地將四細(xì)胞階段胚胎分離而來(lái)的單卵裂球成功解化為正常發(fā)育的胚 胎，能夠得到各細(xì)胞中基因修飾類型一致的胚胎并用此胚胎移植入受體動(dòng)物，從而可顯著 減少因受精卵細(xì)胞快速分裂而導(dǎo)致的各細(xì)胞中攜帶不同突變類型的嵌合性問(wèn)題，在建立基 因修飾動(dòng)物模型上將具有重大意義。
[0025] 本發(fā)明能夠可選地采用毛細(xì)管結(jié)合膜酶消化的方式實(shí)現(xiàn)將經(jīng)CRISPR/Cas9基因修 飾后的食蟹猴四細(xì)胞階段胚胎分離為四個(gè)單卵裂球。
[0026] 進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下將它們?cè)隗w外成功發(fā)育為桑權(quán)胚或者 囊胚。
[0027] 發(fā)明采用優(yōu)化的培養(yǎng)條件是有利的，并且從某種程度上來(lái)講是必要的。
[0028] 培養(yǎng)人工分離出來(lái)的單卵裂球細(xì)胞，與培養(yǎng)自然狀態(tài)下的細(xì)胞是有差異的。運(yùn)是 因?yàn)椋咛ヂ蚜亚蛑g通過(guò)細(xì)胞間連接是有相互物質(zhì)/信號(hào)傳遞的，分離出來(lái)的單卵裂球失 去了與其他卵裂球的相互作用，再獨(dú)立發(fā)育為完整胚胎比較困難。
[0029] 本發(fā)明尤其提供了一種適合培養(yǎng)運(yùn)種經(jīng)分離出來(lái)的單卵裂球細(xì)胞的培養(yǎng)基和培 養(yǎng)條件。
[0030] 本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基為：
[0031]
[0032]
[0033] 作為一種示例性實(shí)施例，本發(fā)明在傳統(tǒng)的皿CM9培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加葡萄 糖和維生素 C。
[0034] 作為一種特別優(yōu)選的方案，所添加的葡萄糖為右旋葡萄糖。
[00巧]可選地，葡萄糖和維生素 C在培養(yǎng)基中的含量分為:0.5~5mM，0.5~lOmM。
[0036] 優(yōu)選地，葡萄糖和維生素 C在培養(yǎng)基中的含量分為：1~4mM，l~9mM;更優(yōu)選1~ 3111]\1，1~8111]\1;更優(yōu)選1.5~2.5111]\1，3~6111]\1;最優(yōu)選1.5~2.5111]\1，4~6111]\1。
[0037] 右旋葡萄糖及維生素 C的添加可W很大地改善囊胚率。在特別優(yōu)選的方案中，兩者 分別添加至含量為1.5~2.5mM，4~6mM。
[0038] 通常來(lái)說(shuō)，在培養(yǎng)基中添加葡萄糖或維生素 C并非罕見(jiàn)，但通常來(lái)說(shuō)，共同添加運(yùn) 兩種物質(zhì)的培養(yǎng)基并不多見(jiàn)。并且，通常來(lái)說(shuō)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基已具有碳源的情況下，是否添 加葡萄糖或維生素 C并不會(huì)對(duì)培養(yǎng)結(jié)果造成重大影響。然而，在本發(fā)明中，由于所培養(yǎng)的分 離出來(lái)的單卵裂球失去了正常胚胎細(xì)胞與其他卵裂球的相互作用，失去了相互物質(zhì)/信號(hào) 傳遞，再獨(dú)立發(fā)育為完整胚胎比較困難。W食蟹猴胚胎為例，正常情況下，采用常規(guī)的肥CM9 培養(yǎng)基即可達(dá)到30 % W上接近40 %的囊胚率（如圖7對(duì)照組），但是，當(dāng)W常規(guī)皿CM9培養(yǎng)基 對(duì)分離后的單卵裂球進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，桑權(quán)胚比率及囊胚率卻均接近于〇(圖3)，也即是說(shuō)，采用 常規(guī)肥CM9培養(yǎng)基根本無(wú)法對(duì)食蟹猴胚胎分離出的單卵裂球進(jìn)行培養(yǎng)。
[0039] 而采用本發(fā)明改良后的培養(yǎng)基，則可W達(dá)到60% W上的桑權(quán)胚比率及30.33%的 囊胚率，達(dá)到接近常規(guī)培養(yǎng)正常胚胎細(xì)胞的相當(dāng)水平。葡萄糖及維生素 C的添加在運(yùn)里起到 了至關(guān)重要的作用，運(yùn)是發(fā)明人首次作出的具有突破性的發(fā)現(xiàn)。
[0040] 值得注意的是，更大量地添加右旋葡萄糖及維生素 C并沒(méi)有進(jìn)一步提高改良培養(yǎng) 基對(duì)食蟹猴正常胚胎細(xì)胞培養(yǎng)的囊胚率(圖7)，相反，當(dāng)添加量增加至3mM右旋葡萄糖及8mM 維生素別寸，正常胚胎細(xì)胞的囊胚率對(duì)比最優(yōu)的方案反而有所下降。
[0041 ]進(jìn)一步優(yōu)選的方案是控制合適的培養(yǎng)條件。
[0042] 培養(yǎng)氣體比例為74-90 %氮?dú)猓?-6 %二氧化碳，5-20 %氧氣，培養(yǎng)溫度為34~40攝 氏度，優(yōu)選37攝氏度。
[0043] 待運(yùn)些經(jīng)胚胎分割后的單卵裂球胚胎再次發(fā)育為四細(xì)胞或八細(xì)胞階段時(shí)，通過(guò)單 細(xì)胞PCR技術(shù)鑒定能夠精確地分析每個(gè)單卵裂球細(xì)胞中的基因突變或修飾類型與程度，發(fā) 現(xiàn)由同一胚胎分裂后再分化發(fā)育而來(lái)的四個(gè)細(xì)胞其基因修飾類型基本一致。本發(fā)明中的所 述方法能夠顯著增加各個(gè)細(xì)胞中基因修飾類型與程度的相同性，從而降低了因受精卵單細(xì) 胞分裂過(guò)程中產(chǎn)生的嵌合性。因此，利用本發(fā)明所述方法獲得的胚胎可用于移植，所獲得的 新生動(dòng)物的毎個(gè)體細(xì)胞中將攜帶有相同的基因突變類型，從而有利于高效建立更能模擬因 基因突變所導(dǎo)致疾病的動(dòng)物模型。
[0044] 本發(fā)明具有W下有益效果：
[004引1.基因修飾精準(zhǔn)度顯著增加(使用傳統(tǒng)方法獲得的純合動(dòng)物胚胎效率2.85%，本 發(fā)明的技術(shù)方案可將該效率提高至55.8 % );
[0046] 2.單卵裂球體外發(fā)育的改善（將體外發(fā)育至桑權(quán)胚和囊胚的效率分別提高至 63.67%和30.33%，運(yùn)是突破性的，此前未見(jiàn)有報(bào)道可W將靈長(zhǎng)類動(dòng)物的單卵裂球培養(yǎng)為 囊胚）。
【附圖說(shuō)明】
[0047] 圖1為食蟹猴4細(xì)胞胚胎單卵裂球體外再培養(yǎng)流程圖。
[0048] 圖2為食蟹猴4細(xì)胞胚胎單卵裂球體外再培養(yǎng)結(jié)果，4分裂單卵裂球體外培養(yǎng)發(fā)育 到囊胚并解化。
[0049] 圖3為本發(fā)明改良培養(yǎng)基對(duì)食蟹猴單卵裂球細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果，優(yōu)化后的培養(yǎng)基能 將63.67%的單卵裂球培養(yǎng)到致密化(桑權(quán)胚比率），而且30.33%的單卵裂球能發(fā)育到囊胚 階段。
[0050] 圖4為胚胎發(fā)育統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0051] 圖5為PCR及酶切鑒定單卵裂球重組胚胎基因打祀的相同性;其中
[0052] (A)從正常4-8細(xì)胞胚胎分裂出的單細(xì)胞打祀鑒定結(jié)果，打祀位點(diǎn)為pinkl基因第2 外顯子；
[0053] (B)由正常4細(xì)胞胚胎經(jīng)單卵裂球分離再培養(yǎng)發(fā)育成新4細(xì)胞后分離的單細(xì)胞打祀 鑒定結(jié)果，打祀位點(diǎn)為pinkl基因第2外顯子;化yl88I酶切鑒定打祀基因突變類型；
[0054] (C)PCR與化yl88I酶切鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，正常4-8細(xì)胞胚胎和再培養(yǎng)發(fā)育的新4 細(xì)胞胚胎的基因修飾相同性差異極為顯著（**沖<0.001)。31個(gè)正常4-8細(xì)胞胚胎中，只有1 個(gè)胚胎的4個(gè)單卵裂球打祀結(jié)果相同，雙鏈突變或純合突變（Homo-mutation)概率為 2.85%，且多為單鏈突變;而由13個(gè)正常胚胎分離得到的37個(gè)重組胚胎中，PCR及酶切鑒定 得到18個(gè)胚胎的單卵裂球打祀相同，純合突變概率高達(dá)55.8%，是正常胚胎的19.57倍；
[0055] 注:雙鏈突變標(biāo)記為黑色箭頭，雜合(單鏈)突變標(biāo)記為灰色箭頭。
[0056] 圖6為實(shí)驗(yàn)流程總圖選取單籠飼養(yǎng)、年齡、體重、生理周期合適的供體猴子進(jìn)行激 素注射超數(shù)排卵，取得的MII時(shí)期的成熟卵通過(guò)單精注射進(jìn)行受精，受精后注射化s9/gRNA 對(duì)基因進(jìn)行修飾，待體外培養(yǎng)發(fā)育到4細(xì)胞階段時(shí)，通過(guò)自制毛細(xì)玻璃管結(jié)合膜酶將4細(xì)胞 胚胎分離成單個(gè)的卵裂球細(xì)胞，然后放入空的透明帶中繼續(xù)發(fā)育，發(fā)育到新的4細(xì)胞階段， 部分新4細(xì)胞胚胎通過(guò)在分離進(jìn)行單細(xì)胞PCR鑒定是否為純合打祀，部分移植到合適受體 中，懷孕經(jīng)過(guò)165妊娠期，W期望能生出純合基因修飾猴模型動(dòng)物。
[0057] 圖7為不同培養(yǎng)基條件下的（未分離卵裂球的胚胎)囊胚率。*表示與對(duì)照組對(duì)比具 有顯著差異(t-檢驗(yàn)）；**表示與對(duì)照組對(duì)比具有極顯著差異。
【具體實(shí)施方式】
[0058] W下對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不局限于W下的實(shí)施例介紹， 凡依照本發(fā)明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應(yīng)視為本發(fā)明保護(hù)的范疇。
[0059] 實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因過(guò)程
[0060] 構(gòu)建含有PINK1基因和ASPM基因祀序列的CRISPR/化s9的sgRNA載體。所述的sgRNA 表達(dá)載體，含有一個(gè)T7啟動(dòng)子控制sgRNA的表達(dá)，在用Bbsl限制酶切消化后可插入20bp sgRNA的特異祀序列，該特異祀序列的識(shí)別位點(diǎn)位于PINK1基因第二外顯子，ASPM基因第Ξ 外顯子和第十外顯子。為了篩選能夠進(jìn)行基因編輯且脫祀效應(yīng)較小的PINK1和ASPM基因的 SgRNA序列，申請(qǐng)人利用NCBI的Blast軟件在雜猴的PINK1基因和食蟹猴的ASPM基因序列上 分別篩選了脫祀效應(yīng)低且符合CRISPR/Cas9結(jié)合基因組特征(5'-Gα9N)-NGG3'）或者(5'-CCN( 19N)-C-3 '）的祀序列位點(diǎn)，如表1。
[0061 ] a.化學(xué)合成寡核巧酸鏈，合成帶粘末端的祀點(diǎn)：
[0062] 合成時(shí)，正義鏈:5 ' -CACC-G N19(含第一個(gè)G)-3 '（N代表任意的DNA堿基，如ATCG。 N19代表任意的19個(gè)DNA堿基序列）
[006引反義鏈：5'-AAAC-G N19(含第一個(gè)G，反向互補(bǔ)）-3'（N代表任意的DNA堿基，如 ATCG。N19代表任意的19個(gè)DNA堿基序列）
[0064] b.正義鏈、反義鏈退火，形成帶抓si粘性末端的片段，退火體系：
[0065] Oligol lOul(lOum)
[0066] 〇lig〇2 lOul(lOum)
[0067] 肥B buffers Sul
[0068] 去離子肥0 25ul
[0069] 總體積 50ul
[0070] 退火程序:98度，lOmin，自然冷卻至室溫，連接
[0071] C.將W上退火片段連接至由抓si酶切后的T7-sgRNA載體
[0072] d.轉(zhuǎn)化，挑選克隆per鑒定，測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定結(jié)果。
[007引e .將上述所構(gòu)建的S排NA祀序列載體按照參考文獻(xiàn)方法，體外轉(zhuǎn)錄合成RNA。同時(shí) 將化s9質(zhì)粒載體用化el酶線性化后膠回收，體