一種二氧化碳測定試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種二氧化碳測定試劑盒，主要成分包括：緩沖液：50-200mM；穩(wěn)定劑：10％-50％；表面活性劑：0.1-5％；防腐劑：0.1-5g／L；反應(yīng)加速劑：1-20mM；3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)：2-10mM；磷酸烯醇式丙酮酸：5-50g／L；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶：50-500U／L；蘋果酸脫氫酶：1-3KU／L；3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)：(1)葡萄糖類底物：2-20g／L，(2)相應(yīng)葡萄糖脫氫酶：100-2000U／L，(3)3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸：1-5mM；本發(fā)明使用方便，操作簡單；參與偶聯(lián)反應(yīng)的成分都是外加的，不會引入內(nèi)外源物質(zhì)的污染；再生循環(huán)系統(tǒng)速率要小于主反應(yīng)的速率，不干擾主反應(yīng)；穩(wěn)定性好，可以長時間使用。
【專利說明】一種二氧化碳測定試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體的說是涉及一種醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域常用的二氧化碳測定試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]血液內(nèi)二氧化碳(CO2)的含量對人體內(nèi)酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著重要的作用，血液pH的恒定是維持生命活動必不可少的條件。在代謝性酸中毒和呼吸性堿中毒時，人血清(漿)中二氧化碳濃度減少；而在代謝性堿中毒和呼吸性酸中毒時，人血清(漿)中二氧化碳濃度增加。所以血清(漿)中二氧化碳的測定項目在臨床診療觀察中有著重要的作用。
[0003]總二氧化碳和碳酸氫根的測定方法可分為直接測定和間接推算兩類。直接測定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微量擴散法、流動注射氣體擴散法等。間接推算是運用血氣分析儀測得的PH和PCO2，根據(jù)H-H方程的變換形式:
[0004]HCO3 (m mo I / L) =0.03 XPCO2 (mm Hg) X antilog (PH-p ka)或
[0005]HCCV (m mo I / L) =0.225 X PCO2 (k Pa) X anti log (PH-p Ka)
[0006]計算獲得。
[0007]式中:PH為37°C時測得值，p ka在37°C為6.1。
[0008]目前，以間接推算法應(yīng)用較為普遍，由血液分析儀的微處理計算機并與血氣分析結(jié)果一起報告，準確性基本可以符合臨床要求。
[0009]直接測定法以滴定法應(yīng)用最為廣泛，但由于受外界因素影響較大，測定誤差較大。
[0010]酶法測定適合自動化分析儀，結(jié)果可靠，但試劑在存放過程中容易受到空氣中的CO2的影響，穩(wěn)定性較差。
[0011]檢索中國專利發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?00810124241.1、申請日為2008.06.30的發(fā)明專利申請公開了一種酶法檢測二氧化碳濃度的試劑盒，該發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、過氧化氫、乙酰輔酶A、高鐵細胞色素bl、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶及穩(wěn)定劑。通過將樣品與試劑按一定的比例混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測340波長處吸光度下降的速度，從而測算出CO2的濃度大小。
[0012]同時，申請?zhí)枮?00810124240.7、申請日為2008.06.30的發(fā)明專利也申請公開了
一種酶法檢測二氧化碳濃度的試劑盒，該發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、乙酰磷酸、過氧化氫、甘油醛-3-磷酸、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑。通過將樣品與試劑按一定的比例混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測340波長處吸光度下降的速度，從而測算出CO2的濃度大小。
[0013]近年來酶法測定二氧化碳的技術(shù)進展迅速，適用于自動生化分析儀，檢測速度快、準確度高，但試劑盒在開口存放時因為容易與空氣中的CO2發(fā)生反應(yīng)，造成底物濃度下降、試劑開口穩(wěn)定性差的現(xiàn)象，目前國內(nèi)關(guān)于解決二氧化碳測定試劑開口穩(wěn)定性差的研究也十分缺乏。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點與不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種二氧化碳測定試劑盒，該試劑盒利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù),計算3-乙酰卩比唳腺嘌呤二核苷酸(還原型)，(APADH)在405nm處吸光度下降程度，測算出血液中二氧化碳的濃度大小。同時在反應(yīng)體系中偶聯(lián)了一個3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)，保證了試劑在開口存放中的穩(wěn)定性和測值準確性。
[0015]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是，提供一種二氧化碳測定試劑盒，主要成分包括:緩沖液:50-200mM ;穩(wěn)定劑:10% -50% ;表面活性劑:0.1% -5% ;防腐劑:0.l-5g / L ;反應(yīng)加速劑:l-20mM ；3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型):2_10mM ；磷酸烯醇式丙酮酸:5-50g / L ;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:50-500U / L ;蘋果酸脫氫酶:1-3KU / L ；3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng):(I)葡萄糖類底物:2_20g / L，(2)相應(yīng)葡萄糖脫氫酶:100-2000U / L，(3) 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸:l_5mM0
[0016]上述的一種二氧化碳測定試劑盒，緩沖液為pH值在8.0-8.5的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、CAPSO緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、甘氨酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
[0017]上述的一種二氧化碳測定試劑盒，穩(wěn)定劑為甘油、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白、硫酸銨、乙二醇、丙二醇中的一種或幾種。
[0018]上述的一種二氧化碳測定試劑盒，表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、Triton X系列中的一種或幾種。
[0019]上述的一種二氧化碳測定試劑盒，防腐劑為疊氮鈉或PC-300。
[0020]上述的一種二氧化碳測定試劑盒，反應(yīng)加速劑為硫酸鎂、硫酸鈉、硫酸鉀中的一種或幾種。
[0021]上述的一種二氧化碳測定試劑盒，3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)為如下組合中的一種:
[0022](I)葡萄糖-葡萄糖脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)、甘油-甘油脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)系統(tǒng)、丙酮酸-乳酸脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)系統(tǒng)；
[0023](2)葡萄糖-葡萄糖脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)、甘油-甘油脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系統(tǒng)、丙酮酸-乳酸脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系統(tǒng)。
[0024]上述的一種二氧化碳測定試劑盒，它為單試劑，具體如下:
[0025]單試劑:包括緩沖液、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)。[0026]上述的一種二氧化碳測定試劑盒，它為雙試劑或三試劑，具體如下:
[0027]雙試劑:
[0028]試劑1:緩沖液、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)。
[0029]試劑2:緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶。
[0030]表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑在試劑I或試劑2的位置不限。
[0031]三試劑:
[0032]試劑1:緩沖液、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)。
[0033]試劑2:緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
[0034]試劑3:緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。
[0035]表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑在試劑1、試劑2或試劑3中的位置不限。
[0036]試劑盒配制完成后需要4°C放置過夜后使用。
[0037]本發(fā)明 的二氧化碳測定試劑盒測定原理如下:
[0038]二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根；
[0039]草酰乙酸+3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)蘋果酸脫氫酶蘋果酸+3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)；
[0040]葡萄糖類底物+3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)相應(yīng)葡萄糖脫氧酶相應(yīng)醒+3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)；
[0041]本發(fā)明的二氧化碳測定試劑盒應(yīng)用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase ；EC4.1.1.31)酶(偶)聯(lián)蘋果酸脫氫酶(Malatedehydrogenase ；EC1.1.1.37)酶促反應(yīng)速率比色法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解二氧化碳反應(yīng)產(chǎn)生草酰乙酸，再通過(偶)聯(lián)合蘋果酸脫氫酶的作用，將還原型的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(在405nm處有吸收峰)氧化成氧化型(在405nm處無吸收峰)。最終以測定3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)在405nm處吸光度下降程度測算出血液中二氧化碳的濃度大小。同時葡萄糖類底物與相應(yīng)葡萄糖脫氫酶、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸共同組成了 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)，通過酶促反應(yīng)使3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)得到循環(huán)再生，保證了試劑盒不會因為吸收外界的二氧化碳而降低了反應(yīng)底物濃度導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。
[0042]本發(fā)明的二氧化碳測定試劑盒的有益效果主要表現(xiàn)在:
[0043](I)本發(fā)明所配制的試劑可以為單試劑，使用方便，操作簡單。
[0044](2)本發(fā)明參與偶聯(lián)反應(yīng)的成分都是外加的，不會引入內(nèi)外源物質(zhì)的污染。
[0045](3)本發(fā)明的再生循環(huán)系統(tǒng)速率要小于主反應(yīng)的速率，不干擾主反應(yīng)。
[0046](4)本發(fā)明所配制的單試劑試劑盒，穩(wěn)定性好，可以長時間使用，試驗證實37°C閉口放置2周、4°C開口放置30天、4°C閉口放置I年后試劑空白吸光度A≤0.800A。
【具體實施方式】[0047]下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明做進一步的說明。
[0048]實施例1
[0049]本實施例的二氧化碳測定試劑盒為單試劑，包括:
[0050]三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液:50mM，
[0051]甘油:10%，
[0052]Triton Χ-100:0.1%,
[0053]疊氮鈉:0.1g / L，
[0054]硫酸鎂:ImM,
[0055]3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型):2mM，
[0056]磷酸烯醇式丙酮酸:5g / L，
[0057]磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:50U / L，
[0058]蘋果酸脫氫酶:IKU / L，
[0059]3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng):
[0060](I)葡萄糖:2g / L，
[0061](2)葡萄糖脫氫酶:100U / L，
[0062](3) 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型):lmM。
[0063]試劑全部溶解配好后4°C放置過夜，分裝入瓶。
[0064]將被測二氧化碳樣品和試劑混合，使之與試劑的體積比例為1:100，混合均勻，37°C反應(yīng)時間I分鐘，在波長405nm處檢測2分鐘內(nèi)吸光度的下降速率，從而測算出二氧化碳濃度的大小。
[0065]取德國羅氏診斷有限公司生產(chǎn)的二氧化碳檢測試劑盒(比色法)(貨號:03289885190 ;批次:670816-01)作為對照樣本，具體試驗數(shù)據(jù)如表I所述示:
[0066]表I對照樣本與實施例1性能指標對照表
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種二氧化碳測定試劑盒，其特征在于，主要成分包括: 緩沖液:50-200mM: 穩(wěn)定劑:10% -50% ； 表面活性劑:0.1% -5% ;
防腐劑:0.l-5g / L ； 反應(yīng)加速劑:l-20mM; 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型):2-10mM ； 磷酸烯醇式丙酮酸:5-50g / L ； 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:50-500U / L ； 蘋果酸脫氫酶:1-3KU / L； 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng): (1)葡萄糖類底物:2_20g/ L， (2)相應(yīng)葡萄糖脫氫酶:100-2000U/ L， (3)3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸:1-5禮。`
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二氧化碳測定試劑盒，其特征在于:所述的緩沖液為PH值在8.0-8.5的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、CAPSO緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、甘氨酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高穩(wěn)定性二氧化碳測定試劑盒，其特征在于:所述的穩(wěn)定劑為甘油、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白、硫酸銨、乙二醇、丙二醇中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二氧化碳測定試劑盒，其特征在于:所述的表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、Triton X系列中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二氧化碳測定試劑盒，其特征在于:所述的防腐劑為疊氮鈉或PC-300。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二氧化碳測定試劑盒，其特征在于:所述的反應(yīng)加速劑為硫Ife續(xù)、硫Ife納、硫Ife鐘中的一種或幾種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二氧化碳測定試劑盒，其特征在于:所述的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)為如下組合中的一種: (1)葡萄糖-葡萄糖脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)、甘油-甘油脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)系統(tǒng)、丙酮酸-乳酸脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)系統(tǒng)； (2)葡萄糖-葡萄糖脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸-葡萄糖6磷酸脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)、甘油-甘油脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系統(tǒng)、丙酮酸-乳酸脫氫酶-3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(氧化型)系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二氧化碳測定試劑盒，其特征在于:它為單試劑，具體如下: 單試劑:包括緩沖液、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二氧化碳測定試劑盒，其特征在于:它為雙試劑或三試劑，具體如下: 雙試劑: 試劑1:緩沖液、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)。試劑2:緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶。 表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑在試劑I或試劑2的位置不限。 三試劑: 試劑1:緩沖液、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)、磷酸烯醇式丙酮酸、3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(還原型)循環(huán)再生系統(tǒng)。試劑2:緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。 試劑3:緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋 果酸脫氫酶。 表面活性劑、防腐劑、反應(yīng)加速劑在試劑1、試劑2或試劑3中的位置不限。
【文檔編號】G01N33/52GK103558370SQ201310496163
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】周玭, 溫云飛 申請人:青島金洋生物技術(shù)有限公司