亞全能干細胞專用培養(yǎng)基及其專用培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種亞全能干細胞培養(yǎng)。
【背景技術(shù)】
[0002]干細胞是一類具有自我更新能力且在適合微環(huán)境下具有多系分化潛能的原始細胞。根據(jù)個體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細胞可分為胚胎干細胞、新生兒干細胞和成體干細胞，按照干細胞分化潛能的不同，可以分為全能干細胞、亞全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。目前，已有利用干細胞治療心肌梗塞、紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)損傷和肌肉萎縮等。
[0003]亞全能干細胞是指具有三胚層分化潛能的一類干細胞亞群，在特定環(huán)境下，理論上可以誘導分化為人體任何一種組織細胞，主要來源于人體中廣泛存在的間充質(zhì)組織，特別是骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等間充質(zhì)組織，由于臍帶和胎盤來源的亞全能干細胞具有更為原始和更為強大的增值能力，較強的分化能力，低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，其在臨床上的應用價值越來越受人們關(guān)注。
[0004]作為要應用于臨床細胞治療的細胞產(chǎn)品，應當具有如下特點:組織取材方便，來源廣泛，不受倫理限制；分離過程簡單，無外源污染引入；外來添加物少，過程可控性強，重復性好；可獲得足夠細胞，細胞活力好；培養(yǎng)周期短，成本低。目前亞全能干細胞的制備過程中，獲得的亞全能干細胞不穩(wěn)定，且需要多次傳代才可獲得足夠的干細胞，因此生長周期長。
[0005]現(xiàn)有培養(yǎng)基中含有血清等成分。
[0006]細胞凍存代數(shù)越早，細胞的增殖，活力，分化能力就越好，而現(xiàn)有技術(shù)(CN200810240040.8和CN103275926A)都需要至少擴增到兩代以上才能后得足夠的干細胞。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的提供一種亞全能干細胞專用培養(yǎng)基及其專用培養(yǎng)方法，使細胞經(jīng)過一次傳代就可以獲得足夠的干細胞用于儲存。并且不含血清方便使用。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，供一種亞全能干細胞專用培養(yǎng)基，包含95 %的DMEM/F12, 5 %血清替代物,5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亞油酸，10ng/ml堿性成纖維生長因子，2xl0-8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生長因子，10ng/ml表皮生長因子，50umol/L β -巰基乙醇,2mmol/L L-谷氨酰胺。
[0009]該培養(yǎng)基不含血清，培養(yǎng)效果好，只需培養(yǎng)一代即可達到所需要冷凍的數(shù)量。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種亞全能干細胞培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟:
[0011 ] 取亞全能干細胞混勻后，加入到血細胞計數(shù)板，倒置顯微鏡下計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞濃度。亞全能干細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加所述亞全能干細胞專用培養(yǎng)；
[0012]將培養(yǎng)瓶放于37°C，5%的C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后首次換液；
[0013]待細胞生長至80%?90%的匯合度，加入胰蛋白酶消化，加入亞全能干細胞專用培養(yǎng)基終止消化將脫落的細胞和亞全能干細胞專用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1200?1800rpm,離心6?8min,將細胞沉淀用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后以1?5X104/cm接種，進行一代培養(yǎng)得。該方法發(fā)培養(yǎng)效果好只需一代培養(yǎng)即可達到可觀數(shù)量。
[0014]在一些實施方式中，入胰蛋白酶消化步驟為:加入0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37°C消化1?3min。消化效果好。
[0015]在一些實施方式中，一代培養(yǎng)的亞全能干細胞可冷凍處理，所述冷凍處理的方法如下:血清替代物和二甲基亞砜按體積比9:1的比例緩慢混勻后配成凍存液，放于4°C預冷10?30min，同時將凍存管和不銹鋼凍存管架放于_20°C預冷；收集一代培養(yǎng)的亞全能干細胞，將預冷的凍存液加入大離心管內(nèi)重懸細胞，將細胞放入凍存管，加樣時凍存管放于預冷的凍存管架上，將凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序，降至_90°C，取出凍存管，放入液氮儲存箱長期保存。該方法保存效果好活力高。
[0016]在一些實施方式中，冷凍處理的亞全能干細胞進行復蘇，方法如下:將冷凍的干細胞37°水浴快速化凍，孵育時間為2-5min，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到含5%人血白蛋白的復合氨基酸生理鹽水中。該復蘇方法復蘇效果好恢復好。
【附圖說明】
[0017]圖1為24h后首次換液亞全能干細胞生長情況顯微照片；
[0018]圖2為細胞生長至80%?90%的匯合度時顯微照片；
[0019]圖3為第二天細胞生長情況顯微照片；
[0020]圖4為第三天細胞生長情況顯微照片；
[0021]圖5為冷凍復蘇后細胞生長情況顯微照片；
[0022]圖6為冷凍復蘇后貼壁，開始鋪展細胞生長情況顯微照片；
[0023]圖7為冷凍復蘇后第二天細胞生長情況顯微照片；
【具體實施方式】
[0024]下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下面對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0025]實驗所需器具儀器等均可通過商業(yè)途徑購得。
[0026]1.亞全能干細胞的培養(yǎng)
[0027]1.1將亞全能干細胞混勻后，取10ul加入到血細胞計數(shù)板，倒置顯微鏡下計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞濃度為0.5?IX 104/cm，接種于T75瓶內(nèi)，每瓶加亞全能干細胞專用培養(yǎng)基至15ml，亞全能干細胞專用培養(yǎng)基成分為:包含95%的DMEM/F12，5%血清替代物(市售本例用 KnockOut? Serum Replacement), 5mg/ml 人血白蛋白，5.5ug/ml 亞油酸，10ng/ml堿性成纖維生長因子，2x10 8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生長因子，10ng/ml表皮生長因子,50umol/LP -巰基乙醇,2mmol/LL-谷氨酰胺。亞全能干細胞專用培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，劑型為培養(yǎng)液形態(tài)，。
[0028]1.2將培養(yǎng)瓶放于37°C，5%的C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后首次換液(圖1)可見生長狀況良好。
[0029]1.3每天觀察細胞生長情況，待細胞生長至80%?90%的匯合度(圖2)，加入10ml濃度為0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37 °C消化1?3min，加入適量亞全能干細胞專用培養(yǎng)基終止消化，將脫落的細胞和亞全能干細胞專用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1200?1800rpm，離心6?8min，將細胞沉淀用本發(fā)明無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后以1?5X104/cm接種，第二天細胞可達到50%左右匯合度(圖3)，第三天基本可以達到80%以上匯合度(圖4)。可見融合速度快效率高且形態(tài)良好。
[0030]2 凍存
[0031 ] 將血清替代物和二甲基亞砜(DMS0)按體積比9:1的比例緩慢混勻后配成凍存液，放于4°C預冷10?30min，同時將凍存管和不銹鋼凍存管架放于_20度預冷；收集P1代干細胞，將預冷的凍存液(4?7X106個干細胞/ml)加入大離心管內(nèi)重懸細胞，將細胞放入凍存管，加樣時凍存管放于預冷的凍存管架上，將凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序第一步4°C等待，第二步1.0°C /min降至_4°C，第三步25.0°C /min降至_40°C，第四步
10.0°C /min 降至 _12°C,第五步 1.0°C /min 降至-40°C,第六步 10.0°C /min 降至 _90°C,取出凍存管，放入液氮儲存箱長期保存。
[0032]3 復蘇
[0033]將干細胞37°C水浴快速化凍，孵育時間為2_5min，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到含5%人血白蛋白的復合氨基酸生理鹽水中，1200-1500rpm,離心6_8min，棄上清后，用培養(yǎng)基重懸細胞后，計細胞活力，細胞存活率高于80%，如圖5，接種培養(yǎng)，30min貼壁，開始鋪展(圖6)，2天后細胞可達到85%的匯合度(圖7)?？梢姳痉椒ū４婧髲吞K效果好。
[0034]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選方式，應當指出，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干相似的變形和改進，這些也應視為本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.亞全能干細胞專用培養(yǎng)基，其特征在于，包含95%的DMEM/F12，5 %血清替代物，5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亞油酸，10ng/ml堿性成纖維生長因子，2xl0_8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生長因子，10ng/ml表皮生長因子,50umol/L β -巰基乙醇,2mmol/LL-谷氨酰胺ο2.亞全能干細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: 取亞全能干細胞混勻后，加入到血細胞計數(shù)板，倒置顯微鏡下計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞濃度，亞全能干細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶加所述亞全能干細胞專用培養(yǎng)； 將培養(yǎng)瓶放于37°C，5%的C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后首次換液； 待細胞生長至80%?90%的匯合度，加入胰蛋白酶消化，加入所述亞全能干細胞專用培養(yǎng)基終止消化，將脫落的細胞和亞全能干細胞專用培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1200?1800rpm,離心6?8min,將細胞沉淀用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后以1?5X104/cm接種，進行一代培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述亞全能干細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述加入胰蛋白酶消化步驟為:加入0.05%?0.125%的胰蛋白酶，37°C消化1?3min。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述亞全能干細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述一代培養(yǎng)的亞全能干細胞可冷凍處理，所述冷凍處理的方法如下:血清替代物和二甲基亞砜按體積比9:1的比例緩慢混勻后配成凍存液，放于4°C預冷10?30min，同時將凍存管和不銹鋼凍存管架放于-20°C預冷；收集一代培養(yǎng)的亞全能干細胞，將預冷的凍存液加入大離心管內(nèi)重懸細胞，將細胞放入凍存管，加樣時凍存管放于預冷的凍存管架上，將凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序，降至_90°C，取出凍存管，放入液氮儲存箱長期保存。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述亞全能干細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述冷凍處理的亞全能干細胞進行復蘇，方法如下:將冷凍的干細胞37°水浴快速化凍，孵育時間為2-5min，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到含5 %人血白蛋白的復合氨基酸生理鹽水中。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種亞全能干細胞專用培養(yǎng)基及其專用培養(yǎng)方法，使細胞經(jīng)過一次傳代就可以獲得足夠的干細胞用于儲存。并且不含血清方便使用。亞全能干細胞專用培養(yǎng)基，包含95％的DMEM/F12，5％血清替代物，5mg/ml人血白蛋白，5.5ug/ml亞油酸，10ng/ml堿性成纖維生長因子，2x10-8mol/ml地塞米松，10ng/ml人血小板源生長因子，10ng/ml表皮生長因子，50umol/Lβ-巰基乙醇，2mmol/L？L-谷氨酰胺。該培養(yǎng)基不含血清，培養(yǎng)效果好，只需培養(yǎng)一代即可達到所需要冷凍的數(shù)量。
【IPC分類】C12N5/0775, A01N1/02
【公開號】CN105441387
【申請?zhí)枴緾N201410446098
【發(fā)明人】王軍霞, 黃福來
【申請人】黃福來
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年9月3日