專利名稱：端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，具體涉及一種端粒酶永 生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，它屬于神經(jīng)系統(tǒng)疾 病基礎(chǔ)研究以及臨床應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如退行性變疾病帕金森病(PD)、老年癡呆(AD)以 及急性損傷性疾病腦出血、腦梗塞等等， 一般都很難治愈，對(duì)個(gè)人和家庭都是 貽害無(wú)窮。這是因?yàn)榻M成神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞-神經(jīng)元在出生后就已經(jīng)完成了分裂、 增殖和分化，死亡以后就不能獲得新生神經(jīng)元的取代，腦組織一旦損傷，即造 成永久功能喪失。
上世紀(jì)未生命科學(xué)領(lǐng)域中具有劃時(shí)代意義的重大進(jìn)展一神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā) 現(xiàn)為治療這類疾病展現(xiàn)出光明的前景。神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)是藏匿于神經(jīng)系統(tǒng) 某些部位中的一類具有自我更新能力，并且能分化為本系統(tǒng)各種細(xì)胞如神經(jīng) 元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等的多潛能細(xì)胞。這種多分化潛能和自我更 新潛能可以維持相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，甚至終生，且能對(duì)疾病或損傷發(fā)生應(yīng)答，即神經(jīng) 干細(xì)胞及其分化后的子細(xì)胞可補(bǔ)充與替代疾病或損傷的神經(jīng)細(xì)胞。
神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs )是指具有一定增殖能力，但其具有較明確的分化方 向，可以沿著某一語(yǔ)系進(jìn)一步分化為成熟神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。這些細(xì)胞同樣保持 相對(duì)原始的狀態(tài)，具有良好的可塑性，可以通過(guò)基因工程或細(xì)胞工程等當(dāng)代高 新技術(shù)將之進(jìn)行人工改造，使其發(fā)育成為能夠?qū)ι窠?jīng)損傷特別是中樞神經(jīng)損傷 進(jìn)行替代治療的工具。如果我們能夠?qū)⑺鼈兎蛛x出來(lái)，能夠在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)它 們、擴(kuò)增它們，駕馭它們能夠按照我們的意愿來(lái)分化，就能夠?qū)⑺鼈冇米鲋委?神經(jīng)系統(tǒng)損傷的替代細(xì)胞，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療就有希望。
盡管近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究表明，利用體外分離技術(shù)可以使研究者在培養(yǎng)皿 中獲得人神經(jīng)前體細(xì)胞，這些細(xì)胞可在有絲分裂源，堿性成纖維因子(bFGF), 表皮生長(zhǎng)因子(EGF)作用下分裂增殖產(chǎn)生一定量的子代細(xì)胞。但人神經(jīng)前體 細(xì)胞在體外的生存期較短，即使通過(guò)改良培養(yǎng)方式，在培養(yǎng)體系中加入白血病 抑制因子(LIF)等也不能無(wú)限延長(zhǎng)體外神經(jīng)前體細(xì)胞的生存期。體外培養(yǎng)人 神經(jīng)前體細(xì)胞的數(shù)量及質(zhì)量已成為制約神經(jīng)前體細(xì)胞應(yīng)用的最主要因素。如何 獲得可供研究的、大量的人神經(jīng)前體細(xì)胞，已成為目前研究迫切需要解決的一 個(gè)問(wèn)題。
通過(guò)基因工程方法建立起永生化的人神經(jīng)前體細(xì)胞系，就可在一定程度上 解決在體外大量擴(kuò)增前體細(xì)胞的難題。神經(jīng)前體細(xì)胞系特性均一，易于冷凍保 存，易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，易于在良好的質(zhì)量監(jiān)控下提供不同機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用。 人神經(jīng)前體細(xì)胞的永生化研究最早由Sah等于1997年首次報(bào)道，他們利用四
環(huán)素調(diào)控的v-myc基因表達(dá)系統(tǒng)，建立了來(lái)源于人體胚胎13周全腦組織、具 有單潛能及雙潛能的永生化人神經(jīng)前體細(xì)胞系。隨后，F(xiàn)lax與ViUa分別報(bào) 道了 v-myc永生化的多潛能人體胚胎神經(jīng)前體細(xì)胞系B4和HNSC. 100。但由于 myc基因的表達(dá)不僅與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)，而且與細(xì)胞的癌變也密切相關(guān)， 給病人移植就有相當(dāng)?shù)闹铝鑫ｋU(xiǎn)。
細(xì)胞衰老及永生化的端粒假說(shuō)表明，端粒酶活性的維持是細(xì)胞保持增殖能 力的條件之一。通過(guò)外源基因?qū)胫亟ǘ肆Ｃ富钚钥梢允乖鲋衬芰τ邢薜募?xì)胞 達(dá)到永生化。端粒酶永生化的細(xì)胞具有正常人二倍體核型；存在接觸抑制現(xiàn)象 和錨著依賴性特征；不具有致瘤性和軟瓊脂克隆形成能力；DNA被紫外線或電 離輻射損傷后，p53和pl6INK4a, K-Ras的反應(yīng)性誘導(dǎo)與正常細(xì)胞相同。因而 利用人端粒酶催化亞單位基因(hTERT )重建神經(jīng)前體細(xì)胞端粒酶活性，成為 永生化人神經(jīng)前體細(xì)胞的一個(gè)新的方向。Roy及Bai于2004年分別報(bào)道了利 用端粒酶基因建立永生化胚胎脊髓及SVZ區(qū)的人神經(jīng)前體細(xì)胞系。但最新的研 究表明，發(fā)育期的神經(jīng)前體細(xì)胞具有較明確的區(qū)域特異性，不同腦區(qū)不同發(fā)育 階段的細(xì)胞具有不同的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控前體細(xì)胞在體內(nèi)外 定向分化的方向。因此，提供人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)以及臨床治療研究用 的永生化人前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系就成為該技術(shù)領(lǐng)域急需要解決的技術(shù)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種可供人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)以及臨床 治療研究用的永生化人前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案達(dá)到的
一種端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞hSN12W-TERT,已于2008年2 月21日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通生物中心》，其保藏號(hào)為 CGMCC No. 2372。
本發(fā)明的另 一 目的是提供上述端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的 培養(yǎng)方法。
一種端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系，其建立步驟如下
1、 包裝細(xì)胞的篩選及病毒上清的收獲；
2、 病毒感染原代培養(yǎng)人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞；
3、 克隆法篩選hTERT人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞；
4、 hTERT+人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得端粒酶永生化人胚胎 前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于 所述步驟1的具體步驟如下
(1 )對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PG13/JHl/hTERT包裝細(xì)胞經(jīng)0. 25%胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)； (2)用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至濃度為100纟田胞/mL,取0. lmL
細(xì)胞懸液接種于48孔板中，補(bǔ)加0. 4mL完全培養(yǎng)液，37°C, 5%0)2條件下培
養(yǎng)，每周半量換液，培養(yǎng)2-3周；
(3) 相差顯微鏡觀察定期觀察48孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至
60 - 80 %匯合時(shí)，分別將細(xì)胞消化接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)；
(4) 熒光顯微鏡定期觀察各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，培養(yǎng)l周后，挑選熒光 較強(qiáng)的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)；
(5 )收集培養(yǎng)液即病毒上清，用0. 45pm低蛋白吸附膜過(guò)濾，分裝1. 5mL， -70。C保存；
所述步驟2的具體步驟如下
(1 )人胚(孕12周)前腦神經(jīng)前體細(xì)胞分離計(jì)數(shù)后，按5xl05/mL的細(xì) 胞密度接種于預(yù)先包被PLL的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入10mL FBS-NSA培養(yǎng)基， 37°C， 5 0線培養(yǎng)12小時(shí)；將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng)基；
(2 )原代分離的人神經(jīng)前體細(xì)胞在GF-NSA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)72小時(shí)后進(jìn)行 病毒感染，棄培養(yǎng)液，加入高滴度的hTERT病毒上清6mL， GF-NSA完全培養(yǎng)基 4mL, polybrene 8pg/mL (終濃度)，37°C, 5%(^02培養(yǎng)12小時(shí)，棄病毒上清， 換成新鮮GF-NSA培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80 - 90 %匯合后，傳 代；
(3)病毒感染步驟分別在第2、 3代重復(fù)兩次； 所述步驟3的具體步驟如下
(1 )病毒感染后的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋至 2xl0VmL接種于包被PLL的75cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶lmL細(xì)胞懸液，37°C, 5% C(M咅養(yǎng)；
(2) 定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆后，熒光顯微鏡觀察 各細(xì)胞克隆的熒光強(qiáng)度，并標(biāo)記；
(3) 克隆片定點(diǎn)消化表達(dá)熒光的細(xì)胞克隆，將細(xì)胞接種于24孔板中，然 后依次通過(guò)6孔板，25cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；
所述步驟4的具體步驟如下
(1) 篩選后的細(xì)胞，接種于包被PLL的培養(yǎng)中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為GF-NSA 培養(yǎng)基，37°C, 5%0)2培養(yǎng)，每3天換液一次，傳代時(shí)間依細(xì)胞增殖的情況而 定，每7-IO天傳代一次；
(2) 傳代方式培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至901;〔合期，棄培養(yǎng)基，用O. 025%胰蛋 白酶/O. 002%EDTA消化細(xì)胞1 - 3分鐘，棄消化液，加入FBS-NSA培養(yǎng)基，進(jìn) 行吹打，細(xì)胞重懸于FBS-NSA培養(yǎng)基中，按1: 2的比例將細(xì)胞接種于PLL包 被的培養(yǎng)瓶中，37。C,培養(yǎng)2小時(shí)，然后將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng) 基繼續(xù)培養(yǎng)，利用免疫細(xì)胞化學(xué)，RT-PCR，以及電生理功能等方法對(duì)擴(kuò)增的細(xì) 胞進(jìn)行特征測(cè)定，證明所獲得的細(xì)胞是端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞 系hSN12W-TERT。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述步驟l中所述包裝細(xì)胞的建立過(guò)程 如下
(1)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體，其步驟如下目的基因hTERT與報(bào)告基因(人低親和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGFR)的膜表面段 基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因相融合而成)之間通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點(diǎn)(IRES )調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)相連；IRES可以控制兩個(gè)基因由一個(gè)mRNA進(jìn)行表達(dá)， 即目的基因hTERT與報(bào)告基因同時(shí)表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平而確定 目的基因是否表達(dá)；將hTERT-IRES-tNGFR-EGFP基因插入經(jīng)鼠干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體(murine stem cell virus, MSCV )中；測(cè)序鑒定其DNA序列的正確；
(2) 質(zhì)粒的獲得
將上述載體DNA導(dǎo)入大腸桿菌DH5cc中，擴(kuò)增培養(yǎng)，收集細(xì)菌培養(yǎng)液，用 質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行上述提取，純化，獲得可供轉(zhuǎn)染的DNA;
(3) 包裝細(xì)胞PG13/JH1的培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
將PG13/JH1細(xì)胞按1-3 x 107mL的細(xì)胞密度接種到30mm2平皿中；37°C, 5 %0)2培養(yǎng)12 - 24小時(shí)使細(xì)胞達(dá)到60 - 80 %匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前， 用PBS液洗細(xì)胞3次，力口 1ml無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM， 37。C孵育30分鐘；用 無(wú)菌去離子水稀釋質(zhì)粒DNA，將20ja 1質(zhì)粒DNA加入90|u 1水中混勻；將15 iu 1 Lipofectamine 2000緩'漫加入稀釋好的DNA中，邊加邊彈混勻并形成小 泡；將質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37°C ， 5 %〔02轉(zhuǎn)染6 小時(shí)；培養(yǎng)皿中補(bǔ)加lml含20%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染20小時(shí)后，進(jìn)行甘油休克；將37。C溫育的休克液(含85。/。HBS和15%甘油 溶液)滴加在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面，室溫放置2. 5分鐘；將休克液吸棄，用PBS液洗 細(xì)胞1次；加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后傳代；
(4)包裝細(xì)胞抹PG13/JHl/hTERT的篩選
步驟(3 )轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)0. 25°/。+0. 02%EDTA消化后，將細(xì)胞懸液稀釋至 2xi02/mL,接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶lmL細(xì)胞懸液，37°C， 5%0)2培養(yǎng)； 定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆后，焚光顯微鏡觀察各細(xì)胞克隆 的焚光強(qiáng)度，并標(biāo)記；克隆片定點(diǎn)消化表達(dá)焚光的細(xì)胞克隆，將細(xì)胞接種于 24孔板中，然后依次通過(guò)6孔板，25cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得 PG13/JHl/hTERT克隆細(xì)胞抹；
(5)逆轉(zhuǎn)錄病毒上清滴度的測(cè)定以及分泌高滴度病毒PG13/JHl/hTERT 克隆細(xì)胞抹的篩選
將步驟(4)獲得的PG13/JHl/hTERT不同克隆細(xì)胞;f朱細(xì)胞按5xioVml 接種于75cr^的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24小時(shí)后換成新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36-40 小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，即為含病毒上清；將病毒上清用孔徑為0. 45pm的醋酸 纖維素膜過(guò)濾；進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定；
將NIH3T3細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞lt為5 x 104,加DMEM完全 培養(yǎng)液2ml， 37°C， 5%(:02培養(yǎng)24小時(shí)；每個(gè)克隆細(xì)胞抹的病毒上清準(zhǔn)備6 個(gè)不同的稀釋度病毒；分別取lml不同稀釋度的病毒上清加入培養(yǎng)NIH3T3的 6孔培養(yǎng)板中，然后加入2 jj 1濃度為4mg/ml的polybrene (商品名， 一種聚 卣化季銨鹽，用于增加病毒進(jìn)入細(xì)胞的效率。)；37。C感染2-3小時(shí)；中間不
斷搖動(dòng)幾次，以增加病毒的吸附；3小時(shí)后每孔中加入lml含20%FBS的完全 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后用0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，2xioVmL接種于 75cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2周，計(jì)數(shù)細(xì)胞克??；病毒滴度(cfu )=所形成的克 隆數(shù)x上清的稀釋倍數(shù)x傳代的比例；
選取病毒滴度最高的PG13/JHl/hTERT細(xì)胞克隆抹進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)用于感染 神經(jīng)前體細(xì)胞。
本發(fā)明的又一 目的是提供一種端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的 應(yīng)用。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案達(dá)到的
一種端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系在用作人類中樞神經(jīng)系統(tǒng) 疾病研究和治療相關(guān)疾病藥物的藥物中的應(yīng)用。 有益效果
本發(fā)明所述細(xì)胞系命名為hSN12W-TERT。所述細(xì)胞系來(lái)源于人胚胎12周 腹側(cè)端腦，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染人端粒酶催化亞單位基因以及雙報(bào)告基因，截 斷的人〈氐親和4申經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(truncated human nerve growth factor receptor ， tNGFR)、增強(qiáng)型的纟錄色焚光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein ， EGFP)，所述細(xì)胞系表達(dá)人神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體及綠色熒光蛋白，具 有高端粒酶活性，正常人二倍體核型(46， XY),體外連續(xù)傳代培養(yǎng)36個(gè)月， 目前已傳至45代次，群體倍增達(dá)100-120次，群體倍增時(shí)間約為4. 5天，體 外呈單層貼壁生長(zhǎng)，具有接觸抑制和密度抑制特性，棵鼠接種40周無(wú)腫瘤組 織的形成；所述細(xì)胞系表達(dá)前腦轉(zhuǎn)錄因子(Mashl)和Dlx2;增殖條件下， hSN12W-TERT細(xì)胞系表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白，nestin(巢蛋白)，vimentin 和Sox2;分化條件下，可以分化成具有神經(jīng)元，神經(jīng)力交質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì) 細(xì)胞；所述細(xì)胞系分化形成的神經(jīng)元具有電生理學(xué)特性；所述細(xì)胞系在骨形成 蛋白2 (BMP2)的誘導(dǎo)下可以分化成"p氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元。
下面通過(guò)附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但并不意味著對(duì)本 發(fā)明保護(hù)范圍的限制。


圖1是相差顯微鏡顯示人神經(jīng)前體細(xì)胞神經(jīng)球生長(zhǎng)形態(tài)。
圖2是相差顯微鏡顯示人神經(jīng)前體細(xì)胞單層生長(zhǎng)形態(tài)。圖3是相差顯微鏡顯示不同代次單層生長(zhǎng)的人神經(jīng)前體細(xì)胞形態(tài)。
圖4是體外培養(yǎng)人神經(jīng)前體細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
圖5是流式細(xì)胞儀分析人神經(jīng)前體細(xì)胞的細(xì)胞周期及倍體。
圖6是免疫熒光染色顯示增殖條件下人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的特性。
圖7是免疫熒光染色顯示人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的分化特性。
圖8是轉(zhuǎn)染hTERT基因后表達(dá)EGFP的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。
圖9是hSN12W-TERT細(xì)胞球體相差形態(tài)及熒光表達(dá)。
圖10是不同培養(yǎng)條件下hTERT+人神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)NGFR的情況。
圖11是TRAPEZE⑧ELISA測(cè)定人神經(jīng)前體細(xì)胞端粒酶活性。 圖12是不同培養(yǎng)代次的人hSN12W-TERT細(xì)胞EGFP和hTERT基因的表達(dá)。 圖13是相差顯微鏡顯示hSN12W-TERT細(xì)胞的生長(zhǎng)方式。 圖14是不同倍增次數(shù)條件下hSN12W-TERT細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 圖15是BrdU和Ki67免疫熒光染色測(cè)定hSN12W-TERT細(xì)胞的增殖能力。 圖16是吉姆薩染色顯示hSN12W-TERT (PD=20)細(xì)胞為正常A^倍沐，46, XY。 圖17是流式細(xì)胞儀分析不同倍增條件下hSN12W-TERT細(xì)胞周期分期及染 色體倍體。
圖18是hSN12W-TERT接種棵鼠40周后未發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的形成(右圖)，
神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-N-SH接種至棵鼠2周后即出現(xiàn)腫瘤塊(左圖箭頭所指)。 圖19是增殖糾下hSN12W-TERT細(xì)胞(PD=9)中nestin(巢蛋白)蛋白的表達(dá)。 圖20是RT-PCR和免疫熒光染色方法測(cè)定體外長(zhǎng)期培養(yǎng)條件下
hSN12W-TERT細(xì)胞的增殖特性。
圖21是RA誘導(dǎo)7 ^ hSN12W-TERT細(xì)胞(PD - 20)中神^U亍、fe^4ii情^L 圖22是不同因子作用hSN12W-TERT細(xì)胞7天后神經(jīng)元標(biāo)志物
P-III-tubulin陽(yáng)性細(xì)胞的比例統(tǒng)計(jì)。
圖23是RA誘導(dǎo)14天后，hSN12W-TERT細(xì)胞(PD=20)中神經(jīng)元標(biāo)志物
MAP2a/b的表達(dá)情況。
圖24是hSN12W-TERT她(PD=20)諸導(dǎo)7^f^^t^^t浙GFAP的極 圖25是不同因子作用hSN12W-TERT細(xì)胞7天后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物
GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的比例。
圖26是BMP2作用hSN12W-TERT細(xì)胞7天后鈉，鉀電流的分析圖。
圖27是BMP2誘導(dǎo)hSN12W-TERT細(xì)胞3天后，以Fluo-3作為游離鉀離
子指示劑， 一個(gè)典型細(xì)胞在氯化鉀除極前后細(xì)胞內(nèi)焚光強(qiáng)度的變化(A)及時(shí)間-
熒光強(qiáng)度曲線(B)。
圖28是BMP2促進(jìn)hSN12W-TERT細(xì)胞表達(dá)GABA能神經(jīng)元功能和發(fā)育相 關(guān)的分子標(biāo)志。
圖29是BMP2促進(jìn)hSN12W-TERT細(xì)胞分化成GABA能神經(jīng)元。 圖30是實(shí)施例2中構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的步驟示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
人體胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的原代培養(yǎng)及特性鑒定 一、胚胎腦組織的原代分離
1、 取流產(chǎn)胚胎(孕12周)，在嚴(yán)格無(wú)菌條件下取出全腦組織，置于含青 鏈審素的DMEM/F12培養(yǎng)基中4'C保存，細(xì)胞的分離培養(yǎng)在取材后4小時(shí)內(nèi) 完成。
2、 將分離獲得的腦組織浸泡于含青鏈霉素的PBS液中浸洗兩次。
3、 將浸洗后的腦組織置于含NSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基的平皿中，解剖鏡下仔細(xì) 去除腦被膜，然后用手術(shù)刀取出前腦紋狀體置于NSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基中浸洗3次， 每次浸洗5分鐘。
4、 浸洗后的腦組織放入舍蛋白酶XXIII (3mg/ml)的離心管中消化， 37°C， 6分鐘。
5、 離心，1000rpm, 5分鐘，棄消化液，加入FBS-NSA培養(yǎng)基重懸細(xì)胞 沉淀，用拋光的Pasteur吸管反復(fù)輕吹組織約40次。
6、 將細(xì)胞混懸液離心，1000rpm, 5分鐘，棄上清，用FBS-NSA培養(yǎng)基 重懸細(xì)胞沉淀。取O. lmL懸液進(jìn)行胎盤(pán)蘭染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
二、 人體胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的原代培養(yǎng)
1、 本發(fā)明用兩種方法進(jìn)行原代分離神經(jīng)前體細(xì)胞的培養(yǎng)。
(1) 神經(jīng)球培養(yǎng)。原代分離的細(xì)胞懸液按5xl07ml的細(xì)胞密度接種于 未包被的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入10mL FBS-NSA培養(yǎng)基，37。C， 5%0)2培養(yǎng)9-12小時(shí)后，將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)。
(2) 單層貼壁培養(yǎng)。將原代分離的細(xì)胞懸液接種于經(jīng)0. 01%PLL包被的 75cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞接種密度為5xl0Vml，加入lOmL FBS-NSA培養(yǎng)基。37。C， 5 °/oC02，培養(yǎng)9-12小時(shí)后，將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼
續(xù)培養(yǎng)。
2、 上迷兩種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞每隔4 - 5天半量換液一次。
如圖1所示，是用相差顯微鏡的顯示的本步驟所得神經(jīng)前體細(xì)胞神經(jīng)球生 長(zhǎng)形態(tài)。其中A為原代分離細(xì)胞在未包被PLL的培養(yǎng)表面形成典型的神經(jīng)球； B為神經(jīng)球傳代后形成的單細(xì)胞及細(xì)胞小球。放大倍數(shù)，A， BxlOO。
如圖2所示是相差顯微鏡顯示單層貼壁培養(yǎng)的人神經(jīng)前體細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。 A:原代培養(yǎng)初期，細(xì)胞在包被PLL的培養(yǎng)表面形成細(xì)胞集落樣。B:在包被 PLL的培養(yǎng)表面生長(zhǎng)至匯合期的細(xì)胞形態(tài)。
三、 人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
1、 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的情況，選擇合適的時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞傳代。
2、 神經(jīng)球生長(zhǎng)至球體直徑約為300-400拜大小時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)用 拋光好的Pasteur吸管反復(fù)吹打神經(jīng)球，吹打后的細(xì)胞懸液及小神經(jīng)球，重懸 于GF-NSA培養(yǎng)基中。細(xì)胞懸液經(jīng)短暫離心后將碎片棄去，余下的細(xì)胞重新用 GF-NSA懸浮，接種于未包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3、 單層貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至80- 90%匯合時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)用0. 025%胰蛋 白酶/ 0. 002紐DTA消化細(xì)胞約1 ~ 3分鐘，棄消化液。加入FBS-NSA培養(yǎng)基進(jìn) 行吹打后，將細(xì)胞接種于PLL包被的培養(yǎng)瓶中，在FBS-NSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 小時(shí)后，將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
如圖3所示是相差顯微鏡顯示體外培養(yǎng)不同代次后，單層生長(zhǎng)的人神經(jīng) 前體細(xì)胞形態(tài)A:第l代，8 DIV (days in vitro,體外培養(yǎng)天數(shù))。B:第5 代，8 DIV。 C:第11代，14 DIV。放大倍數(shù)A, B， 0 200。
四、人(體)胚(胎)前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的特性鑒定
1、 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定
每一代次的細(xì)胞傳代前，經(jīng)消化、計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，以橫坐標(biāo)為培養(yǎng)天數(shù)，
縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。如圖4所示，此圖說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)增殖 能力。
2、 分析人神經(jīng)前體細(xì)胞的細(xì)胞周期及倍體 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞一瓶，用0. 025%胰蛋白酶/ 0. 002%EDTA消化細(xì)胞后，
離心，1000rpm, 5分鐘。PBS洗3次。將細(xì)胞重懸于lml PBS中，逐滴加入-20'C預(yù)冷的95%乙醇3 ml，混勻，4'C過(guò)夜。離心，1000rpm , 5分鐘。棄固 定液，用含1 %BSA的PBS洗3次。將細(xì)胞懸于0. 2ml PBS中，加入lOOpil RNA 酶A, 37。C作用30分鐘作用完畢后迅速放入冰浴中，加入lO(Hil PI進(jìn)行染色。 如圖5所示，此圖說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)情況下細(xì)胞周期各時(shí)期所占的百分?jǐn)?shù)，以及 DNA含量。體外培養(yǎng)的人神經(jīng)前體細(xì)胞DNA含量與正常二倍體細(xì)胞含量相同。 hNSCs代表體外培養(yǎng)的人神經(jīng)前體細(xì)胞。對(duì)照組為正常成年人外周血淋巴細(xì) 胞。
3、 分析人神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖條件下的細(xì)胞特性
如圖6所示，體外培養(yǎng)的人神經(jīng)前體細(xì)胞所形成的神經(jīng)球呈BrdU染色(A )， BrdU(5-溴脫氧尿苷)陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在神經(jīng)球的表面。BrdU陽(yáng)性說(shuō)明，細(xì) 胞在分裂時(shí)將BrdU摻入其中。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)標(biāo)記細(xì)胞群體中處于DNA合成期 (S期)的細(xì)胞比例。體外培養(yǎng)的神經(jīng)球呈神經(jīng)前體細(xì)胞特異性蛋白nestin 染色陽(yáng)性(B )。單層培養(yǎng)細(xì)胞第8代時(shí)，細(xì)胞呈nes t in (巢蛋白)染色陽(yáng)性(C )， (D)為(C)相同視野的細(xì)胞核DAPI(4', 6-二絲-2-苯基-引咮)復(fù)染。BrdU 陽(yáng)性的細(xì)胞占40%陽(yáng)性(E )， (F)為(E )相同視野的細(xì)胞核DAPI復(fù)染。 3、分析人神經(jīng)前體細(xì)胞的的分化特性
如圖7所示，單層培養(yǎng)的第8代細(xì)胞在含1。/。FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后 可分化為神經(jīng)元(III-tubulin (A)， NF68KD蛋白(B)染色陽(yáng)性)，神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞(GFAP蛋白染色(C))，少突膠質(zhì)細(xì)胞(Gal C染色陽(yáng)性(D))。
實(shí)施例2
端粒酶永生化人胚(胎)前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的建立及特性鑒定 一、端粒酶永生化人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的建立 1.含人端粒酶催化亞單位基因的包裝細(xì)胞PG13/JHl/hTERT的建立 (1)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體，其步驟如圖30所示。
目的基因hTERT與報(bào)告基因(人低親和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(low-affinity human nerve growth factor receptor, NGFR)的膜表面段基因與增強(qiáng)型綠色焚光蛋 白(Enhanced green fluorescent protein , EGFP )基因相融合而成)之間 通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal ribozyme entry site , IRES)調(diào)節(jié)結(jié) 構(gòu)相連；IRES可以控制兩個(gè)基因由一個(gè)mRNA進(jìn)行表達(dá)，即目的基因hTERT與 報(bào)告基因同時(shí)表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平而確定目的基因是否表達(dá)；
將hTERT-IRES-tNGFR-EGFP基因插入經(jīng)鼠干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(mur ine s tem cell virus, MSCV )中；測(cè)序鑒定其DNA序列的正確； (2)質(zhì)粒的獲得
將上述載體DNA導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，擴(kuò)增培養(yǎng)，收集細(xì)菌培養(yǎng)液，用 質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行上述提取，純化，獲得可供轉(zhuǎn)染的DNA; (3 )包裝細(xì)胞PG13/JH1的培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
將PG13/JH1細(xì)胞按1-3 x 107mL的細(xì)胞密度接種到30mm2平皿中；37°C， 5%(:02培養(yǎng)12-24小時(shí)使細(xì)胞達(dá)到60 - 80 %匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前， 用PBS液洗細(xì)胞3次，力o 1ml無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM, 37。C孵育30分鐘；用 無(wú)菌去離子水稀釋質(zhì)粒DNA，將20ul質(zhì)粒DNA加入90 /a 1水中混勻；將15 |a 1 Lipofectamine 2000》爰慢加入稀釋好的DNA中，邊加邊彈混勻并形成小泡； 將質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37°C， 50線轉(zhuǎn)染6小時(shí)； 培養(yǎng)皿中補(bǔ)力口 lml含20%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染20 小時(shí)后，進(jìn)行甘油休克；將37。C溫育的休克液(含85。/。HBS和15%甘油溶液) 滴加在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面，室溫放置2. 5分鐘；將休克液吸棄，用PBS液洗細(xì)胞1 次；加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后傳代。
(4) 包裝細(xì)胞林PG13/JHl/hTERT的篩選
步驟(3 )轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)0. 25°/。+0. 02%EDTA消化后，將細(xì)胞懸液稀釋至 2xi02/mL,接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶lmL細(xì)胞懸液，37°C， 5%(:02培養(yǎng)； 定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆后，熒光顯微鏡觀察各細(xì)胞克隆 的熒光強(qiáng)度，并標(biāo)記；克隆片定點(diǎn)消化表達(dá)熒光的細(xì)胞克隆，將細(xì)胞接種于 24孔板中，然后依次通過(guò)6孔板，25cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得 PG13/JHl/hTERT克隆細(xì)月包4朱；
(5) 逆轉(zhuǎn)錄病毒上清滴度的測(cè)定以及分泌高滴度病毒PG13/JHl/hTERT 克隆細(xì)胞抹的篩選
將步驟(4)獲得的PG13/JHl/hTERT不同克隆細(xì)胞抹細(xì)胞按5xl。Vml 接種于75cW的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24小時(shí)后換成新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36-40 小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，即為含病毒上清；將病毒上清用孔徑為0.45pm的醋酸 纖維素膜過(guò)濾；進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定；
將NIH3T3細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5 x 104,加DMEM完全 培養(yǎng)液2ml， 37°C， 5%0)2培養(yǎng)24小時(shí)；每個(gè)克隆細(xì)胞抹的病毒上清準(zhǔn)備6 個(gè)不同的稀釋度病毒；分別取lml不同稀釋度的病毒上清加入培養(yǎng)NIH3T3的 6孔培養(yǎng)板中，然后加入2ul 4tng/ml Polybrene; 37。C感染2-3小時(shí)；中間 不斷搖動(dòng)幾次，以增加病毒的吸附；3小時(shí)后每孔中加入lml含"。/。FBS的完 全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后用0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，2xl0VraL接種 于75cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2周，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆；病毒滴度(cfu )=所形成的 克隆數(shù)x上清的稀釋倍數(shù)x傳代的比例；
選取病毒滴度最高的PG13/JHl/hTERT細(xì)胞克隆抹進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)用于下面
步驟2。
2、包裝細(xì)胞的篩選及病毒上清的收獲
(1 )對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PG13/JHl/hTERT包裝細(xì)胞經(jīng)0. 25%胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)。
(2) 用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至濃度為1GQ細(xì)胞/mL。取Q. lmL 細(xì)胞懸液接種于"孔;f反中，每孔約10個(gè)細(xì)胞，然后補(bǔ)加0. 4mL完全培養(yǎng)液。 3丌C 5%0)2培養(yǎng)，每周半量換液，培養(yǎng)2-3周。
(3) 相差顯微鏡觀察定期觀察48孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至 60 - 80 %匯合時(shí)，分別將細(xì)胞消化接種于6孔板中；繼續(xù)培養(yǎng)；
(4) 熒光顯微鏡定期觀察各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。培養(yǎng)1周后，挑選焚光 較強(qiáng)的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。
(5) 收集培養(yǎng)液即病毒上清，用0. 45，低蛋白吸附膜過(guò)濾，分裝1.5mL, -7(TC保存。
3、 病毒感染原代培養(yǎng)人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞
(1 )人胚(孕12周)前腦神經(jīng)前體細(xì)胞分離計(jì)數(shù)后，按5x 10-7 mL的細(xì) 胞密度接種于預(yù)先包被PLL的75cn^培養(yǎng)瓶中，加入10mL FBS-NSA培養(yǎng)基， 37°C, 5%〔02培養(yǎng)12小時(shí)。將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng)基。
(2 )原代分離的人神經(jīng)前體細(xì)胞在GF-NSA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)72小時(shí)后進(jìn)行 病毒感染。棄培養(yǎng)液，加入高滴度的hTERT病毒上清6mL， GF-NSA完全培養(yǎng)基 4mL, polybrene(商品名， 一種聚囟化季銨鹽，用于增加病毒進(jìn)入細(xì)胞的效率。) 8嗎/mL(終濃度)，37°C, 5%0)2培養(yǎng)12小時(shí)。棄病毒上清，換成新鮮GF-NSA 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80-90%匯合后，傳代。
(3)病毒感染步驟分別在第2、 3代重復(fù)兩次。
4、 克隆法篩選hTERr人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞
(1 )病毒感染后的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液稀釋至 2xl0VmL接種于包被PLL的75ci^培養(yǎng)瓶中，每瓶lmL細(xì)胞懸液，37°C， 5% COi培養(yǎng)。
(2)定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆后，熒光顯微鏡觀察 各細(xì)胞克隆的菱光強(qiáng)度，并標(biāo)記。
(3 )克隆片定點(diǎn)消化表達(dá)熒光的細(xì)胞克隆，將細(xì)胞接種于24孔板中，然 后依次通過(guò)6孔板，25cn^培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
如圖8所示轉(zhuǎn)染hTERT基因后表達(dá)EGFP的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。
5、 hTER"T人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
(1) 篩選后的細(xì)胞，接種于包被PLL的培養(yǎng)中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為GF-NSA 培養(yǎng)基，37°C， 5%<:02培養(yǎng)。每3天換液一次，傳代時(shí)間依細(xì)胞增殖的情況而 定，每7-1G天傳代一次。
(2) 傳代方式培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90°/。匯合期，棄培養(yǎng)基，用0.025%胰蛋 白酶/ 0. 002%EDTA消化細(xì)胞1 - 3分鐘，棄消化液，加入FBS-NSA培養(yǎng)基，進(jìn) 行吹打。細(xì)胞重懸于FBS-NSA培養(yǎng)基中，按1: 2的比例將細(xì)胞接種于PLL包
被的培養(yǎng)瓶中，3"TC ,培養(yǎng)2小時(shí)，然后將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng) 基繼續(xù)培養(yǎng)。
(3 )傳代培養(yǎng)時(shí)將一部分細(xì)胞接種于未包被PLL的培養(yǎng)瓶中，觀察轉(zhuǎn)基 因后的細(xì)胞是否可以形成神經(jīng)球。
如圖9所示轉(zhuǎn)染hTERT基因后人神經(jīng)前體細(xì)胞仍可以形成神經(jīng)球。(A) 為相差顯微鏡照片。(B)為熒光顯微鏡照片。放大倍數(shù)xlOO
在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，為了能夠保存細(xì)胞，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷凍。冷凍保存 細(xì)胞的方式細(xì)胞凍存液中加入50%的FBS,凍存時(shí)程序選擇為室溫—4°C (1小時(shí))—低溫冰箱(-7(TC 15分鐘)—液氮(-196°C)。
細(xì)胞凍存液GF-NSA培養(yǎng)基4mL; FBS: 5mL; DMS0: lmL。
經(jīng)過(guò)上述過(guò)程，獲得穩(wěn)定的克隆細(xì)胞抹，被命名為hSN12W-TERT。經(jīng)過(guò)連 續(xù)2年的培養(yǎng)，目前hSN12W-TERT細(xì)胞已經(jīng)傳代55代(群體倍增達(dá)180多次)， 并且沒(méi)有出現(xiàn)任何衰老特征。細(xì)胞生物學(xué)界普遍接受的觀點(diǎn)是細(xì)胞群體倍增超 過(guò)100次即為達(dá)到了永生化，因此本發(fā)明建立的hSN12W-TERT細(xì)胞已經(jīng)是永生 化的細(xì)胞。該細(xì)胞已于2008年2月21日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No. 2372。
二、 hTERT+人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的特性鑒定
1 、 hTERr人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)外源基因的情況
如圖IO所示，hTERr人神經(jīng)前體細(xì)胞在增殖條件(GF-NSA培養(yǎng)基，(A)) 以及全反式維甲酸(Al卜trans-retinoic acid, RA ) ( lpM )誘導(dǎo)14天(B)的 情況下均表達(dá)外源標(biāo)志基因NGFR。 NGFR陽(yáng)性部位出現(xiàn)在細(xì)胞表面。
如圖11所示為利用TRAPEZE⑧ELISA方法測(cè)定hTERT+細(xì)胞端粒酶活性的結(jié) 果。未轉(zhuǎn)染永生化基因的第2代人神經(jīng)前體細(xì)胞(HSNp2 )及經(jīng)過(guò)RA誘導(dǎo)分化 后的hTERT+細(xì)胞(HNSTert p18 RA誘導(dǎo)14天)均呈較低的端粒酶活性。而第 18代次hTERT'細(xì)胞(HNSTert p18)的端粒酶活性明顯升高，接近于陽(yáng)性細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞。所有樣本均熱滅活后端粒酶活性均明顯降低， 這符合端粒酶的特性。
如圖12所示為利用RT-PCR測(cè)定不同培養(yǎng)代次的人hSN12W-TERT神經(jīng)前體 細(xì)胞均表達(dá)外源基因EGFP和hTERT。 GAPDH是人3-石舞酸甘油醛脫氫酶為內(nèi)對(duì) 照。1,代表未永生化的第2代人神經(jīng)前體細(xì)胞；2-4代表第11, 18和24代 的hSN12W-TERT.
2、 hTERr人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的生長(zhǎng)情況
如圖13所示為相差顯微鏡顯示hSN12W-TERT細(xì)胞的生長(zhǎng)方式。A是以單 層貼壁方式生長(zhǎng)的hSN12W-TERT，體外培養(yǎng)4天。B為hSN12W-TERT細(xì)胞在培 養(yǎng)2G天后可形成神經(jīng)^1。
如圖14表示體外PD為7， 30條件下，hSN12W-TERT細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。兩 條曲線的趨勢(shì)基本相同，說(shuō)明體外連續(xù)培養(yǎng)并不改變細(xì)胞的增殖能力。
圖15則通過(guò)BrdU(c)和Ki67 (e) ( BrdU陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞在分裂時(shí)將BrdU
摻入其中。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)標(biāo)記細(xì)胞群體中處于DNA合成期(S期)的細(xì)胞比例。 Ki67抗體可以檢測(cè)處于細(xì)胞周期中的細(xì)胞，反映細(xì)胞群體中具有增殖能力的 細(xì)胞數(shù))免疫熒光染色進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞的增殖能力。圖15 (d)、 (f)中的影 像分別是圖(c) (e)相同視野的細(xì)胞核DAPI復(fù)染。
群體倍增(PD)次數(shù)及時(shí)間的測(cè)定。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)消化、計(jì)數(shù)后，按 2x107瓶接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，37°C， 5%(]02培養(yǎng)。每4天換液一次。當(dāng) 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)。按下列公式計(jì)算出 hSN12W-TERT細(xì)胞的倍增時(shí)間為4. 5天。
PD值<formula>formula see original document page 16</formula>
T:群體倍增時(shí)間；t:接種至測(cè)定的間隔時(shí)間；N。接種時(shí)的細(xì)胞數(shù)； Nt :測(cè)定時(shí)的細(xì)胞數(shù)。
3、 hTERr人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞保持正常染色體核型 (1)吉姆薩染色顯帶技術(shù)顯示細(xì)胞染色體
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞hTERr人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞一瓶。棄舊培養(yǎng)基，加入 含0. 2pg/mL秋水仙素的新鮮培養(yǎng)基37°C, 5%(;02培養(yǎng)8小時(shí)。棄培養(yǎng)液，用 0. 25%胰蛋白酶與0. 02°/。EDTA (1:1混合)消化細(xì)胞，吹打，制備單細(xì)胞懸液。 離心，1500rpm， 5分鐘，棄上清。將細(xì)胞懸浮于低滲KC1 ( 0. 075M)溶液中， 37。C水浴，孵育15分鐘。離心，1500rpm, 5分鐘，棄上清，留少許低滲液。 加新鮮配置的固定液2mL，混勻，室溫固定20分鐘。離心，1500rpm， 5分鐘， 棄上清。加新鮮固定液，固定15分鐘。離心，棄上清。將細(xì)胞懸浮在少許固 定液中。用滴管滴加懸液于干凈的4。C預(yù)冷的載玻片上，空氣干燥。吉姆薩染 色。油鏡觀察，照相。
如圖16顯示hSN12W-TERT (PD=20)細(xì)胞為正常人二倍體，46條染色體， XY (男性核型)。說(shuō)明轉(zhuǎn)染端粒酶基因并未改變前體細(xì)胞的染色體數(shù)量。
(2)流式細(xì)胞儀分析測(cè)定細(xì)胞周期及染色體倍體
如圖17顯示培養(yǎng)早期以及中期hSN12W-TERT細(xì)胞周期分期及染色體倍體 均未發(fā)生明顯變化。(圖中GO-Gl代表DNA合成前期、S期代表DNA合成期、 G2代表DNA合成后期、M代表細(xì)胞有絲分裂期。兩組細(xì)胞各期的百分比比較 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。)
(3 )棵鼠接種測(cè)定hTERr神經(jīng)前體細(xì)胞的致瘤性
分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第9代hTERT+人胚神經(jīng)前體細(xì)胞(PD= 13)以及陽(yáng) 性對(duì)照細(xì)胞SK-N-SH。離心，PBS洗3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)。用PBS將細(xì)胞濃度稀釋 成lxl0VmL。 4-6周齡雌性Babe/c棵鼠，隨機(jī)分成三組，每組3只。每只 棵鼠右側(cè)腋部皮下接種0. 2mL細(xì)胞懸液(含細(xì)胞數(shù)為2xl06)。陰性對(duì)照接種 PBS,標(biāo)記。每周觀察一次，記錄各組動(dòng)物腫瘤塊的形成。(見(jiàn)圖18。)圖中右 圖顯示，hSN12W-TERT接種棵鼠40周后未發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的形成，左圖顯示， 神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-N-SH接種至棵鼠2周后即出現(xiàn)腫瘤塊(左圖箭頭所指)。
4、 hTERr細(xì)胞保持神經(jīng)前體細(xì)胞的特性(1 ) hSN12W-TERT神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性基因 如圖19， 20所示，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)條件下hSN12W-TERT細(xì)月包(PD-9)保持神 經(jīng)前體細(xì)胞增殖特性。圖19所示(A圖增殖條件下hSN12W-TERT細(xì)胞中表達(dá) 神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志蛋白nestin(巢蛋白)的表達(dá)。B圖為A圖同視野細(xì)胞核DAPI 染色。)圖20 A顯示RT-PCR方法測(cè)定不同培養(yǎng)代次細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)記 物nestin (巢蛋白)和Sox2 ( GAPDH見(jiàn)第12頁(yè))表達(dá)的結(jié)果(分子量標(biāo)準(zhǔn)，1, 代表未永生化的第2代人神經(jīng)前體細(xì)胞；2-5代表第11， 18， 24， 40代的 hSN12W-TERT說(shuō)明hSN12W-TERT細(xì)胞在體外連續(xù)增殖條件下仍保持前體細(xì)胞的 特性)；B:免疫細(xì)胞化學(xué)示hSN12W-TERT細(xì)胞(第40代)viment in (波絲蛋白) (a)表達(dá)。(b)為圖(a)相同視野細(xì)胞核DAPI復(fù)染，(d)為圖(a)與(b) 的疊加。
(2 ) hSN12W-TERT神經(jīng)前體細(xì)胞具有分化潛能 如圖21所示，hSN12W-TERT在RA作用7天后，3申經(jīng)元標(biāo)志物(3 -III-tubulin (A)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。(B)為圖(A)同視野細(xì)胞核DAPI 復(fù)染(說(shuō)明A圖陽(yáng)性細(xì)胞的比率，其它同)。圖22所示，hSN12W-TERT在RA, BMP2, BDNF， GDNF的誘導(dǎo)下，均可分化成神經(jīng)元。其中以RA， BMP2的作用較 為明顯。圖23顯示，在RA作用14天后，hSN12W-TERT細(xì)胞(PD-20 )中表示 成熟神經(jīng)元的MAP2a/b蛋白表達(dá)明顯增高(A)。 (B)為圖(A)同視野細(xì)胞核DAPI 復(fù)染。
圖24所示，hSN12W-TERT在RA作用7天后，神經(jīng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志GFAP (A)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。(B)為圖(A)同視野細(xì)胞核DAPI復(fù)染。圖25所示， hSN12W-TERT在RA， BMP2, BDNF， GDNF的誘導(dǎo)下， 一部分細(xì)胞分化為表達(dá)神 經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志GFAP的細(xì)胞。不同因子誘導(dǎo)組，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的比例有一定 差異。
(3 ) hSN12W-TERT神經(jīng)前體細(xì)胞分化后形成的神經(jīng)元具有電生理特性 a. 4內(nèi)鐘電;;充
BMP2誘導(dǎo)hSN12W-TERT細(xì)胞7天后，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞的 電生理活動(dòng)。BMP2誘導(dǎo)組共成功封接記錄了 8個(gè)細(xì)胞，5個(gè)細(xì)胞記錄到內(nèi)向鈉 電流。鈉電流的峰值為244 ±68 pA (n =5)。當(dāng)應(yīng)用保持電位為-70mV，去 極化電位為-70 mV-+100mV、步階脈沖為10 mV、刺激脈寬為50ms的方波鉗制 方案進(jìn)行刺激時(shí)，可記錄到內(nèi)向鈉電流(圖26a)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)制作電流-電 壓(I-V)關(guān)系曲線(圖26b)可知該電流在復(fù)極至-40mV時(shí)^皮激活，0 mV時(shí)達(dá) 到峰值。在使用電極內(nèi)液2，保持電位為-70mV,施與細(xì)胞去極化電位 -lOOmV-+100mV,鉗制時(shí)間為100ms的斜坡刺激，記錄了 6個(gè)細(xì)胞，記錄到外 向電流。鉀電流的平均峰值為2810 ± 840 pA (n = 6,均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。外向 電流有兩種不同類型，其中一種是快速激活、快速失活(圖26c);另外一種 是快速激活、緩慢失活(圖26d)。未分化細(xì)胞未能檢測(cè)到內(nèi)向電流(n = 5)。 在某些細(xì)J包上可以記錄到外向鉀電流，但電流幅度較'J、。
b. 鈞成像
以Fluo-3作為細(xì)胞內(nèi)游離4丐的指示劑檢測(cè)BMP2誘導(dǎo)hSN12W-TERT細(xì)胞3 天，Kl(60mM)去極化前后細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化后顯示，負(fù)載Fluo-3 后，靜息狀態(tài)下細(xì)胞胞漿內(nèi)有較弱的綠色熒光在加入的KC1后1秒之內(nèi)，綠色 熒光的強(qiáng)度迅速增強(qiáng)至最強(qiáng)(圖27a ),約60%的細(xì)胞胞漿內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度增加 三倍或三倍以上(圖27b );在5分鐘內(nèi)，熒光強(qiáng)度又迅速恢復(fù)至靜息狀態(tài)(圖 27b)。
c. hSN12W-TERT分化為GABA能神經(jīng)元
圖28 RT-PCR結(jié)果顯示，在BMP2誘導(dǎo)細(xì)胞分化的3 ( B3 )、 5 ( B5 )、 7 ( B7 ) 天過(guò)程中，與GABA能神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)的因子Mashl表達(dá)逐漸上調(diào)，Dlx2從 第5天開(kāi)始表達(dá)并逐漸增加；GABA能神經(jīng)元的標(biāo)記物GAD67 (谷氨酸脫羧酶， 即GABA合成的限速酶)表達(dá)上調(diào)，vGAT (嚢泡型GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體，將合成的GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡運(yùn)輸)在BMP2作用第5天開(kāi)始持續(xù)表達(dá)，GAT-1 ( GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體， 將GABA至重吸收GABA能神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞)表達(dá)逐漸上調(diào)。
圖29的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，BMP2作用細(xì)胞7天后，GABA陽(yáng)性細(xì)胞占 細(xì)胞總數(shù)的61. 2%(圖29, e )，染色陽(yáng)性部位在細(xì)胞的胞漿和突起(圖29， b, c ); P-III-tubulin與GABA雙標(biāo)染色表明，97. 6%的細(xì)月包同時(shí)表達(dá)這兩種蛋白 (圖29, d)。
本發(fā)明中提到的幾種培養(yǎng)液的配方如下
所用NSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成如下DME M/F12: 15. 6 g;葡萄糖6. 0 g; BSA1. 0 g; NaHC03 1. 0g。
上述成分溶于1L高壓滅菌的去離子水中，用0. "pm濾膜過(guò)濾后分裝，rC 保存。
所述FBS-NSA培養(yǎng)基為NSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基88mL;青霉素/鏈霉素lmL; L-谷氨酰胺(200mM): lmL;胎牛血清(FBS ): 10mL。
所述GF-NSA培養(yǎng)基為NSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基96. 3 mL;青霉素/鏈霉素(100 萬(wàn)單位/mL): lmL; N2: lmL;胰島素(10mg/mL): 0. 2mL; L-谷氨酰胺(200mM): lmL; EGF(O. 1(ig/(iL): 20pL; bFGF(0 : 20pL; FBS: 0. 5ml。
所述步驟(3)中用GF-NSA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后更換為下述誘導(dǎo)分 化培養(yǎng)基NSA基礎(chǔ)培養(yǎng)基96. 8 mL;青霉素/鏈霉素(100萬(wàn)單位/ mL ): lmL; N2: lmL;胰島素(10mg/mL): 0. 2mL; L-谷氨酰胺(200mM): lmL。
誘導(dǎo)分化時(shí)分別加入BMP2 ( lng/ml )、 BDNF( 10ng/ml )、 GDNF( 10ng/ml )、 RA ( l薩)。
本發(fā)明中提到的幾種引物如下:
,mRNA引物(5'-3')片段大小(bp)退火溫度CC)
Dlx2TGGCTGATATGCACTCGA26155
GCTGGCTTGGTACTGGTAGEGFPATGGTGAGCAAGGGCGAGGA71058
TTACTTGTACAGCTCGTCCAGAD67CGAGGACTCTGGACAGTAGAGG18255
GATCTTGAGCCCCAGTTTTCTGGAPDHCCACCCAGAAGACTGTGGAT18758
AGGTCCACCACTGACACGTTGAT-1TGGCTGATGGCTCTGTCTTC ACAG丁GTCTTCGCTGGGCTG12255
hTERTGAGGAGGAGGACACAGACCC28958
CAGGATCTCCTCACGCAGACMashlGTCGAGTACATCCGCGCGCTG22065
AGAACCAGTTGGTGAAGTCGAncstinAGGATGTGGAGGTAGTGAGA26655
TGGAGATCTCAGTGGCTCTTSox2AGTCTCCAAGCGACGAAAAA41055
GGAAAGTTGGGATCGAACAAvGATACGACCTCGACTTTGAGCAC35855
ATGAGGATCTTGCCGGTGTAP -actinAGCCTCGCCTTTGCCGA CTGGTGCCTGGGGCG17455 °C
權(quán)利要求
1、一種端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系，已于2008年2月21日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2372。
2、 如權(quán)利要求1所述的端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系，其建 立步驟如下(1 )、包裝細(xì)胞的篩選及病毒上清的收獲；(2 )、病毒感染原^、培養(yǎng)人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞；(3 )、克隆法篩選hTERT+人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)^4(4)、 hTERr人胚前腦神經(jīng)前體細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，利用免疫細(xì)胞化學(xué)， RT-PCR,以及電生理功能等方法對(duì)擴(kuò)增的細(xì)胞進(jìn)行特征測(cè)定，證明所獲得的細(xì) 胞是獲得端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系的建 立方法，其特征在于所述步驟(1 )的具體步驟如下(a )對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PG13/JHl/hTERT包裝細(xì)胞經(jīng)0. 25%胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)；(b) 用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至濃度為100細(xì)胞/mL;取G. lmL 細(xì)胞懸液接種于48孔板中，補(bǔ)加0. 4mL完全培養(yǎng)液；37°C， 5°/"02條件下培 養(yǎng)，每周半量換液，培養(yǎng)2-3周；(c) 相差顯微鏡觀察定期觀察48孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至 6 0 - 8 0 %匯合時(shí)，分別將細(xì)胞消化接種于6孔板中；繼續(xù)培養(yǎng)；(d) 熒光顯微鏡定期觀察各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；培養(yǎng)1周后，挑選焚光 較強(qiáng)的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)；(e) 收集培養(yǎng)液即病毒上清，用0. 45pm低蛋白吸附膜過(guò)濾，分裝1. 5mL, -7(TC保存;所述步驟(2)的具體步驟如下(a )孕12周的人類胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞分離計(jì)數(shù)后，按5xl07mL的 細(xì)胞密度接種于預(yù)先包被PLL的75ci^培養(yǎng)瓶中，加入10mL FBS-NSA培養(yǎng)基， 37。C, 5%0)2培養(yǎng)12小時(shí);將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng)基；(b )原代分離的人神經(jīng)前體細(xì)胞在GF-NSA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)72小時(shí)后進(jìn)行 病毒感染；棄培養(yǎng)液，加入高滴度的hTERT病毒上清6mL, GF-NSA完全培養(yǎng)基 4mL，加入polybrene 4吏其終濃度為^g/mL, 37°C， 5%(]02培養(yǎng)12小時(shí)；棄 病毒上清，換成新鮮GF-NSA培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80 - 90 % 匯合后，傳代；(C )病毒感染步驟分別在第2、 3代重復(fù)兩次；所述步驟(3)的具體步驟如下(a )病毒感染后的細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；將細(xì)胞懸液稀釋至 2xl07mL接種于包被PLL的75，2培養(yǎng)瓶中，每瓶lmL細(xì)胞懸液，37°C， 5% CO:培養(yǎng);(b )定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆后，焚光顯微鏡觀察 各細(xì)胞克隆的熒光強(qiáng)度，并標(biāo)記；(c )克隆片定點(diǎn)消化表達(dá)焚光的細(xì)胞克隆，將細(xì)胞接種于24孔板中，然 后依次通過(guò)6孔板，25cnr'培養(yǎng)^L進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； 所述步驟(4)的具體步驟如下U)篩選后的細(xì)胞，接種于包被PLL的培養(yǎng)中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基為GF-NSA 培養(yǎng)基，37°C， 5%0)2培養(yǎng)；每3天換液一次，每7-IO天傳代一次；(b)傳代方式培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合期，棄培養(yǎng)基，用O. 025%胰蛋 白酶/ 0. 002%EDTA消化細(xì)胞1 — 3分鐘，棄消化液，加入FBS-NSA培養(yǎng)基，進(jìn) 行吹打；細(xì)胞重懸于FBS-NSA培養(yǎng)基中，按1: 2的比例將細(xì)胞接種于PLL包 被的培養(yǎng)瓶中，37°C，培養(yǎng)2小時(shí)，然后將FBS-NSA培養(yǎng)基換成GF-NSA培養(yǎng) 基繼續(xù)培養(yǎng)，獲得端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系hSN12W-TERT。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系的建 立方法，其特征在于所述步驟(a )中所述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PG13/JHl/hTERT包裝 細(xì)胞的建立過(guò)程如下(1 )構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其步驟如下目的基因hTERT與報(bào)告基因之間通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)相連；將hTERT-IRES-tNGFR-EGFP基因插入經(jīng)鼠干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCV中；(2) 質(zhì)粒的獲得將上述栽體DNA導(dǎo)入大腸桿菌DH5a中，擴(kuò)增培養(yǎng)，收集細(xì)菌培養(yǎng)液，用 質(zhì)粒提取試劑盒對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行上迷提取，純化，獲得可供轉(zhuǎn)染的DNA;(3) 包裝細(xì)胞PG13/JH1的培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將PG13/JH1細(xì)胞按1-3 x 107mL的細(xì)胞密度接種到30mm2平皿中；37。C, 5。/。COz培養(yǎng)12-24小時(shí)使細(xì)胞達(dá)到60 - 80%匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前， 用PBS液洗細(xì)胞3次，力a lml無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM, 37'C孵育30分鐘；用 無(wú)菌去離子水稀釋質(zhì)粒DNA，將20p 1質(zhì)粒DNA加入90 ja 1水中混勻；將15 ia 1 Lipofectamine 2000緩慢加入稀釋好的DNA中，邊加邊彈混勻并形成小 泡；將質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑的混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37。C， 5%0)2轉(zhuǎn)染6 小時(shí)；培養(yǎng)m中補(bǔ)加lml含20。/。FBS的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染20小時(shí)后，進(jìn)行甘油休克；將37。C溫育的含85。/。HBS和15%甘油溶液的休 克液滴加在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面，室溫放置2. 5分鐘；將休克液吸棄，用PBS液洗細(xì) 胞1次；加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后傳代； (4)包裝細(xì)胞抹PG13/JHl/hTERT的篩選步驟(3 )轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)0. 25%+0. 02%EDTA消化后，將細(xì)胞懸液稀釋至 2xlOVmL，接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶lmL細(xì)胞懸液，37°C, 5%(:02培養(yǎng)； 定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞克隆后，焚光顯微鏡觀察各細(xì)胞克隆 的焚光強(qiáng)度，并標(biāo)記；克隆片定點(diǎn)消化表達(dá)焚光的細(xì)胞克隆，將細(xì)胞接種于 24孔板中，然后依次通過(guò)6孔板，25cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得 PG13/JHl/hTERT克隆細(xì)胞才朱；(5 )逆轉(zhuǎn)錄病毒上清滴度的測(cè)定以及分泌高滴度病毒PG13/ JH1 /hTERT 克隆細(xì)胞抹的篩選—將步驟(4)獲得的PG13/JHl/hTERT不同克隆細(xì)胞抹細(xì)胞按5xl。7ml 接種于75cn^的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24小時(shí)后換成新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36-40 小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，即為含病毒上清；將病毒上清用孔徑為0.45nm的醋酸 纖維素膜過(guò)濾；進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定；將NIH3T3細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5 x i(T,加D隨完全 培養(yǎng)液2ml， 37°C， 5%(:02培養(yǎng)24小時(shí)；每個(gè)克隆細(xì)胞抹的病毒上清準(zhǔn)備6 個(gè)不同的稀釋度病毒；分別取lml不同稀釋度的病毒上清加入培養(yǎng)NIH3T3的 6孔培養(yǎng)板中，然后加入2 iu 1濃度為4mg/ml的polybrene; 37。C感染2 - 3 小時(shí)；中間不斷搖動(dòng)幾次，以增加病毒的吸附；3小時(shí)后每孔中加入lml含20 %FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后用0. 25°/。胰蛋白酵消化細(xì)胞，2x 102/mL接種于75cm'培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2周，計(jì)數(shù)細(xì)胞克?。贿x取病毒滴度最 高的PG13/JHl'/hTERT細(xì)胞克隆抹進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
5、 一種權(quán)利要求1所述的端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系在用 作人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究和治療相關(guān)疾病藥物的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種端粒酶永生化人胚胎前腦神經(jīng)前體細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用，該細(xì)胞系已于2008年2月21日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No.2372。本發(fā)明所述細(xì)胞系命名為hSN12W-TERT。所述細(xì)胞系表達(dá)人神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體及綠色熒光蛋白，具有高端粒酶活性，正常人二倍體核型，體外連續(xù)傳代培養(yǎng)36個(gè)月，目前已傳至45代次，群體倍增達(dá)100-120次，具有接觸抑制和密度抑制特性；所述細(xì)胞系分化形成的神經(jīng)元具有電生理學(xué)特性；所述細(xì)胞系在骨形成蛋白2(BMP2)的誘導(dǎo)下可以分化成γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元。
文檔編號(hào)A61P25/00GK101353646SQ20081010190
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日
發(fā)明者張海燕, 徐群淵, 王一松, 趙詠梅, 趙春禮 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所