其利弊得失，我們選取稀乙酸體積濃度0. 15%組 作為最優(yōu)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
權(quán)利要求
一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)收集唾液；2)將收集的唾液于4℃，800g離心15min，吸取上清液；3)加入體積濃度為0.05％-5％的稀乙酸，混勻；4)4℃，14000g離心60min，吸取上清液；5)將上清液放入透析袋中用雙蒸水透析5h；6)濃縮，得到唾液蛋白樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟3)中加入的 稀乙酸的體積濃度為0. -0. 5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟3)中加入的 稀乙酸的體積濃度為0. 15%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟3)中加入的 稀乙酸體積為步驟2)中吸取的上清液體積的1-4倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟3)中加入的 稀乙酸體積為步驟2)中吸取的上清液體積的2倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種唾液蛋白樣品的制備方法，其特征在于步驟6)所用的濃 縮劑為聚乙二醇20000。
全文摘要
一種唾液蛋白樣品的制備方法，屬于蛋白質(zhì)樣品制備技術(shù)領(lǐng)域，其特征在于包括以下步驟1)收集唾液；2)將收集的唾液于4℃，800g離心15min，吸取上清液；3)加入體積濃度為0.05％-5％的稀乙酸，混勻；4)4℃，14000g離心60min，吸取上清液；5)將上清液放入透析袋中用雙蒸水透析5h；6)濃縮，得到唾液蛋白樣品。本發(fā)明具有蛋白回收率高、制備時(shí)間短、安全無(wú)毒、增加低豐度蛋白上樣量、圖譜清晰易于分析等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N1/28GK101871857SQ201010201790
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者丁慧登, 盧德趙, 曲建全, 溫成平, 范永升, 謝志軍 申請(qǐng)人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)