專利名稱：一種用于蛋白質(zhì)樣品富集及與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低豐度蛋白質(zhì)樣品富集與檢測方法，具體地說是一種用于 蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法。
背景技術(shù)：
毛細管電泳現(xiàn)在已經(jīng)成為一種常規(guī)的分離方法，在化學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng) 域應(yīng)用廣泛。但是由于毛細管的光程短，所以毛細管電泳的檢測靈敏度較 低。盡管采用激光誘導(dǎo)熒光檢測可以降低毛細管電泳的檢測限，但是蛋白 質(zhì)的熒光標(biāo)記過程繁瑣，而且儀器價格昂貴。因此，發(fā)展用于蛋白質(zhì)樣品 富集與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法，對于提高毛細管電泳的檢測靈敏度是 非常必要的。
目前，已報道了多種毛細管電泳的樣品富集方法。其中場放大進樣
(FASS)[1，2]是基于樣品緩沖液和電泳緩沖溶液電導(dǎo)率的差異而產(chǎn)生的樣 品區(qū)帶壓縮。但是，當(dāng)樣品緩沖液的電導(dǎo)率高于電泳緩沖液時，樣品則無 法通過場放大進樣富集。等速電泳(ITP)是將樣品區(qū)帶夾在前導(dǎo)緩沖液與 尾隨緩沖液之間的一種樣品富集方法[3， 4]。但是，ITP不能同時對陽離子 與陰離子進行富集與分離。此外，還有等電聚焦[5]、基于半通透性中空纖 維膜的電堆積[6]和基于刻蝕毛細管的電堆積[7]等方法。 Burgi， D.S. ， Chien， R. L. Anal. Chem. 1992， 64， 1046-1050. Burgi, D.S. Anal. Chem. 1993， 65， 3726-3729. Krivankova, L. ; Gebauer， P. ; Bocek, P, J. Chromatogr, A1995, 716, 35-48. Foret， F. ; Szoko， E. ; Karger， B. L Electrophoresis, 1993， 14， 417-428. Hjerten， S. ; Liao， J. L. : Zhang, R. J. Chromatogr. A 1994， 676， 409-420. Wu， X. Z. ; Hosaka， A. ; Hobo， T.. Anal. Chem. 1998， 70, 2081-2084. Wei W. ， Edward, S. Y. ， Anal. Chem. 2002， 74, 3899-3905.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于蛋白質(zhì)樣品富集及與毛細管電泳分析 聯(lián)用的方法。利用此方法可以對低濃度蛋白質(zhì)樣品進行富集，并通過毛細 作用的進樣方法實現(xiàn)樣品富集與毛細管電泳分離分析的聯(lián)用。
一種用于蛋白質(zhì)樣品富集及與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法，其特征在 于所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集及與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法，包括蛋白 質(zhì)樣品的富集(圖l， A)、富集后樣品的推出(圖l， B)、分離毛細管在毛 細作用下進樣(圖1， C)和毛細管電泳分析(圖1， D);
聯(lián)用系統(tǒng)包括恒流泵(A0)、膜接口(A1)、聚四氟乙烯管(A2)、硅橡膠 (A3)和分離毛細管(A4);用于蛋白質(zhì)樣品富集的膜接口 (圖l， Al;圖2) 包括連接毛細管(1)、中空纖維膜(2)、盛裝緩沖液的離心管(3)、固定 毛細管的聚四氟乙烯管(4)以及加入與取出緩沖液的開口 (5);
富集樣品時，先將膜接口(A1)的中空纖維膜與連接毛細管(1)中充滿 樣品，再將膜接口(A1)出口端的連接毛細管(1)用硅橡膠堵死，最后使用恒流泵將樣品不斷推入到膜接口 (Al)中；由于蛋白質(zhì)大分子無法透過中空 纖維膜(2)而達到富集效果；富集結(jié)束后，取下硅橡膠(A3),用恒流泵將 富集后的樣品從膜接口(A1)中推出，樣品進入到聚四氟乙烯管中；將毛細 管(1)插入到聚四氟乙烯管(4)，樣品在毛細作用下進入毛細管(1)的 進樣端；進樣結(jié)束后，將毛細管(1)兩端插入到緩沖液中，施加電壓，進
行電泳。
按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用的
方法，其特征在于所述恒流泵(A0)的流量為0. 5-2. 5pL/min。
按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用的 方法，其特征在于所述的膜接口(A1)的中空纖維膜(2)為醋酸纖維素膜， 內(nèi)徑為100 400nm，截留分子量為3000 8000Da，有效長度為2cm-4cm。
按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用的 方法，其特征在于所述的膜接口(A1)的連接毛細管(1)內(nèi)徑與外徑要與 醋酸纖維素膜內(nèi)徑相匹配，以保證毛細管(1)可以穿入膜中。
按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用的 方法，其特征在于所述的聚四氟乙烯管(A2)的內(nèi)徑接近連接毛細管(1) 的外徑，聚四氟乙烯管(A2)與毛細管(1)為密封連接。
按照權(quán)利要求1所述一種用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用 的方法，其特征在于所述硅橡膠(A3)也能是其他的能夠提供較高反壓的 材料，如毛細管聚合物整體柱，或者毛細管硅膠整體柱，或者毛細管填充 柱等等。
按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法，其特征在于所述的分離毛細管的內(nèi)徑為50或者75um。。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
使用具有一定截留分子量的中空纖維膜，利用小分子可以自由通過， 而大分子蛋白質(zhì)被截留的原理來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的富集。在富集時，膜接口的 出口端用硅橡膠堵死，并用恒流泵將樣品不斷推入到膜接口中進行富集。 膜接口制作時，使用環(huán)氧樹脂膠將毛細管與中空纖維膜的連接處密封，可 避免在富集過程中樣品通過毛細管與中空纖維膜的接口處漏出。富集結(jié)束 后，取下硅橡膠用恒流泵將富集后的樣品從膜接口中推入聚四氟乙烯管中。 將分離毛細管插入聚四氟乙烯管中，利用毛細作用將聚四氟乙烯管中的樣 品轉(zhuǎn)移到分離毛細管的進樣端。進樣結(jié)束后，將分離毛細管兩端插入到緩 沖液中，施加電壓，進行電泳分離。
具體方法包括蛋白質(zhì)樣品的富集(圖1， A)，富集后樣品的推出(圖 1， B)，分離毛細管插入進樣(圖1， C)，毛細管電泳分析(圖1， D)。此 聯(lián)用系統(tǒng)包括恒流泵(AO)、膜接口(A1)、聚四氟乙烯管(A2)、硅橡膠(A3) 和分離毛細管(A4)。用于蛋白質(zhì)樣品富集的膜接口 (圖l， Al;圖2)包括 中空纖維膜(2)、連接毛細管(1)、裝有緩沖液的離心管(3)以及固定毛 細管的聚四氟乙烯管(4)。在富集時，先將膜接口的出口端用硅橡膠封住, 再用恒流泵將樣品不斷推入到膜接口中進行富集。在膜接口制作時，使用 環(huán)氧樹脂膠將毛細管與中空纖維膜連接，并在連接處密封，從而避免在富 集過程中樣品在接口處漏出。富集結(jié)束后，取下硅橡膠，用恒流泵將富集 后的樣品從膜接口中推入到聚四氟乙烯管中。將毛細管插入聚四氟乙烯管， 富集后的樣品在毛細作用下進入毛細管的進樣端。進樣結(jié)束后，將分離毛
細管兩端插入到緩沖液中，施加電壓，進行電泳分離。
樣品富集時，可以通過改變樣品進入膜接口的流速與富集時間來改善 樣品的富集效果。在毛細管進樣時，可以通過調(diào)節(jié)毛細管插入聚四氟乙烯 管的深度來控制進入毛細管的樣品量。
本發(fā)明的優(yōu)點
可實現(xiàn)蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析的聯(lián)用，降低毛細管電泳分 析的檢測限；與完全離線的方法相比，減少了操作步驟，降低了樣品的損 失。對低濃度蛋白質(zhì)樣品具有很好的富集效果；膜接口處死體積小(1WL)， 減少了樣品消耗；方法簡便、操作簡單、成本低廉；具有良好的通用性， 實用性強，具有較高的推廣價值。


圖1為本發(fā)明的操作流程圖2為膜接口 (圖l， Al)的放大圖3為三種蛋白質(zhì)的混合液(Cytochrome C, 0. 0333mg/mL; lysozyme， 0.0333mg/mL ; trypsin inhibitor, 0.167 mg/raL)經(jīng)過膜接口富集、進樣 和電泳分離所得的譜考察了在相同富集時間(20min)、不同富集流速(0.5txL/min， luL/min， 2uL/min)下蛋白質(zhì)的富集分離效果；樣品溶解在10mM磷酸鹽 緩沖液(pH3.0)中，緩沖液池中裝滿lOmM磷酸鹽緩沖液(pH3.0)，電泳 緩沖液為20 mM磷酸鹽(pH3. 0);每個峰對應(yīng)的蛋白質(zhì)為1， Cytochrome C; 2，lysozyme; 3， trypsin inhibitor
a:富集前樣品；b,' 0.5uL/min流速下富集所得樣品；c: 1 y L/min流
速下富集所得樣品；d: 2ixL/min流速下富集所得樣品； 圖4為胰島素溶液(0.027mg/mL)經(jīng)過膜接口富集前的譜圖； 圖5為胰島素溶液(0.027mg/mL)經(jīng)過膜接口富集后的譜圖。
具體實施方式
實施例1:
請參閱圖1與圖2，富集樣品時，先將膜接口(A1)的中空纖維膜(2) 與連接毛細管(1)中充滿樣品，再將膜接口出口端的連接毛細管用硅橡膠 (A3)堵死，最后使用恒流泵(AO)將樣品不斷推入到膜接口中進行蛋白 質(zhì)的富集。富集結(jié)束后，取下硅橡膠，用恒流泵將富集后的樣品從膜接口 中推入到聚四氟乙烯管(A2)中。分離毛細管(A4)插入聚四氟乙烯管中，利 用毛細作用樣品轉(zhuǎn)移到分離毛細管(A4)的進樣端。進樣結(jié)束后，將分離毛 細管兩端插入到緩沖液中，施加電壓，進行電泳分離。
樣品為三種蛋白質(zhì)的混合液(Cytochrome C， 0.0333mg/mL; lysozyme， 0.0333mg/mL; trypsin inhibitor, 0.167 mg/mL)。樣品溶解在lOmM磷酸 鹽緩沖液(pH3.0)中，膜接口中裝滿10mM磷酸鹽緩沖液(pH3.0)，電泳 緩沖液為20 mM磷酸鹽(pH3.0)。膜接口的兩端連接毛細管內(nèi)徑均為 100um，外徑均為375um，長度均為10cm。分離毛細管內(nèi)徑為50u m，外 徑375um，總長為34cm，有效長度為24cm。毛細管電泳施加電壓為-16kv。
每次樣品富集結(jié)束時，關(guān)閉恒流泵，穩(wěn)定lmin后取下硅橡膠。用 0.5uL/min的流速將富集在膜接口處的樣品推出進入到聚四氟乙烯管中。 將分離毛細管的進樣端插入到聚四氟乙烯管中進行進樣，插入深度為4mm。
進樣結(jié)束后，進行電泳分析?？疾炝烁患瘯r間(20min)相同，不同富集流 速(0. 5uL/min， 1 u L/min， 2uL/min)下的富集效果，如圖3所示。
由圖3可以看出，在三種富集流速下，富集20min后蛋白質(zhì)樣品均得 到了很好的富集。隨著富集流速的增大(0.5wL/min—2uL/min),富集效 果也有所提高。富集流速2uL/min，富集時間20min時，富集倍數(shù)可以達 到21倍。
實施例2:
樣品為胰島素溶液(0.027mg/mL)。樣品溶解在10mM磷酸鹽緩沖液 (pH3.0)中，膜接口中裝滿lOmM磷酸鹽緩沖液(pH3.0)，電泳緩沖液為 20 mM磷酸鹽(pH3.0)。膜接口的兩端連接毛細管內(nèi)徑均為100ym，外徑 均為375nm,長度均為10cm。分離毛細管內(nèi)徑為50 y m，外徑375um,總 長為34cm，有效長度為24cm。毛細管電泳施加電壓為-16kv。
每次樣品富集結(jié)束時，關(guān)閉恒流泵，穩(wěn)定lmin后取下硅橡膠。用 0.5iiL/min的流速將富集在膜接口處的樣品推出進入到聚四氟乙烯管中。 將分離毛細管的進樣端插入到聚四氟乙烯管中進行進樣，插入深度為4mm。 進樣結(jié)束后，進行電泳分析?？疾炝烁患瘯r間20min，富集流速luL/min 下的富集效果，如圖4、圖5所示。
權(quán)利要求
1.一種用于蛋白質(zhì)樣品富集及與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法，其特征在于所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集及與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法，包括蛋白質(zhì)樣品的富集、富集后樣品的推出、分離毛細管在毛細作用下進樣和毛細管電泳分析；聯(lián)用系統(tǒng)包括恒流泵(A0)、膜接口(A1)、聚四氟乙烯管(A2)、硅橡膠(A3)和分離毛細管(A4)；用于蛋白質(zhì)樣品富集的膜接口(圖1，A1；圖2)包括連接毛細管(1)、中空纖維膜(2)、盛裝緩沖液的離心管(3)、固定毛細管的聚四氟乙烯管(4)以及加入與取出緩沖液的開口(5)；富集樣品時，先將膜接口(A1)的中空纖維膜與連接毛細管(1)中充滿樣品，再將膜接口(A1)出口端的連接毛細管(1)用硅橡膠堵死，最后使用恒流泵將樣品不斷推入到膜接口(A1)中；由于蛋白質(zhì)大分子無法透過中空纖維膜(2)而達到富集效果；富集結(jié)束后，取下硅橡膠(A3)，用恒流泵將富集后的樣品從膜接口(A1)中推出，樣品進入到聚四氟乙烯管中；將毛細管(1)插入到聚四氟乙烯管(4)，樣品在毛細作用下進入毛細管(1)的進樣端；進樣結(jié)束后，將毛細管(1)兩端插入到緩沖液中，施加電壓，進行電泳。
2. 按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián) 用的方法，其特征在于所述恒流泵(AO)的流量為0.5-2.5nL/min。
3. 按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián) 用的方法，其特征在于所述的膜接口(A1)的中空纖維膜(2)為醋酸纖維 素膜，內(nèi)徑為100 400u m，截留分子量為3000 8000Da，有效長度為2cm-4cm。
4. 按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法，其特征在于所述的膜接口(A1)的連接毛細管(1)內(nèi)徑與外徑 要與醋酸纖維素膜內(nèi)徑相匹配，以保證毛細管(1)可以穿入膜中。
5. 按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián) 用的方法，其特征在于所述的聚四氟乙烯管(A2)的內(nèi)徑接近連接毛細管(1)的外徑，聚四氟乙烯管(A2)與毛細管(1)為密封連接。
6. 按照權(quán)利要求1所述一種用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析 聯(lián)用的方法，其特征在于所述硅橡膠(A3)也能是其他的能夠提供較高反 壓的材料，如毛細管聚合物整體柱，或者毛細管硅膠整體柱，或者毛細管填 充柱等等。
7. 按照權(quán)利要求1所述的用于蛋白質(zhì)樣品富集與毛細管電泳分析聯(lián)用 的方法，其特征在于所述的分離毛細管的內(nèi)徑為50或者75μm。
全文摘要
一種用于蛋白質(zhì)樣品富集及與毛細管電泳分析聯(lián)用的方法，包括蛋白質(zhì)樣品的富集、富集后樣品的推出、分離毛細管在毛細作用下進樣和毛細管電泳分析；聯(lián)用系統(tǒng)包括恒流泵、膜接口、聚四氟乙烯管、硅橡膠和分離毛細管；富集樣品時，使用恒流泵將樣品不斷推入到膜接口中；富集結(jié)束后，樣品進入到聚四氟乙烯管中；將毛細管插入到聚四氟乙烯管，樣品在毛細作用下進入毛細管的進樣端；進樣結(jié)束后，將毛細管兩端插入到緩沖液中，施加電壓，進行電泳。其優(yōu)點為與完全離線的方法相比，減少了操作步驟，降低了樣品的損失；對低濃度蛋白質(zhì)樣品具有很好的富集效果；膜接口處死體積小，減少了樣品消耗；方法簡便，操作簡單，成本低廉。
文檔編號G01N27/447GK101344503SQ20071001204
公開日2009年1月14日 申請日期2007年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月11日
發(fā)明者喬曉強, 孫良亮, 張麗華, 張玉奎, 張維冰, 振 梁, 玉 梁, 王婷婷 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所