專利名稱:用于提高體細(xì)胞胚胎發(fā)生的改良方法和培養(yǎng)基的制作方法
本發(fā)明是1983年5月19日遞交的496186號(hào)申請(qǐng)的后續(xù)部分。
一般地說(shuō)，本發(fā)明涉及胚胎植物細(xì)胞和組織的培養(yǎng)，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及特別適于維持由離體誘導(dǎo)體細(xì)胞組織產(chǎn)生之胚胎的改良培養(yǎng)基以及使用該培養(yǎng)基的方法。
人們知道，遺傳工程的最新進(jìn)展使得植物育種者能夠避免傳統(tǒng)育種技術(shù)中固有的作物改良中的耗時(shí)太長(zhǎng)的問(wèn)題。然而，因?yàn)閱渭?xì)胞和多細(xì)胞生物需要以不同的方法去改變?nèi)窟z傳信息，所以，應(yīng)用這些技術(shù)仍有困難。對(duì)于微生物，一種嘗試就是在細(xì)胞水平上去影響改變，并有把握通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞傳代使之?dāng)U增。
對(duì)于多細(xì)胞生物來(lái)說(shuō)，如植物，在細(xì)胞水平上進(jìn)行遺傳操作是較為有利的，然后使之再生并培養(yǎng)成表達(dá)新特性的成熟植物?？赏ㄟ^(guò)質(zhì)粒插入以提供特異改變，或通過(guò)原生質(zhì)體融合以進(jìn)行大批的遺傳操作，將外來(lái)遺傳物質(zhì)摻入宿主細(xì)胞內(nèi)。使用傳統(tǒng)的植物育種技術(shù)，用成熟植物作進(jìn)一步的遺傳操作可向具有農(nóng)業(yè)意義的品種摻入新的特性?！睞llard，R.W.，Principles of Plant Breeding，John Wiley and Sons，New York，1960;Simmons，N.W.，Principles of Crop Lmprovement，Langman Group.Ltd.London，1972〕。
離體培養(yǎng)植物細(xì)胞和組織，須將培養(yǎng)物保持在培養(yǎng)基內(nèi)，由培養(yǎng)基提供營(yíng)養(yǎng)并維持存活力。常用組織培養(yǎng)基的例子已有過(guò)文獻(xiàn)評(píng)述〔見(jiàn)Huang，L.和T.Murashige，“Plant Tissue Culture Media;Major Constituents，their Preparation，and Some applications”，Tissue Culture Association Manual 3∶539～548，Tissue Culture Association，Rockville，M.D.，1977及de Fossard，R.A.，Tissue Culture for Plant Propagators，University of New England Printery，Armidale，N.S.W.，Australia，1976〕。這種培養(yǎng)物維持性能可在植物器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中得到促進(jìn)。
在體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)中，一般是誘導(dǎo)植物體細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上產(chǎn)生反復(fù)的細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無(wú)定形細(xì)胞團(tuán)塊，即所謂的愈傷組織。此愈傷組織可經(jīng)過(guò)再次培養(yǎng)以達(dá)到大量增殖。也可誘導(dǎo)愈傷組織分化，以產(chǎn)生成熟植物的分化的組織和器官。還可在培養(yǎng)物中由其它的已有胚胎形成體細(xì)胞胚胎。親代胚胎可以是包括未成熟的球狀階段至成熟的、發(fā)芽胚胎〔見(jiàn)Lupotto，E，“Propagation of an embryonic Culture of Medicago Sativa L.”，Zeit，Pflanzenphysiol.11195-104，1983〕。因此，體細(xì)胞胚胎可由未分化的愈傷組織或植物組織培養(yǎng)物中已有的胚胎產(chǎn)生。
以這種方法，可在細(xì)胞或胚胎水平上影響遺傳政變，然后通過(guò)繼后的發(fā)育保留之，以產(chǎn)生具有同一遺傳特征的整體作物。這就使得植物育種者能繞過(guò)植物繁殖中的正常遺傳屏障，并獲得更為均一和有利的農(nóng)田作物。
使用當(dāng)前的技術(shù)，有可能利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法由一克細(xì)胞產(chǎn)生出數(shù)千株植物?！睧vans，D.A.，W.R.Sharp，and C.E.Flick，“Growth and behavior of cell Culturesembryo genesis and Organogenesis”，in Plant Tissue Culture-1981，T.A.Thorpe ed.，Academic Press，45-113，1981〕。這些胚胎可以發(fā)芽并轉(zhuǎn)移到溫室或農(nóng)田內(nèi)，并發(fā)育成成熟植物。植物育種者可使用這些植物回收有用的遺傳變異，或?yàn)橹参镉N程序通過(guò)克隆法增殖品種。
某些測(cè)定通過(guò)植物體細(xì)胞部分培養(yǎng)所得胚胎組織的質(zhì)量和數(shù)量的技術(shù)是已知的?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定與胚胎的發(fā)育階段有關(guān)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)率，來(lái)檢測(cè)體細(xì)胞胚胎的數(shù)量〔見(jiàn)Fujimura，T.，和A.Komamine，“Synchronization of Somatic embryogenesis in a Carrot Cell Suspension Culture”，Plant Physiology，64162-164，1979;Verma，D.C.和D.K.Dougall，“Influence of Carbohydrates on quantitative aspects of Growth and embryo Formation in Wild Carrot Suspension Cultures”，Plant Physiology，5981-85，1977〕。這一測(cè)定一般是使用解剖顯微鏡對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)數(shù)而完成的。
可用多種方法來(lái)估計(jì)體細(xì)胞胚胎的質(zhì)量。典型的是用目測(cè)觀察球形期、魚(yú)雷期和小植株期來(lái)確定胚胎發(fā)育?！睞mmirato，P.V.“The effects of abscisic acid on the development of Somatic embryos from Cells ofCaraway(Carum Carri L.)”，Botanical Gazette，135328-337，1974〕。也可根據(jù)得自單個(gè)體細(xì)胞胚胎的小植株的產(chǎn)率確定胚胎發(fā)育或質(zhì)量?！睤rew，R.L.W.，“The development of Carrot(Daucus Carota L.)embryoids(derived from Cell Suspension Culture)into Plantlets on a Sugar-free basal medium”，Horticultural Research 1979，1979〕。盡管小植株形成的測(cè)定對(duì)于確定適于農(nóng)田使用的胚胎的產(chǎn)率很為重要，但人們很難檢測(cè)到小植株的形成。
改善胚胎數(shù)量或產(chǎn)率的技術(shù)已有過(guò)描述。例如，已知體細(xì)胞胚胎的形成需要在培養(yǎng)基中有一種銨源，這樣才能有胚胎發(fā)生。〔Halperin，W.和D.F.Wetherell，“Ammonium requirement for embryogenesis in vitro”，Nature 205∶519-520，1965;Walker，K.A.，S.J.Sato，“Morphogenesis in Callus tissue of Medicago Sativathe role of ammonium ion in Somatic embryogenesis”，Plant Cell Tissue Organ Culture 1109-121，1981〕。因?yàn)榇蠖鄶?shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)基均含有一定量的銨，故認(rèn)為將銨濃度調(diào)整至一個(gè)有高胚胎產(chǎn)率和質(zhì)量的適當(dāng)水平是很重要的?！惨?jiàn)Walker和Sato的上述文獻(xiàn)，以及Wetherell，D.F.和D.K.Dougall，“Sources of nitrogen Supporting growth and embryogenesis inCultured Wild Carrot tissue”，Physiologia Plantarum 3797-103，1976〕。
在植物細(xì)胞培養(yǎng)物和成熟的植物中，銨和谷氨酰胺或谷氨酸可迅速地被細(xì)胞互相轉(zhuǎn)化?！惨?jiàn)Ojima，K和K.Ohira，“Nutritional requirements of callus and Cell Suspension Cultures”，自Frontiers of Plant Tissue Culture-1978，T.A.Thorpe ed.，University of Calgary Offset Printing Services，265-275，1978;Miflin，B.J.和P.L.Lea，“Ammonium assimilation”，自The Biochemistry of Plants，P.Stumpf和E.Conned.，Academic Press，Vol.6，169-201，1980，Dougall，D.K.，“Current Problems in the regulation of nitrogen metabolism in Plant Cell Cultures”，自Plant Tissue Culture and its Biotechnological Application，W.Barz，E.Reinhard和M.H.Zenk eds.，Springer-Verlag，Berlin，76-81，1977〕。
所設(shè)想的銨在植物代謝中與谷氨酰胺和谷氨酸的接近，是從氨基酸對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生之影響的系統(tǒng)研究方案中反映出來(lái)的。研究是使用已從植物細(xì)胞培養(yǎng)基中除去了銨的胡蘿卜細(xì)胞進(jìn)行的，并試驗(yàn)單一氨基酸對(duì)細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響?！惨?jiàn)Wetherell和Dougall的前述文章;Kamada，H.和H.Harada，“Studies on the Organogenesis in Carrot tissue Cultures Ⅱ.Effects of amino acids and inorganic nitrogenous Compounds on Somatic embryogenesis”，Zeit.Pflanzenphysiologie 91453-463，1979〕。Wetherell和Dougall發(fā)現(xiàn)，與加銨離子比較，加氨基酸并不能改善胚胎發(fā)生。另一方面，Kamada和Harada則發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有銨或沒(méi)有銨及硝酸鹽的情況下，丙氨酸和谷氨酰胺很好地起到為胚胎發(fā)生提供還原氮源的作用。一份報(bào)告認(rèn)為，加入的氨基酸濃度為20mM或更高時(shí)是不利的?！惨?jiàn)Reinert，J.和M.Tazawa，“Wirkung von Stickstoffverbindungen und von Auxin auf die Embryogenese in Gewebekulturen”，Planta，87239，1969〕(原文為德文)。
上述研究表明，在還原氮源，如銨和氨基酸之間存在著一種等價(jià)關(guān)系?！瞁etherell和Dougall，上述文章;Kamara和Harada，上述文章〕。TaZaWa，M，和Reinert，J.的研究進(jìn)一步顯示了銨和氨基酸間的代謝等價(jià)關(guān)系〔Tazawa，M.和Reinert，J.，“Extracellular and intracellular Chemical environments in relation to embryogenesis in vitro”，Protoplasma 69157-173，1969〕。在一項(xiàng)進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生的胡蘿卜培養(yǎng)物中固有銨水平的研究中，發(fā)現(xiàn)不管培養(yǎng)物中是否加銨、氨基酸或硝酸鹽，培養(yǎng)物中銨的水平總是與胚胎發(fā)生的量相互關(guān)聯(lián)的。結(jié)論是NH+4的固有水平為刺激體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因子。NH+4的內(nèi)在水平得自外界提供的NH+4或氨基酸，或者是經(jīng)生物學(xué)還原硝酸鹽得到的NH+4。內(nèi)在的NH+4可被轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮化合物，以提供正常細(xì)胞所需要的氨基酸〔見(jiàn)Tazawa和Reinert的上述文獻(xiàn))。因此確信氨基酸是通過(guò)釋放銨起作用的，用于刺激胚胎發(fā)生。
已知道的可改善胚胎發(fā)育的因子有脫落酸、玉米素、赤霉素、高濃度蔗糖和光?！惨?jiàn)Ammirato，P.V.和F.C.Steward，“Some effects of environment on the development of embryos from Cultured free Cells”，Botanical Gazette，132149-158，1971;Ammirato，P.V.，“Hormonal Control of Somatic embryo development from Cultured Cells of Caraway，Interactions of abscisicacid，Zeatin and gibberellic acid”，Plant Physiology 59579-586，1977〕。銨和氨基酸對(duì)胚胎質(zhì)量的影響尚不清楚?！睞mmirato，P.V.，“The regulation of Somatic embryo development in Plant Cell CulturesSuspension Culture techniques and honmone requirements”，Bio/Technology 168-74，1983〕。
另外，轉(zhuǎn)化頻率-作為胚胎質(zhì)量的一種檢定-迄今為止尚不明瞭，并未用于系統(tǒng)地改善胚胎發(fā)育。已通過(guò)觀察胚胎形態(tài)來(lái)檢定胚胎的成熟情況，但這種方法并不能檢知單個(gè)胚胎形成植物的頻率。
為此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供增加由植物組織產(chǎn)生之體細(xì)胞胚胎的數(shù)量和質(zhì)量的方法及材料。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是為體細(xì)胞胚胎發(fā)生提供最適宜的還原氮源。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生大量增殖多種植物的方法和材料。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供產(chǎn)生具有同一遺傳和表型特征的大量可存活體細(xì)胞胚胎的方法和材料。
本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點(diǎn)和特征將從以下的描述和相應(yīng)實(shí)施例中看出。
本發(fā)明提供了通過(guò)加入最適量的氨基酸和還原氮源，由植物組織產(chǎn)生大量高質(zhì)量體細(xì)胞胚胎的新的和改良的方法及材料。本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種植物細(xì)胞培養(yǎng)基，它包含一種具有銨離子源的基質(zhì)，還加有至少一種選自脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、鳥(niǎo)氨酸、谷氨酸及其酰胺、烷基酯及其二肽衍生物的氨基酸，所加數(shù)量與培養(yǎng)基中不加上述物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的胚胎相比，足夠增加所產(chǎn)生之體細(xì)胞胚胎的數(shù)目和質(zhì)量。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種基本上沒(méi)有銨離子的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，但其中包括以足夠數(shù)量加入的至少一種選自脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸及其酰胺、烷基酯及其二肽衍生物的氨基酸，與培養(yǎng)基中不加上述物質(zhì)的情況比較，可顯著提高所產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。
另外，本發(fā)明還提供了使用該培養(yǎng)基的方法。
單張附圖是圖解表示作為向培養(yǎng)基內(nèi)所加氨基酸濃度的函數(shù)，所產(chǎn)生之體細(xì)胞胚胎數(shù)目的增加。
本發(fā)明提供增加由植物體組織產(chǎn)生的胚胎的數(shù)量和質(zhì)量的方法，這些方法提供了一種培養(yǎng)所述細(xì)胞和組織的培養(yǎng)基，它含有足夠數(shù)量的經(jīng)選擇的氨基酸，以刺激體細(xì)胞的胚胎發(fā)生。
本發(fā)明還通過(guò)提供一種含有足夠數(shù)量經(jīng)選擇的氨基酸并加有銨離子源的培養(yǎng)這類細(xì)胞和組織的培養(yǎng)基，以刺激體細(xì)胞胚胎的數(shù)量和質(zhì)量的提高。同時(shí)提供了一種使用這種植物組織培養(yǎng)基的方法。
雖然前面已確信氨基酸可作為所需要的銨培養(yǎng)基成分的簡(jiǎn)單等價(jià)物，但令人驚異地發(fā)現(xiàn)氨基酸以銨的相同濃度使用時(shí)，可作為提高體細(xì)胞胚胎生成的銨離子的替代物。還驚異地發(fā)現(xiàn)經(jīng)選擇的氨基酸連同加入的銨離子源可提供顯著增加的益處，而這一點(diǎn)并不能簡(jiǎn)單地從增加銨離子濃度的添加效應(yīng)預(yù)測(cè)到。
已找到了一種含有選自脯氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、鳥(niǎo)氨酸及這些氨基酸的酰胺、烷基酯及這些氨基酸的二肽衍生物的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基基本上沒(méi)有銨離子，可用于提高從體細(xì)胞組織培養(yǎng)物得到的體細(xì)胞胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。
還發(fā)現(xiàn)一種含有銨離子和選自脯氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、鳥(niǎo)氨酸、谷氨酸和這些氨基酸的酰胺、烷基酯及這些氨基酸的二肽衍生物的培養(yǎng)基，所加入物質(zhì)的數(shù)量足以刺激胚胎發(fā)生或細(xì)胞轉(zhuǎn)化，此培養(yǎng)基可產(chǎn)生相似的胚胎增益效應(yīng)。
已令人驚異地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的培養(yǎng)基可增加從愈傷組織得到的體細(xì)胞胚胎的產(chǎn)率，優(yōu)于此前用于誘導(dǎo)、再生和維持胚胎組織的典型培養(yǎng)基。在這些胚胎發(fā)生過(guò)程的每個(gè)階段，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基能比使用以前提供的培養(yǎng)基獲得大得多的胚胎組織產(chǎn)率。此外，在各種有用植物品種-包括苜蓿、芹菜、棉花、玉米和水稻的應(yīng)用實(shí)踐中，證明本發(fā)明的培養(yǎng)基具有多方面的優(yōu)點(diǎn)。
可通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐加以改良的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，包括如Huang，L.和T.Murashige評(píng)述過(guò)的以前已知的植物組織培養(yǎng)基(前述文獻(xiàn)和Cloning agriculfural Plants Viain Vitro techniques，B.V.Conger ed.，CRC Press，172，其公開(kāi)的內(nèi)容和配方均列為本文參考文獻(xiàn))。一般說(shuō)來(lái)，植物培養(yǎng)基提供植物營(yíng)養(yǎng)、能源(如糖)、植物激素和用于控制水溶液PH和滲透平衡的緩沖鹽類。
這類植物細(xì)胞培養(yǎng)基中有代表性的是所謂Schenk和Hildebrandt(SH)培養(yǎng)基(見(jiàn)Schenk，R.U.和A.C.Hildebrandt，“Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous Plant Cell Cultures”，Can.J.Bot.50∶199，1972;其所公開(kāi)的內(nèi)容和配方均列文本文參考文獻(xiàn))。下文所述的無(wú)激素SH培養(yǎng)基即該文所公開(kāi)的包含主要鹽類、維生素和蔗糖，但沒(méi)有2，4-D，pCPA和激動(dòng)素的培養(yǎng)基。
另有所謂的Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基可用以代替SH培養(yǎng)基(見(jiàn)Murashige，T.和F.Skoog，“Arevised medium for rapid growth and bioassays With Tobacco tissue Culture”，Physiologia Planta，15473-497，1962;文中所公開(kāi)的內(nèi)容和配方均列為本文參考文獻(xiàn))。下文所述的無(wú)激素MS培養(yǎng)基即該文所公開(kāi)的包含主要鹽類、維生素和蔗糖，但不含吲哚-3-乙酸和激動(dòng)素的培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的實(shí)踐中，對(duì)所用基本植物細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇，部分是由所選用的植物體細(xì)胞組織的種屬?zèng)Q定的，並認(rèn)為這是在植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)和體胚胎發(fā)生實(shí)踐中一個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的普通技術(shù)人員所熟知的。
大量重要作物和園藝品種都表明可通過(guò)組織培養(yǎng)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生使之增殖。這些品種包括但不僅限于以下表1蔬菜作物 水果和堅(jiān)果樹(shù)苜蓿 巴旦杏蘆筍 蘋(píng)果甜菜 香蕉湯菜 咖啡胡蘿卜 海棗花椰菜 葡萄油茄子 檸檬洋蔥 橄欖菠菜 桔子白薯 桃番茄 球莖水果和漿果 百合黑莓 黃花菜葡萄 復(fù)活節(jié)百合菠蘿 風(fēng)信子草莓 花營(yíng)養(yǎng)葉 非洲紫羅蘭Silver Vase 花燭屬秋海棠 菊屬
Crytanthus 扶郎花屬花葉萬(wàn)年青屬 大巖桐屬龍血樹(shù)屬 矮牽牛屬eiddleleaf 玫瑰Pointsettia 蘭科植物Weeping fig 藥用植物橡膠植物 癲茄屬蕨類植物 人參澳大利亞灰白水龍骨 除蟲(chóng)菊屬波士頓蕨 造林植物(林業(yè))掌葉鐵線蕨 黃杉屬rabbitsfoot fern 松樹(shù)石松 顫楊刀形蕨 紅杉谷類 橡膠樹(shù)大麥玉米小米狼尾草屬小麥更為詳盡的能進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生的植物品種可參見(jiàn)Evans，D.A.等人“Growth and Behavior of Cell CulturesEmbryogenesis and Organogenesis”，自Plant Tissue CultureMethods and
Applications in Agriculture，Thorpe編，Academic Press出版，45頁(yè)(1981);其相關(guān)部分列為本文參考文獻(xiàn)。
許多氨基酸就是已有技術(shù)中已知的，它們中除了個(gè)別以外都具有一個(gè)共同特點(diǎn)，即有一個(gè)游離羧基和在α-碳原子上有一個(gè)未被取代的氨基。脯氨酸是一個(gè)很顯著的例外，因?yàn)楦彼岬摩?氨基被取代，所以它實(shí)際上是α-亞氨基酸。
氨基酸一般可分為蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)氨基酸，其中蛋白質(zhì)氨基酸包括20種最常見(jiàn)的氨基酸。這些氨基酸又包括四個(gè)亞組具有非極性或疏水取代基的，包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸;具有不帶電極性R基因的氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸及可能還有甘氨酸;具有帶負(fù)電荷R基因的氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸;以及其有帶正電荷R基因的氨基酸，包括精氨酸、賴氨酸及可能還有組氨酸。
除了20種常見(jiàn)氨基酸外，還有許多其它在蛋白質(zhì)中很少出現(xiàn)或完全沒(méi)有的氨基酸。羥賴氨酸和羥脯氨酸很少見(jiàn)，並僅存于纖維蛋白中。另外，已知有150種以上的其它氨基酸以游離或結(jié)合的形式存在于不同細(xì)胞和組織中，其中包括最常見(jiàn)的瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸，以及許多β、γ和△形式的常見(jiàn)氨基酸。
除了以上討論的基本氨基酸結(jié)構(gòu)外，還可以多種方式修飾氨基酸而不改變它在本發(fā)明中所具有的功能。這些修飾方法包括分別加入氨基和羧基，形成氨基酸酰胺和氨基酸烷基酯。此外，可通過(guò)α-羧基和α-氨基聯(lián)接兩個(gè)氨基酸形成氨基酸的二肽衍生物。很容易理解到，每一對(duì)氨基酸都具有兩種可能的二肽衍生物。
對(duì)于本發(fā)明也很重要的是，為本發(fā)明之含氨基酸的培養(yǎng)基補(bǔ)充銨離子(NH+4)源。銨離子源也是植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域中已知的。這樣的銨離子通常是通過(guò)在培養(yǎng)基內(nèi)加入一定數(shù)量的非毒性銨鹽提供的，它與平衡銨離子電荷的陰離子形成如氯化銨、磷酸銨或硫酸銨等。Walker，K.A.和S.J.Sato在“Plant Cell Tissue Organ Culture”(1109-121，1981)一文(該文有關(guān)部分被列為本文參考文獻(xiàn))中介紹了其它一些銨離子源。
提供下列實(shí)施旨在進(jìn)一步闡明本發(fā)明的各個(gè)方面。這些實(shí)施例並不是對(duì)本發(fā)明范圍的限定，即並不限定本申請(qǐng)待批準(zhǔn)的權(quán)利要求
。
一般說(shuō)來(lái)，用植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)物產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法是已知的，只須稍加改變即可適用于選定的植物品種。(例如見(jiàn)Plant Tissue CultureMethods and Applications in Agriculture，Thorpe編，(1981);該文相關(guān)部分列為本文參考文獻(xiàn))。
例如苜蓿，在Saunclers和Bingham的Regen S品系中可通過(guò)常規(guī)方法誘導(dǎo)胚胎發(fā)生(見(jiàn)“Production of Altalfa Plants from Callus Tissue”，Crop Sci.，12804-808，1972)。
利用紫花苜蓿(Medicago Sativa)的栽培品種Regens，它是從Vernal和Saranac品種雜交的第二周期重復(fù)選擇中得到的。愈傷組織的產(chǎn)生按下述方法進(jìn)行;用50%CloroxR對(duì)葉柄表面滅菌5分鐘，用水洗滌並涂布于無(wú)激素的SH培養(yǎng)平板上，該培養(yǎng)基含有Schenk-Hildebrandt培養(yǎng)基(Schenk，R.U.和A.C.Hildebrandt，文獻(xiàn)同上，(1972))所含的鹽類，維生素及蔗糖。該培養(yǎng)基含有25μMα-亞萘基乙酸、10μM激動(dòng)素和0.8%(W/V)瓊脂(稱為維持培養(yǎng)基)。從仍未愈傷化的植物離體組織上分離出在上面形成的愈傷組織，並在維持培養(yǎng)基上反復(fù)培養(yǎng)。愈傷組織以3周間隔培養(yǎng)，並使之于27℃在間接光照下生長(zhǎng)。
于再培養(yǎng)后17-24天，從維持培養(yǎng)基的平板上收集3-9克愈傷組織，並轉(zhuǎn)移至含有50μM2，A-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和5μM激動(dòng)素(B)的100ml SH溶液內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)。(見(jiàn)Walker，K.A.M.L.wendeln，和E.G.Jaworski，plant sci Lett.1623-30(1979)。將愈傷組織置于500ml搖瓶?jī)?nèi)于27℃下培養(yǎng)3天，培養(yǎng)是在間接光照下，在100K.P.M.的軌道震動(dòng)器上進(jìn)行的。
于輕度真空下，在系列柱篩(Fisher Scientific公司)和無(wú)菌條件下篩分被誘導(dǎo)的細(xì)胞。細(xì)胞塊通過(guò)不銹鋼篩沉落或被擠過(guò)35目(480μm)並被收集在60目(230μm)篩網(wǎng)上。用SH無(wú)激素培養(yǎng)液洗滌留在60目篩網(wǎng)上的細(xì)胞，每100ml誘導(dǎo)培養(yǎng)體積用500ml洗滌。真空除去洗滌培養(yǎng)液。稱量細(xì)胞塊的濕重並將細(xì)胞懸浮于無(wú)激素的SH培養(yǎng)基內(nèi)，每毫升懸浮150毫克濕重的細(xì)胞。將75mg(0.5ml)的懸浮細(xì)胞吸至60mm×15mm培養(yǎng)皿中的大約10ml瓊脂固體培養(yǎng)基上。
另外，如將300mg(2ml)再懸浮細(xì)胞移入裝在50ml錐形瓶?jī)?nèi)的8ml無(wú)激素的SH液體培養(yǎng)基中，在懸浮培養(yǎng)物中將出現(xiàn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。胚胎發(fā)生培養(yǎng)基含有SH培養(yǎng)基(NH+4等于2.6mM)，還含有3%(W/V)蔗糖，沒(méi)有激素。無(wú)銨離子培養(yǎng)基是以等量的NaH2PO4代替SH中的NH4H2PO+4制成的。25mM NH+4對(duì)照培養(yǎng)基由無(wú)銨培養(yǎng)基附加12.5mM(NH4)2SO4組成。通過(guò)0.2μm濾膜將所有有機(jī)和無(wú)機(jī)還原氮源除菌，然后加至新近高壓滅菌過(guò)的培養(yǎng)基內(nèi)。
每種處理一般用10個(gè)重復(fù)平板進(jìn)行培養(yǎng)。園盤(pán)用保護(hù)膜包裝並保溫21天。懸浮液瓶用塑料泡沫塞住并用Saran Wrap
封口，在100rpm的軌道震動(dòng)器上保溫14天。保溫于27℃12小時(shí)光照下進(jìn)行，光源為冷白熒光燈管，固體培養(yǎng)物與光源距離為28Cm，懸浮培養(yǎng)物距光源為200Cm。
保溫后，用放大10倍的立體顯微鏡計(jì)數(shù)愈傷組織上的綠色中心，以檢測(cè)胚胎發(fā)生。用放大10倍的標(biāo)定目測(cè)尺測(cè)量胚胎大小。用目測(cè)觀察以確定胚胎形狀。在初始培養(yǎng)的第21天將胚胎由氨基酸處理培養(yǎng)基在無(wú)菌條件下移入加有25μM赤霉酸和0.25μmα-亞萘基乙酸并用0.8%瓊脂固化的半強(qiáng)度無(wú)激素的SH培養(yǎng)基內(nèi)，以使胚胎轉(zhuǎn)化為有根和萌芽軸(第一初級(jí)葉)的完整植物。
1.在含銨培養(yǎng)基中的體細(xì)胞胚胎的發(fā)生A.豆科植物的體細(xì)胞培養(yǎng)。
按上面概述的方法培養(yǎng)豆科的代表性植物-苜蓿組織，(紫花苜蓿，RegenS品種)，並根據(jù)本發(fā)明在含有2.6mM銨的培養(yǎng)基中檢驗(yàn)體細(xì)胞發(fā)生。所有蛋白質(zhì)氨基酸的試驗(yàn)濃度為1-100mM。從此初始篩分過(guò)程中出現(xiàn)兩種反應(yīng)類型，基于這些結(jié)果，進(jìn)一步用篩分的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。表2為不包括第一反應(yīng)類型的氨基酸，發(fā)現(xiàn)這些氨基酸與SH-對(duì)照培養(yǎng)基(2.6mMNH+4)比較對(duì)生長(zhǎng)有毒性并抑制胚胎發(fā)生。這些氨基包含硫和芳香環(huán)的，並且大多是分枝鏈族的。這些氨基酸與SH對(duì)照培養(yǎng)基比較，均不刺激胚胎發(fā)生，並且都是有毒的，它們的濃度為1或10mM時(shí)都抑制生長(zhǎng)或引起愈傷組織的褐化。
與SH對(duì)照比較，初始篩選的第二反應(yīng)型可刺激胚胎發(fā)生或致使胚胎增大(參見(jiàn)表2)。對(duì)這些氨基酸作了詳細(xì)的濃度依賴性研究，結(jié)果示于圖1中。刺激體細(xì)胞胚胎形成的氨基酸中最有效的是脯氨酸，比2.6mMNH+4對(duì)照產(chǎn)生約多3倍的胚胎，而效力是25mMNH+4-苜蓿(D)中最適銨濃度的兩倍。(見(jiàn)Walker等人的上述文獻(xiàn))。丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和賴氨酸的效力較小，但它們刺激胚胎形成接近25mMNH+4的水平。絲氨酸和天冬酰胺與SH對(duì)照比較，其刺激胚胎發(fā)生的作用較差，但可增大胚胎體積。
表2概括了已發(fā)現(xiàn)對(duì)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生有刺激作用的氨基酸和其它氮源。值得注意的是，脯氨酸的酯和酰胺形成，如二肽脯氨酰丙氨酸一樣，在刺激胚胎數(shù)目和提高質(zhì)量方面具有很高的活性。有趣的是發(fā)現(xiàn)非蛋白氨基酸-鳥(niǎo)氨酸具有活性。
表2還原氮源對(duì)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響刺激源銨脯氨酸丙氨酸谷氨酰胺精氨酸天冬酰胺鳥(niǎo)氨酸絲氨酸賴氨酸L-脯氨酰胺L-脯氨酰-L-丙氨酸L-脯氨酸甲基酯使用上述技術(shù)，用目測(cè)觀察胚胎大小以檢測(cè)胚胎質(zhì)量。數(shù)據(jù)列于表3中。
表3 還原氮處理對(duì)體細(xì)胞胚胎大小的影響處理 長(zhǎng)度 寬度對(duì)照(25mMNH+4) 0.805±0.084 0.383±0.019100mML-脯氨酸 1.143±0.081 0.867±0.04630mML-丙氨酸 1.163±0.090 0.744±0.037100mML-丙氨酸 1.192±0.102 0.833±0.04930mML-精氨酸 1.521±0.142 0.663±0.04830mML-谷氨酰胺 1.342±0.122 0.773±0.0513mML-賴氨酸 1.163±0.096 0.652±0.0393mML-天冬酰胺 0.699±0.062 0.446±0.02710mML-天冬酰胺 1.239±0.102 0.610±0.034
根據(jù)表2和表3中給出的數(shù)據(jù)，氨基酸添加物在增加胚胎體積中的效力可按下列順序排列精氨酸≥谷氨酰胺＞丙氨酸＞脯氨酸＞NH+4。
使用上述技術(shù)，觀察了胚胎向帶有根及萌芽軸(第一初級(jí)葉)之完整植株的轉(zhuǎn)化，并將結(jié)果列表如下表4 體細(xì)胞胚胎向苜蓿小植株的轉(zhuǎn)化初始處理 有第一初級(jí)葉的植株百分?jǐn)?shù)25mMNH+433.3%+4.2100mML-脯氨酸 54.0%+6.450mML-丙氨酸 63.5%+4.430mML-精氨酸 59.0%+6.230mML-谷氨酰胺 67.0%+3.4根據(jù)表4的數(shù)據(jù)，影響胚胎向小植株轉(zhuǎn)化的添加物的效力順序是谷氨酰胺＞丙氨酸≥精氨酸＞脯氨酸＞NH+4這些數(shù)據(jù)間的相互關(guān)系表明，胚胎體積是胚胎向小植株轉(zhuǎn)化的一個(gè)良好標(biāo)志，因此也是上述技術(shù)產(chǎn)生的胚胎質(zhì)量的一個(gè)良好標(biāo)志。
測(cè)定了刺激瓊脂固體培養(yǎng)物和液體懸浮培養(yǎng)物中體細(xì)胞胚胎發(fā)生的氨基酸的最適加入量。這些數(shù)據(jù)在下列表5和表6中給出表5 向具有2.6mMNH+4的瓊脂固體培養(yǎng)物加入氨基酸對(duì)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生的刺激作用來(lái)源 %最大刺激 濃度范圍 最適濃度(mM) (mM)對(duì)照(2.6mMNH+4) 100 - -L-脯氨酸 330 10-300 (100)L-丙氨酸 314 20-150 (75-100)L-谷氨酰胺 175 20-50 (30-40)L-精氨酸 244 5-50 (30-40)L-天冬酰胺 155 0.5-3 (1)L-鳥(niǎo)氨酸 156 1-3 (1-3)L-絲氨酸 160 0.5-2 (1)L-賴氨酸 233 1-10 (3)L-脯氨酰胺 240 30-200 (50-100)L-脯氨酸甲基酯 241 5-25 (10)L-脯氨酰-L-丙氨酸 210 30-200 (50-100)表6 向具有2.6mMNH+4液體懸浮培養(yǎng)物中加入氨基酸對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的刺激作用來(lái)源 %最大刺激 濃度范圍(mM) 最適濃度(mM)對(duì)照(2.6mMNH+4) 100L-脯氨酸 528 100-300 (100)L-丙氨酸 240 25-200 (50)L-谷氨酰胺 243 5-75 (50)L-精氨酸 168 5-75 (50)L-賴氨酸 180 1-10 (3)
B.傘形科植物的體細(xì)胞培養(yǎng)使傘形科的代表性植物-芹菜(Apium graveolens，Calmario品種)的種子萌發(fā)1-2周。用10%Clorox
的溶液將所得籽苗滅菌20分鐘。除去子葉或胚軸，將其置于含有25μM2，4-D和5μM芐基腺嘌呤的0.8%瓊脂固化的無(wú)激素SH培養(yǎng)基上。出現(xiàn)愈傷組織后(3-4周)，將愈傷組織移入含2.5μM2，4-D和0.5μM激動(dòng)素的SH培養(yǎng)基內(nèi)。用濾器將熱不穩(wěn)定性添加物除菌并加入熱培養(yǎng)基內(nèi)。如需要時(shí)，可用改良的括抹裝置取得用于接種的特定量的組織并將其充填至均一體積。隨后在加有1μM毒莠定(Picloram)和0.5μM芐基腺嘌呤的SH培養(yǎng)基上再培養(yǎng)愈傷組織。為進(jìn)行體細(xì)胞胚胎生產(chǎn)，將75mg愈傷組織細(xì)胞移入含有經(jīng)過(guò)濾膜除菌的添加物的0.8%瓊脂固化的無(wú)激素SH培養(yǎng)基內(nèi)，并在培養(yǎng)苜蓿體細(xì)胞的同樣條件下，24℃保溫18到30天。
比較了脯氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺等氨基酸處理的胚胎與NH+4對(duì)照處理的胚胎。用50mM丙氨酸處理培養(yǎng)物導(dǎo)致比所有其它處理方法有更高的胚胎發(fā)生頻率，而且比其它方法處理的培養(yǎng)物有更好的子葉、根和初級(jí)葉發(fā)育。觀察到所形成的總胚胎數(shù)的順序如下20-100mM丙氨酸＞50mM脯氨酸＞25mM谷氨酰胺-N＞25mMNH+4雖然用脯氨酸刺激胚胎發(fā)生比用谷氨酰胺更好，但后者可導(dǎo)致更好的籽苗樣胚胎的發(fā)育。銨處理的培養(yǎng)物比所有其它的處理發(fā)育得較小而且胚胎數(shù)較少。谷氨酸以30mM的量單獨(dú)加入芹菜再生培養(yǎng)基內(nèi)時(shí)，與25mMNH+4處理的材料相比較，它可刺激芹菜胚胎數(shù)目的增加。與NH+4處理的胚胎比較，上述濃度的丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸可促進(jìn)胚胎向小植株的轉(zhuǎn)化。
C.禾本科植物的體細(xì)胞培養(yǎng)使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，進(jìn)行禾本科的代表性植物-玉米(Zeamays)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生。
受精十天后收獲玉米的穗并在無(wú)菌條件下從中解剖出未成熟的胚胎。將胚胎置于加有3%蔗糖和5μM2，4-D的N-6礦質(zhì)鹽培養(yǎng)基(Chu，C.C.，Wang，C.C.，Sun，C.S.，Hsu，C.，Yin，K.C.，Chu.C.Y.，1975.Establishment of an efficient medium for anther Culture of rice through Comparative experiments on the nitrogen Sources Sci.Sin.16659-688)上保溫21天。保溫后檢定有或沒(méi)有L-脯氨酸時(shí)每個(gè)愈傷組織上形成的胚胎團(tuán)的數(shù)目。結(jié)果在表7中給出，其中百分反應(yīng)是287-1165個(gè)重復(fù)胚胎分離塊的胚胎形成的平均頻數(shù)。
表7 L-脯氨酸對(duì)玉米胚胎愈傷組織形成的影響脯氨酸濃度(mM) %胚胎愈傷組織形成0 15.86 20.612 20.824 20.2作為涉及禾本科植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的進(jìn)一步的實(shí)例，是依據(jù)本發(fā)明的實(shí)踐增殖水稻品種陸稻(Oryza Sativa)。
使陸稻(Oryza Sativa)種子去殼，進(jìn)行表面消毒并置于加有4%蔗糖、0.26mM色氨酸、5μM2，4-D、1μM激動(dòng)素、pH6.2，并加有2.5克/升Gelrite作為凝膠形成劑的Murashige和Skoog(MS)鹽類培養(yǎng)基上(Murashige，T.和F.Skoog，1962，見(jiàn)上)。15-21天后用解剖顯微鏡檢測(cè)單個(gè)種子的胚鱗區(qū)上的胚胎形成。表8給出了用和不用L-脯氨酸處理的結(jié)果。
表8 L-脯氨酸對(duì)水稻愈傷組織培養(yǎng)物中胚胎形成的影響脯氨酸濃度(mM) %胚胎形成0 57.83 59.010 77.830 64.950 70.1100 68.4D.錦葵科植物的體細(xì)胞培養(yǎng)作為本發(fā)明對(duì)錦葵科植物體細(xì)胞組織的培養(yǎng)實(shí)踐的一個(gè)例子，在依據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的方法制備的培養(yǎng)基中，繁殖了兩個(gè)棉花品種的培養(yǎng)物。
陸地棉(Gossypium hirsutum)。在加有3%蔗糖和0.5μMNAA、5μM2-異戊基腺嘌呤及0.8%瓊脂的Murashige和Skoog鹽類培養(yǎng)基上，將由陸地棉(Gossypiumhirsutum)經(jīng)表面滅菌的種子起始的培養(yǎng)物再培養(yǎng)4周。培養(yǎng)物在含有0.5μM2，4-D和0.2μM激動(dòng)素或1μMNAA和0.5μM激動(dòng)素的液體懸浮培養(yǎng)基上(其中加或不加脯氨酸)誘導(dǎo)10天以形成胚胎。然后將細(xì)胞移入含3%蔗糖和10mML-谷氨酰胺的無(wú)激素SH培養(yǎng)基內(nèi)使之再生。四周后檢測(cè)帶有成熟子葉之胚胎的形成。結(jié)果在表9中給出。
表9 在懸浮培養(yǎng)中加脯氨酸對(duì)棉花子葉(Gossypium hirsutum)胚胎再生的影響脯氨酸濃度(mM) 帶子葉胚胎0 5.524 12.5克勞次基棉(Gossypium Klotzschianum)。在含3%蔗糖、0.5μMNAA和5μM2-異戊基腺嘌呤的Murashige和Skoog鹽類培養(yǎng)基上再培養(yǎng)由表面滅菌過(guò)的種子起始的培養(yǎng)物。將愈傷組織在含3%蔗糖和0.2μM毒莠定的MS鹽類培養(yǎng)基中懸浮10天，然后使之在加有L-谷氨酰胺的無(wú)激素培養(yǎng)基上再生21天。結(jié)果在表10中給出。
表10 L-谷氨酰胺對(duì)克勞次基棉(Gossypium Klotzschianum)胚胎形成的影響
L-谷氨酰胺濃度(mM) 子葉胚胎5 010 2.020 3.52.氨基酸與銨離子源的相互作用按上述實(shí)驗(yàn)方法誘導(dǎo)細(xì)胞、進(jìn)行篩分和平板培養(yǎng)。改變脯氨酸、精氨酸和NH+4的濃度，以確定其它添加物存在是否影響單獨(dú)加入任何添加物時(shí)的最適濃度。
1.脯氨酸試驗(yàn)的脯氨酸濃度范圍為30mM至300mM，此時(shí)所加NH+4的量變化范圍是0至25mM。試驗(yàn)結(jié)果在表11中給出。
2.精氨酸為相似實(shí)驗(yàn)，其中除加入培養(yǎng)基的NH+4濃度變化外，精氨酸的濃度也是變化的。結(jié)果在表11中給出。
表11 苜蓿胚胎發(fā)生中氨基酸與銨離子相互作用的影響(至少七次試驗(yàn)所產(chǎn)生的胚胎的平均數(shù))脯氨酸濃度(mM) 30 100 300NH+4濃度(mM)0 326 470 1331.0 502 747 5412.6 753 731 82510.0 887 811 57225.0 744 1042 844
精氨酸濃度(mM) 0 10 30 100NH+4濃度(mM)0 12 147 126 991.0 70 252 246 1572.6 207 298 306 26410.0 340 408 411 31125.0 335 297 233 148從以上各實(shí)驗(yàn)看出，當(dāng)所加精氨酸或脯氨酸為最適濃度，而且NH+4亦為最適濃度時(shí)則產(chǎn)生協(xié)同作用。
重復(fù)表11所描述之實(shí)例的一部分，試驗(yàn)了NH+4和L-脯氨酸的各種不同濃度對(duì)體細(xì)胞胚胎數(shù)量和向小植株轉(zhuǎn)化的影響。
表12 銨和脯氨酸對(duì)體細(xì)胞胚胎(SE)數(shù)量和質(zhì)量的影響脯氨酸(mM) NH+4(mM) SE數(shù)量轉(zhuǎn)化%0 0 4±1 3±30 2.6 36±5 4±30 25 60±6 9±510 2.6 95±12 25±530 2.6 134±17 42±7100 2.6 175±19 42±430 10 187±24 42±6從中看出加有脯氨酸和銨的培養(yǎng)基可提高胚胎數(shù)目;當(dāng)有高或低濃度銨離子存在時(shí)脯氨酸可提高胚胎質(zhì)量。
3.向基本上沒(méi)有銨離子的培養(yǎng)基內(nèi)添加氨基酸按上述實(shí)施例的方法誘導(dǎo)苜蓿細(xì)胞并進(jìn)行平板培養(yǎng)，不同的是從培養(yǎng)基配方中去掉NH+4。試驗(yàn)一系列濃度的氨基酸對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響，所得結(jié)果概括于表13中。
表13 向基本上沒(méi)有NH+4的培養(yǎng)基的瓊脂固化的培養(yǎng)物內(nèi)加氨基酸對(duì)苜蓿體細(xì)胞胚胎發(fā)生的刺激作用添加 %最大刺激 濃度范圍(mM) 最適濃度(mM)對(duì)照(無(wú)NH+4) 100 - -L-脯氨酸 525 6-300 (10-30)L-精氨酸 1200 1-100 (20-50)L-天冬酰胺 750 1-100 (2-10)L-鳥(niǎo)氨酸 900 0.3-3 (1)L-賴氨酸 500 1-10 (3)基本上沒(méi)有NH+4時(shí)，以上述氨基酸作為唯一的還原氮源，表明對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生有刺激作用。另外，除了鳥(niǎo)氨酸以外，通過(guò)胚胎大小、形狀和成熟程度的測(cè)定，證明加入上述各種濃度范圍的氨基酸，均可顯著提高所產(chǎn)生胚胎的質(zhì)量。
4.聯(lián)合使用氨基酸下表表明在沒(méi)有NH+4時(shí)向苜蓿培養(yǎng)物內(nèi)聯(lián)合加入氨基酸的效果。聯(lián)合使用氨基酸對(duì)提高胚胎數(shù)具有協(xié)同作用。
表14 胚胎數(shù)實(shí)驗(yàn)1.50mML-脯氨酸 8030mML-谷氨酰胺 5050mM脯氨酸和30mM谷氨酰胺 248實(shí)驗(yàn)2.100mML-脯氨酸 27100mML-丙氨酸 74100mML-脯氨酸+50mML-丙氨酸 21530mML-精氨酸 135100mML脯氨酸+30mM精氨酸 215在以脯氨酸與其它氨基酸進(jìn)行的聯(lián)合處理中，觀察到了最大和質(zhì)量最好的胚胎。
雖然為清楚了解起見(jiàn)已通過(guò)圖表和實(shí)施例對(duì)前述發(fā)明作了一定程度的詳細(xì)描述，但在待批準(zhǔn)的權(quán)利要求
范圍內(nèi)進(jìn)行某些改變和修飾，對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1.一種用于誘導(dǎo)、再生和維持植物體細(xì)胞胚胎組織的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于它包括一種含銨離子源的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中還加有選自L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-絲氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、L-谷氨酸及其酰胺、烷基酯和其二肽衍生物的至少一種氨基酸，與沒(méi)有加氨基酸的培養(yǎng)基所產(chǎn)生的胚胎相比較，所加入的量足以增加所產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加有L-脯氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-脯氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為6-300mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-丙氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-丙氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為10-200mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-精氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-精氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為3-75mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-谷氨酰胺、其酰胺、烷基酯或含L-谷氨酰胺的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為3-50mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少加入足夠數(shù)量的L-賴氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-賴氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為1-10mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-天冬酰胺、其酰胺、烷基酯或含L-天冬酰胺的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為0.5-10mM。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-絲氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-絲氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為0.5-2mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-鳥(niǎo)氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-鳥(niǎo)氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為1-3mM。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-谷氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-谷氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為15-40mM。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-脯氨酰胺或含L-脯氨酰胺的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為1-200mM。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-脯氨酸甲基酯或含L-脯氨酸甲基酯的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為0.3-40mM。
13.根據(jù)權(quán)利要求
1或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-脯氨酸-L-丙氨酸，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為1-200mM。
14.一種用于誘導(dǎo)、再生或維持植物體細(xì)胞胚胎組織的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基基本上不含銨離子，其改進(jìn)包括向培養(yǎng)基內(nèi)加入至少一種選自L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-鳥(niǎo)氨酸、L-賴氨酸及其酰胺、烷基酯和二肽衍生物的氨基酸，與沒(méi)有作如此添加的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的胚胎相比，所加數(shù)量足以顯著地提高所產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的數(shù)目或質(zhì)量。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-脯氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-脯氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為6-300mM。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-精氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-脯氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為15-100mM。
17.根據(jù)權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-賴氨酸、其酰胺、烷基酯或含L-賴氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為1-10mM。
18.根據(jù)權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-天冬酰胺、其酰胺、烷基酯或含有L-天冬酰胺的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為2-100mM。
19.根據(jù)權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-鳥(niǎo)氨酸、其酰胺、烷基酯或含有L-鳥(niǎo)氨酸的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為0.3-3mM。
20.根據(jù)權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-脯氨酸酰胺或含脯氨酸酰胺的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為1-200mM。
21.根據(jù)權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基，其中至少以足夠數(shù)量加入L-脯氨酸甲基酯或含L-脯氨酸甲基酯的二肽衍生物，使其在培養(yǎng)基中的最終濃度約為0.3-40mM。
22.根據(jù)權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基，其中至少加入L-脯氨酰-L-丙氨酸，所加量足以使之在培養(yǎng)基中的最終濃度約為1-200mM。
23.根據(jù)權(quán)利要求
1、14或28中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基，其中植物細(xì)胞培養(yǎng)基是選自Schenk-Hildebrandt培養(yǎng)基和Murashige-Skoog培養(yǎng)基。
24.一種從培養(yǎng)的植物組織中通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生生產(chǎn)胚胎的方法，其特征在于該方法包括在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)、再生或維持期，于權(quán)利要求
1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的植物體細(xì)胞組織;以及然后從所說(shuō)的植物培養(yǎng)基中回收體細(xì)胞胚胎。
25.一種從培養(yǎng)的植物組織中通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生生產(chǎn)胚胎的方法，其特征在于該方法包括在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)、再生或維持期，于權(quán)利要求
14的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的植物體細(xì)胞組織;以及然后從所說(shuō)的植物培養(yǎng)基中回收體細(xì)胞胚胎。
26.根據(jù)權(quán)利要求
1的培養(yǎng)基，其中銨離子源是選自一組包括氯化銨、硝酸銨、碳酸銨、硫酸銨、磷酸銨和檸檬酸銨中的至少一種物質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求
1的培養(yǎng)基，其中提供的銨離子源的量足以使之在培養(yǎng)基中的最終濃度達(dá)到約為0.5-50mM。
28.一種用于誘導(dǎo)、再生或維持植物體細(xì)胞胚胎組織的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基基本上沒(méi)有銨離子，其改進(jìn)包括向培養(yǎng)基內(nèi)加入L-谷氨酰胺及選自L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-絲氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、L-谷氨酸、及其酰胺、烷基酯和二肽衍生物中的至少一種氨基酸，與沒(méi)有作如此添加的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的胚胎比較，所加量足以提高所產(chǎn)生之體細(xì)胞胚胎的數(shù)目和質(zhì)量。
29.根據(jù)權(quán)利要求
28的培養(yǎng)基，其中所提供的L-谷氨酰胺的量足以使其在培養(yǎng)基中達(dá)到大約10-50mM的最終濃度。
30.一種通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生從培養(yǎng)的植物組織中生產(chǎn)胚胎的方法，其特征在于該方法包括在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)、再生或維持期，于權(quán)利要求
28的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的植物體細(xì)胞組織;以及然后從所說(shuō)的植物培養(yǎng)基中回收體細(xì)胞胚胎。
31.根據(jù)權(quán)利要求
24、25或30中任一項(xiàng)的方法，其中植物體細(xì)胞組織是選自紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)、芹菜(Apium graveolens L.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、克勞次基棉(Gossypium Klotzschianum)、玉米(Zea mays L)和陸稻(Oryza sativa)中的至少一種植物。
專利摘要
提供了改善通過(guò)誘導(dǎo)植物體細(xì)胞組織得到的胚 胎數(shù)量和質(zhì)量的方法及培養(yǎng)基。培養(yǎng)基內(nèi)加有一定 量的經(jīng)選擇的氨基酸，其數(shù)量足以提高所產(chǎn)生之體 細(xì)胞胚胎的數(shù)目。本發(fā)明還提供了包含銨離子源的 培養(yǎng)基以及培養(yǎng)植物體細(xì)胞組織的方法。
文檔編號(hào)C12N5/04GK86107575SQ86107575
公開(kāi)日1987年5月27日 申請(qǐng)日期1986年10月21日
發(fā)明者戴維·A·斯圖爾特, 史蒂文·G·斯特里克蘭 申請(qǐng)人:植物遺傳學(xué)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan