專利名稱：一種生物樣品微型富集芯片及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物樣品微型富集芯片及其制作方法，這種微型生物樣品富集芯片利用抗原抗體反應(yīng)或受體和配體反應(yīng)對(duì)生物樣本中的特定成分進(jìn)行富集。
背景技術(shù)：
微型生物樣品富集和分離芯片是樣品預(yù)處理芯片的一種。其目的是在進(jìn)行檢測前對(duì)生物樣本中某一種含量較少的特定成分進(jìn)行富集，并除去生物樣品中其它干擾成分，從而提高待檢物質(zhì)的檢測靈敏度。
微全分析系統(tǒng)(micro total analytical system，μTAS)又稱芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)是在上世紀(jì)90年代由Manz et al.提出的概念，是將微機(jī)電技術(shù)(micro-electromechanical systems，MEMS)和分析化學(xué)檢測相結(jié)合，把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分析的技術(shù)。這個(gè)概念一經(jīng)提出就受到關(guān)注，經(jīng)過十多年的發(fā)展，在微芯片上對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)化合物及無機(jī)離子的分離、分析及檢測系統(tǒng)方面發(fā)展很快，已經(jīng)有集成的商品化微全分析系統(tǒng)出現(xiàn)。如安捷倫公司2100微分析系統(tǒng)和島津公司推出的MCE-2010型微芯片電泳系統(tǒng)。但生物樣品的富集和分離微系統(tǒng)發(fā)展相對(duì)滯后，一方面是因?yàn)樯飿颖镜亩鄻有?如血液、尿液、糞便，污染水等)，性質(zhì)各不相同(氣體、液體、流體等)。其次，生物樣本還有多種復(fù)雜成分，在檢測和分離時(shí)相互干擾。
在芯片上實(shí)現(xiàn)生物樣本中特定成分的微量富集，往往利用待檢生物樣本自身的物理、化學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)。依據(jù)分子大小不同、介電性質(zhì)、超聲場受力、固相萃取和電磁學(xué)性質(zhì)實(shí)現(xiàn)特定成分的分離。
較好的微型生物樣品富集和分離芯片具有以下幾個(gè)方面的特點(diǎn)1)有較高的富集比例；2)非特異性的殘留成分較少；3)富集速度較快；4)富集的過程不影響富集成分的性質(zhì)。目前尚鮮有這方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物樣品微型富集芯片機(jī)器制作方法。它是基于微加工技術(shù)和表面修飾技術(shù)，在微芯片上實(shí)現(xiàn)生物樣本中特定成分的富集。
本發(fā)明解決的關(guān)鍵問題是如何將微加工技術(shù)和表面修飾技術(shù)相結(jié)合，將特異性抗體或受體固定在微加工的微柱陣列上，實(shí)現(xiàn)生物樣本中特定成分的富集和分離，從而提高檢測的靈敏度，并可減少試劑的用量，同時(shí)又可不必依賴大型的離心設(shè)備和過濾設(shè)備，操作簡單。根據(jù)在微柱陣列表面固定成分的不同，可以靈活調(diào)整生物樣本中不同成分的富集。該微型生物樣品富集芯片選用硅和Pyrex玻璃作為加工得主要基底材料，材料來源豐富，價(jià)格低廉，微加工工藝成熟，可以批量生產(chǎn)。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是首先應(yīng)用MEMS工藝在硅片表面加工出微柱陣列，嚴(yán)格清洗除去微柱表面的保護(hù)層，并進(jìn)行氧化形成二氧化硅層，然后與預(yù)先打好樣品進(jìn)出孔的Pyrex玻璃片實(shí)現(xiàn)陽極鍵合。然后用3-氨丙基-3-乙氧基硅烷對(duì)微柱表面進(jìn)行硅烷化，衍生活性氨基基團(tuán)，使用剛性很強(qiáng)的雙分子交聯(lián)劑對(duì)苯二甲醛和微柱表面的氨基基團(tuán)發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，另一個(gè)活性的醛基可以和蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的化學(xué)鍵，將抗體或配體固定在微柱的表面。當(dāng)含特定成分的生物樣品流經(jīng)微柱陣列時(shí)，發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)或受體-配體反應(yīng)，使其固定在微柱表面，用少量洗脫液進(jìn)行洗脫，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定生物樣本中成分的富集。
本發(fā)明提供的一種生物樣品微型富集芯片的制作方法是基于微加工技術(shù)和表面修飾技術(shù)相結(jié)合，將特異性抗體或受體固定在硅柱表面，并和流經(jīng)液體中相應(yīng)的抗原或配體發(fā)生特異性反應(yīng)，使其固定在微柱表面，用洗脫液洗脫，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本中成分的富集。
所述的生物樣品微型富集芯片的制作方法具體步驟是(A)用MEMS加工工藝在硅片表面刻蝕出微柱陣列；(1)根據(jù)設(shè)計(jì)的圖形制掩模版；(2)清洗有氧化層的硅片并烘干；(3)涂1813#光刻膠，光刻和顯影；涂光刻膠時(shí)的轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為30秒；(4)用深反應(yīng)離子刻蝕，刻蝕后劃片；刻蝕深度為50μm；(5)去除表面光刻膠和二氧化硅，用洗液清洗；(6)在芯片表面生長100納米的二氧化硅層；且加工后劃片；(B)芯片鍵合(1)清洗已打好加樣孔和出樣孔的Pyrex玻璃片；(2)在鍵合機(jī)上將步驟(A)加工好的基片和上述Pyrex玻璃片進(jìn)行陽極鍵合；(C)芯片的表面引入活性官能基團(tuán)(1)將步驟(B)鍵合后的微型生物樣品富集芯片內(nèi)充入濃度為98％的H2SO4和30％的H2O2按體積比為7∶3的比例配制的洗液進(jìn)行表面處理，時(shí)間為30-45分鐘；(2)漂洗，吹干并充入濃度為10-15mmol/L 3-氨丙基-3乙氧基硅烷的無水乙醇溶液，組裝時(shí)間為30-45分鐘。
(3)漂洗，吹干并烘烤(4)烘烤后的芯片再放在濃度為10-15mmol/L對(duì)苯二甲醛丙酮溶液中組裝，組裝時(shí)間為45-60分鐘，取出、漂洗、吹干；
(D)抗體或受體的固定和富集(1)將濃度為0.5-2mg/ml的單克隆抗體充入芯片池固定，固定2-5小時(shí)后將多余的液體吸出，然后用含體積比為0.2-1％的吐溫-20PBS緩沖液洗滌；(2)將含富集對(duì)象的生物樣本加入加樣池或微注射泵內(nèi)，設(shè)定流速，使生物樣本緩慢流過微柱陣列，固定在微柱上的抗體或受體捕獲富集對(duì)象，最后在樣品池內(nèi)加入洗脫液，將捕獲的對(duì)象進(jìn)行洗脫，達(dá)到富集的目的。
用丙酮去除上述步驟(A)中所述的表面光刻膠；用重量比HF∶NH4F∶H2O＝3∶6∶9腐蝕液去除步驟(A)中所述的二氧化硅。
上述步驟(B)中所述的陽極鍵合溫度為400℃，電壓為1kv。
上述步驟(C)中所述的烘烤溫度為100-110℃，時(shí)間為45分鐘。
按上述工藝過程制作的生物樣品微型富集芯片，其特征在于硅片表面刻蝕出的微柱陣列，微柱表面引入活性官能基團(tuán)，抗體或受體固定在微柱表面；微柱為微米級(jí)且呈圓形。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是1.本發(fā)明采用的加工基底材料為硅片和玻璃，其來源豐富，價(jià)格較低，加工工藝成熟，能夠批量生產(chǎn)。
2.本發(fā)明的微型生物樣品富集芯片體積小，便于攜帶，不依賴離心機(jī)等大型設(shè)備，操作較為簡單。
3.可以依據(jù)在微柱上固定的抗體或受體的不同，靈活調(diào)整生物樣品中所需富集的對(duì)象。
4.本發(fā)明采用的微加工工藝技術(shù)，制作完成的用于吸附樣品的微柱僅為微米級(jí)別，呈圓柱形，富集表面積更大，具備更好的富集效果。
5.本富集芯片的主要工作單元為經(jīng)過化學(xué)基團(tuán)和抗體修飾的硅微柱陣列，耐常規(guī)的生物化學(xué)反應(yīng)和清洗，因而可以重復(fù)使用。
6.由于在富集過程中采用的是特異的抗體-抗原反應(yīng)或受體和配體反應(yīng)，因此特異性高，且在富集過程中不破壞被富集成分的結(jié)構(gòu)。


圖1用MEMS加工工藝在硅片表面刻蝕微柱陣列圖2制作工藝流程a.硅片清洗，烘干；b.硅片上涂光刻膠；c.光刻和顯影；d.清洗；e.深反應(yīng)離子刻蝕；f.去除保護(hù)的光刻膠和二氧化硅層；g.表面氧化生成納米二氧化硅層。
圖3加工好的芯片和打好孔的Pyrex玻璃鍵合圖4在微柱表面修飾活潑的醛基圖5抗體或配體在微柱表面的固定圖中1.二氧化硅層；2.硅；3.光刻膠；4.氧化層；5.微柱；6.玻璃片；7.醛基；8.抗體。
具體實(shí)施例下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1.用MEMS加工工藝在硅片表面刻蝕出微柱陣列(圖1)首先應(yīng)根據(jù)設(shè)計(jì)的圖形定制掩膜版，制作工藝流程如圖2所示。表面有氧化層的硅片清洗和烘干(圖2a)，在涂膠機(jī)上涂1813#光刻膠(轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間30秒)(圖2b)，然后光刻和顯影(圖2c)。用質(zhì)量比為HF∶NH4F∶H2O＝3∶6∶9的腐蝕液二氧化硅層，用丙酮去除光刻膠(圖2d)接著進(jìn)行深反應(yīng)離子刻蝕(圖2e)，刻蝕深度為50μm。去除保護(hù)的光刻膠和二氧化硅層(圖2f)。最后在芯片表面熱氧化100納米二氧化硅層(圖2g)。芯片加工后劃片。
2.分別用98％硫酸、1#洗液(體積比氨水∶30％H2O2∶H2O＝1∶2∶5)和2#洗液(體積比HCl∶30％H2O2∶H2O＝1∶2∶8)各清洗10分鐘。同時(shí)用該清洗程序清洗打好加樣孔和出樣孔的Pyrex玻璃片。
3.芯片的鍵合(圖3)在鍵合機(jī)上對(duì)加工好的基片和玻璃片進(jìn)行陽極鍵合，鍵合溫度為400℃，電壓為1KV，制作完成微型富集芯片用于下一步的微柱表面修飾處理。
4.芯片的表面修飾(圖4)將微型生物樣品富集芯片進(jìn)行表面處理、漂洗和吹干后，充入濃度為10-15mmol/L的3-氨丙基-3-乙氧基硅烷的無水乙醇溶液，組裝30分鐘，結(jié)束后用無水乙醇漂洗兩遍，并用氮?dú)獯蹈?，放置?10℃烘烤45分鐘。將烘烤好的芯片充入濃度為10-15mmol/L的對(duì)苯二甲醛的丙酮溶液，組裝30分鐘，然后取出，去離子水漂洗兩次，并用氮?dú)獯蹈伞?br> 5.抗體的固定(圖5)將濃度為1mg/ml的單克隆抗體(PBS緩沖液)充入芯片池，固定24小時(shí)，將多余液體吸出，然后用體積比為0.5％吐溫-20PBS緩沖液洗滌兩次，PBS緩沖液洗滌兩次，每次5分鐘。
6.富集過程將含有富集對(duì)象的生物樣品加入加樣池或微注射泵內(nèi)，設(shè)定流速，讓生物樣品緩慢流過微柱陣列，固定在微柱上的抗體或受體捕獲富集對(duì)象。然后在樣品池加入少量洗脫液，將捕獲的對(duì)象進(jìn)行洗脫，達(dá)到富集目的，并進(jìn)行下一步檢測。
權(quán)利要求
1.一種生物樣品微型富集芯片的制作方法，其特征在于制作方法基于微加工技術(shù)和表面修飾技術(shù)相結(jié)合，將特異性抗體或受體固定在硅柱表面，并和流經(jīng)液體中相應(yīng)的抗原或配體發(fā)生特異性反應(yīng)，使其固定在微柱表面，用洗脫液洗脫，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本中成分的富集。
2.按權(quán)利要求1所述的生物樣品微型富集芯片的制作方法，其特征在于具體步驟是(B)用MEMS加工工藝在硅片表面刻蝕出微柱陣列；(1)根據(jù)設(shè)計(jì)的圖形制掩模版；(2)清洗有氧化層的硅片并烘干；(3)涂1813#光刻膠，光刻和顯影；(4)用深反應(yīng)離子刻蝕，刻蝕后劃片；(5)去除表面光刻膠和二氧化硅，用洗液清洗；(6)在芯片表面生長100納米的二氧化硅層；且加工后劃片；(B)芯片鍵合(1)清洗已打好加樣孔和出樣孔的Pyrex玻璃片；(2)在鍵合機(jī)上將步驟(A)加工好的基片和上述Pyrex玻璃片進(jìn)行陽極鍵合；(C)芯片的表面引入活性官能基團(tuán)(1)將步驟(B)鍵合后的微型生物樣品富集芯片內(nèi)充入濃度為98％的H2SO4和30％的H2O2按體積比為7∶3的比例配制的洗液進(jìn)行表面處理，時(shí)間為30-45分鐘；(2)漂洗，吹干并充入濃度為10-15mmol/L 3-氨丙基-3乙氧基硅烷的無水乙醇溶液，組裝時(shí)間為30-45分鐘。(3)漂洗，吹干并烘烤(4)烘烤后的芯片再放在濃度為10-15mmol/L對(duì)苯二甲醛丙酮溶液中組裝，組裝時(shí)間為45-60分鐘，取出、漂洗、吹干；(D)抗體或受體的固定和富集(1)將濃度為0.5-2mg/ml的單克隆抗體充入芯片池固定，固定2-5小時(shí)后將多余的液體吸出，然后用含體積比為0.2-1％的吐溫-20 PBS緩沖液洗滌；(2)將含富集對(duì)象的生物樣本加入加樣池或微注射泵內(nèi)，設(shè)定流速，使生物樣本緩慢流過微柱陣列，固定在微柱上的抗體或受體捕獲富集對(duì)象，最后在樣品池內(nèi)加入洗脫液，將捕獲的對(duì)象進(jìn)行洗脫，達(dá)到富集的目的。
3.按權(quán)利要求2所述的生物樣品微型富集芯片的制作方法，其特征在于步驟(A)中(3)涂光刻膠時(shí)的轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為30秒。
4.按權(quán)利要求2所述的生物樣品微型富集芯片的制作方法，其特征在于步驟(A)中(4)刻蝕深度為50μm。
5.按權(quán)利要求2所述的生物樣品微型富集芯片的制作方法，其特征在于用丙酮去除步驟(A)中(5)所述的表面光刻膠；用重量比HF∶NH4F∶H2O＝3∶6∶9腐蝕液去除步驟(A)中所述的二氧化硅。
6.按權(quán)利要求2所述的生物樣品微型富集芯片的制作方法，其特征在于步驟(B)中所述的陽極鍵合溫度為400℃，電壓為1kv。
7.按權(quán)利要求2所述的生物樣品微型富集芯片的制作方法，其特征在于步驟(C)中所述的烘烤溫度為100-110℃，時(shí)間為45分鐘。
8.按權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)權(quán)利要求制作的生物樣品微型富集芯片，其特征在于硅片表面刻蝕出的微柱陣列，微柱表面引入活性官能基團(tuán)，抗體或受體固定在微柱表面。
9.按權(quán)利要求8所述的生物樣品微型富集芯片，其特征在于微柱為微米級(jí)，且呈圓形。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微型生物樣品富集芯片及其制作方法，特征在于用MEMS加工工藝在硅片表面刻蝕微米級(jí)別的微柱，然后在微柱表面引入活性官能基團(tuán)，最后抗體或受體的化學(xué)基團(tuán)與衍生的活性化學(xué)基團(tuán)發(fā)生共價(jià)化學(xué)反應(yīng)，抗體或受體就被固定在微柱的表面，當(dāng)溶液中有相應(yīng)的抗原或配體通過時(shí)，就會(huì)和相應(yīng)的抗體或受體發(fā)生特異性結(jié)合，從而被捕獲。在一定的條件下加入少量的洗脫試劑，就能達(dá)到富集和分離相應(yīng)生物樣品的目的。芯片的制作包括MEMS工藝制作微柱，芯片的陽極鍵合，微柱表面引入活性官能基團(tuán)和抗體或配體的固定四個(gè)主要步驟。優(yōu)點(diǎn)在于能夠在微型芯片上實(shí)現(xiàn)對(duì)微量樣品中特定成分的富集，提高了檢測的靈敏度，減少了試劑的用量。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1696639SQ20051002521
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
發(fā)明者楊夢(mèng)蘇, 劉康棟, 金慶輝, 鄒志清, 趙建龍 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所