專利名稱：制備無飼養(yǎng)細(xì)胞、無異源的人胚胎干細(xì)胞的方法以及使用該方法制備的干細(xì)胞培養(yǎng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
及背景技術(shù)本發(fā)明涉及使用無飼養(yǎng)細(xì)胞(如飼養(yǎng)細(xì)胞層，也稱作飼養(yǎng)層)、無異源(xeno-free)的培養(yǎng)體系來制備人胚胎干細(xì)胞系的方法，另外還涉及在該無異源污染物和飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中，能夠維持其未分化、具有多能性和可增殖狀態(tài)的干細(xì)胞。
胚胎干細(xì)胞(ESCs)是全能性的，其具有分化為任意類型的細(xì)胞并生成任意類型的組織、器官或部分軀體包括完整有機(jī)體的能力。同樣，人們預(yù)期如果能夠根據(jù)需要而獲得常態(tài)人ESCs克隆并且能夠控制其分化，則將提供一種強(qiáng)有力的工具，將對生物醫(yī)學(xué)、工業(yè)和科學(xué)研究領(lǐng)域產(chǎn)生根本性的推動作用。ESCs潛在的用途非常廣泛，包括藥物的發(fā)現(xiàn)和測試、用于移殖的細(xì)胞、組織和器官的產(chǎn)生、生物分子的制備、化合物的毒性和/或致畸性測試、以及促進(jìn)有關(guān)發(fā)育和其它生物進(jìn)程的研究。例如，目前預(yù)期一些疾病，包括Parkinson’s病(帕金森病)、心肌梗塞、幼年型糖尿病和白血病，均能夠通過治療性移殖ESCs或ESC衍生細(xì)胞而加以治療(Gearhart J.Science 1998，2821061；Rossant和Nagy，Nature Biotech.1999，1723)。
然而，在開發(fā)利用人ESCs的實(shí)踐中仍然存在著非常大的障礙。
為了使人ESC處于一種未分化狀態(tài)，必須補(bǔ)充能夠維持細(xì)胞增殖、抑制ES細(xì)胞分化并保持細(xì)胞多能性的因子到ES培養(yǎng)物中。
另外，如果用于細(xì)胞置換和組織再生治療時(shí)，人ESCs必須在一種完全無動物成分的環(huán)境中并且在特定的能夠使ES培養(yǎng)物進(jìn)行完全繁殖的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
現(xiàn)有的ES培養(yǎng)方法主要是基于使用飼養(yǎng)細(xì)胞層，該細(xì)胞層能夠分泌干細(xì)胞增殖所需的因子，同時(shí)又抑制干細(xì)胞的分化。無飼養(yǎng)細(xì)胞體系也已經(jīng)應(yīng)用于ES細(xì)胞培養(yǎng)，上述體系使用了添加血清、細(xì)胞因子、和生長因子的基質(zhì)，使用該基質(zhì)代替飼養(yǎng)細(xì)胞層。
基于飼養(yǎng)層的培養(yǎng)小鼠飼養(yǎng)層-最常用的培養(yǎng)ES細(xì)胞的方法是基于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)作為飼養(yǎng)細(xì)胞層，其中添加了含有血清或白血病抑制因子(LIF)的組織培養(yǎng)基，上述因子能夠維持ES細(xì)胞的增殖和其多能性[Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，Waknitz MA，SwiergielJJ，Marshall VS，Jones JM.(1998).Embryonic stem cell lines derivedfrom human blastocysts.Science 2821145-7；Reubinoff BE，Pera MF，F(xiàn)ong C，Trounson A，Bongso A.(2000).Embryonic stem cell lines fromhuman blastocystssomatic differentiation in vitro.Nat.Biotechnol.18399-404]。MEF來自于12-13天的小鼠胚胎，在條件培養(yǎng)基中添加了胎牛血清。在這樣的條件下，小鼠ES細(xì)胞能夠在培養(yǎng)物中作為多能性干細(xì)胞被維持，保留其表型和功能特性。然而，與鼠ES細(xì)胞不同，所添加的外源LIF不能防止人ES細(xì)胞的分化(Thomson等，1998，Science 2821145-7；Reubinoff等，2000，Nat.Biotechnol.18399-404)。此外，使用飼養(yǎng)細(xì)胞極大提升了生產(chǎn)成本，并且不能實(shí)現(xiàn)人ES細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)。另外，飼養(yǎng)細(xì)胞是代謝失活的，以防止其使干細(xì)胞過分生長，因此對于人ES的每次分離培養(yǎng)，均需要補(bǔ)充新鮮的飼養(yǎng)細(xì)胞。因?yàn)楝F(xiàn)在從大規(guī)模制備的胚胎細(xì)胞中還不能有效地分離出飼養(yǎng)細(xì)胞組分，因此由飼養(yǎng)細(xì)胞層制備的ES培養(yǎng)物還不能適用于人類的治療。
還可以在無血清的條件下以MEF培養(yǎng)ES細(xì)胞，其中使用了添加基本成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的血清替代品[Amit M，CarpenterMK，Inokuma MS，Chiu CP，Harris CP，Waknitz MA，Itskovitz-EldorJ，Thomson JA.(2000).Clonally derived human embryonic stem celllines maintain pluripotency and proliferative potential for prolongedperiods of culture.Dev.Biol.227271-8]。在上述條件下，ES細(xì)胞的克隆效率比胎牛血清條件下高出4倍。另外，在使用血清替代品的條件下，在6個(gè)月的培養(yǎng)時(shí)間之后，根據(jù)其形成含有全部三個(gè)胚胎原基層的畸胎瘤的能力，顯示出ES細(xì)胞仍然保持了其多能性。雖然上述體系使用了明確的培養(yǎng)條件，但是培養(yǎng)物中小鼠細(xì)胞的存在使人培養(yǎng)物暴露于病原體之下，這限制了其在細(xì)胞治療中的應(yīng)用。
以人胚胎成纖維細(xì)胞或成人法洛皮歐(fallopian)上皮細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞層-可以使用人胚胎成纖維細(xì)胞或成人法洛皮歐上皮細(xì)胞來生長和維持人ES細(xì)胞。當(dāng)在上述人飼養(yǎng)細(xì)胞上生長時(shí)，人ES細(xì)胞顯示出正常的染色體組型，表現(xiàn)出堿性磷酸酶活性，表達(dá)了Oct-4和其它胚胎細(xì)胞表面標(biāo)記物，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和GCTM-2，能夠在體內(nèi)形成畸胎瘤，并保留所有關(guān)鍵性的形態(tài)學(xué)特性[RichardsM，F(xiàn)ong CY，Chan WK，Wong PC，Bongso A.(2000).Human feederssupport prolonged undifferentiated growth of human inner cell massesand embryonic stem cells.Nat.Biotechnol.20933-6]。然而，使用人胚胎成纖維細(xì)胞或成人法洛皮歐管上皮細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的一個(gè)主要的缺點(diǎn)是上述兩個(gè)細(xì)胞系的傳代能力是有限的，只有8-10次，因而對延長ES的生長時(shí)間的能力造成了制約。為了使培養(yǎng)時(shí)間延長，必須在來源于幾個(gè)受試者的人飼養(yǎng)細(xì)胞上生長ES細(xì)胞，這增大了培養(yǎng)條件的可變性。
包皮飼養(yǎng)層-使用人包皮飼養(yǎng)層也能培養(yǎng)人ES細(xì)胞，此項(xiàng)技術(shù)公開在美國專利申請?zhí)?0/368,045中。來自包皮的飼養(yǎng)細(xì)胞層由一種完全無動物成分的環(huán)境組成，適用于培養(yǎng)人ES細(xì)胞。另外，包皮細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中從其衍出出來后傳代42次，從而為ES細(xì)胞提供了一個(gè)相對恒定的環(huán)境。在上述條件下，發(fā)現(xiàn)人ES細(xì)胞在功能上不同于替代方案所生長的細(xì)胞(如MEF方案)。在分化之后，ES細(xì)胞在體外能夠表達(dá)與全部三個(gè)胚胎原基層相關(guān)的基因，并且在體內(nèi)能夠形成畸胎瘤，該畸胎瘤包括了由全部三個(gè)胚原基層所生成的組織。另外，不同于人法洛皮歐上皮細(xì)胞或人胚胎成纖維細(xì)胞，在包皮飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人ES細(xì)胞在培養(yǎng)中處于多能性和未分化狀態(tài)的時(shí)間能夠維持至少87次傳代。然而，盡管包皮細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中保持很長的時(shí)間(即42次傳代)，但是包皮培養(yǎng)體系不能很明確地確定下來，這是因?yàn)椴煌沃g存在差異。另外，基于人飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系仍然需要飼養(yǎng)層和hES細(xì)胞的同時(shí)生長。因此發(fā)展了無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系。
無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)在存在培養(yǎng)基的條件下，干細(xì)胞可以在固相表面生長，如細(xì)胞外基質(zhì)(如MatrigelRTM或?qū)诱尺B蛋白)?；陲曫B(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)需要飼養(yǎng)細(xì)胞和干細(xì)胞的同時(shí)生長，并由此可能導(dǎo)致出現(xiàn)混合細(xì)胞群體，與此不同，在無飼養(yǎng)細(xì)胞體系中生長干細(xì)胞，能夠很容易地從表面分離干細(xì)胞。使干細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中包含能夠有效抑制分化和促進(jìn)其生長的因子，如MEF條件培養(yǎng)基和bFGF。然而，通常所使用的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系使用了一種動物來源的基質(zhì)(如MatrigelRTM)，其中添加小鼠或牛血清，或添加MEF條件培養(yǎng)基[Xu C，等(2001).Feedercells-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.NatBiothchnol.19971-4]，這其中存在動物病原體交叉?zhèn)魅窘o人ES細(xì)胞的危險(xiǎn)，因此給進(jìn)一步的臨床應(yīng)用造成了困難。
美國專利申請?zhí)?0/368,045公開的進(jìn)一步的技術(shù)方案中，可以在添加了包皮來源的條件培養(yǎng)基的基質(zhì)表面培養(yǎng)干細(xì)胞。然而，上述條件培養(yǎng)基盡管是無動物成分體系，但在培養(yǎng)物組成上仍沒有完全清楚限定。
在培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞方面，近期的一些研究給出了更加明確的培養(yǎng)物組成，其中利用了Matrigel或?qū)诱尺B蛋白表面和生長因子混合物。然而，根據(jù)美國專利申請?zhí)?0030017589的記載，在上述條件下，僅有50-70％的細(xì)胞表現(xiàn)出未分化細(xì)胞形態(tài)。另外，上述干細(xì)胞還表現(xiàn)出相對短的倍增時(shí)間，為19個(gè)小時(shí)，這提示干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤源性(參見Amit等，2000，Dev.Biol.227271-8)。
因此非常有必要提供一種能夠使人ES細(xì)胞保持其增殖性、多能性和未分化狀態(tài)的無飼養(yǎng)細(xì)胞、無異源的培養(yǎng)體系，以避免前面所述的各種不足，這將是非常有益的。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種建立不含飼養(yǎng)細(xì)胞、能夠維持未分化、多能性和增殖狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞系的方法，該方法包含(a)獲取人胚胎干細(xì)胞，和(b)在不含飼養(yǎng)細(xì)胞、包括基質(zhì)和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，從而獲得無飼養(yǎng)細(xì)胞的人胚胎干細(xì)胞系。
根據(jù)所描述的優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，該方法進(jìn)一步包含在所述培養(yǎng)條件下，從步驟(b)得到的人胚胎干細(xì)胞系中克隆細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種在不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，繁殖處于未分化、多能性和增殖狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞系的方法，該方法包含在基質(zhì)上和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養(yǎng)基中，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞系的細(xì)胞，從而使人胚胎干細(xì)胞系的細(xì)胞保持未分化、多能性和增殖的狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，還提供一種建立無飼養(yǎng)細(xì)胞、能夠維持未分化、多能性和增殖狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞系的方法，該方法包含(a)獲取人胚胎干細(xì)胞，和(b)在不含飼養(yǎng)層細(xì)胞、包括纖連蛋白基質(zhì)和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，從而獲得無飼養(yǎng)細(xì)胞的人胚胎干細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了一種在不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，繁殖處于未分化、多能性和增殖狀態(tài)的人胚胎干細(xì)胞系的方法，該方法包含在纖連蛋白基質(zhì)上和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養(yǎng)基中，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞系的細(xì)胞，從而使人胚胎干細(xì)胞系的細(xì)胞保持一種未分化、多能性和增殖的狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了一種建立無異源、無飼養(yǎng)細(xì)胞的，能夠維持未分化、多能性和增殖狀態(tài)的物種胚胎干細(xì)胞系的方法，該方法包含(a)獲取胚胎干細(xì)胞，和(b)在不含飼養(yǎng)細(xì)胞和異源污染物、包括來源于物種的基質(zhì)和組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，從而獲得無異源、無飼養(yǎng)細(xì)胞的該物種的胚胎干細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了一種在不含飼養(yǎng)細(xì)胞和異源污染物的培養(yǎng)條件下，繁殖處于未分化、多能性和增殖狀態(tài)的物種胚胎干細(xì)胞系的方法，該方法包含在來源于物種的基質(zhì)上和組織培養(yǎng)基中，培養(yǎng)該物種的胚胎干細(xì)胞系的細(xì)胞，從而使該物種的胚胎干細(xì)胞系的細(xì)胞保持未分化、多能性和增殖的狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含存在于培養(yǎng)基中的未分化、具有多能性和可增殖的人胚胎干細(xì)胞，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含異源污染物和/或飼養(yǎng)細(xì)胞污染物。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種無異源、無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系，其包含基質(zhì)和組織培養(yǎng)基，所選出的上述無異源、無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系能夠使其中所培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞保持增殖、多能性和未分化狀態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種治療需要細(xì)胞置換和/或組織再生的個(gè)體的方法，該方法包含給所述個(gè)體施用無異源污染物和無飼養(yǎng)細(xì)胞污染物的人胚胎干細(xì)胞制品。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的其他特點(diǎn)，該方法進(jìn)一步包含在施用前制備所述人胚胎干細(xì)胞制品，所述制備是通過下述步驟實(shí)現(xiàn)的(a)獲取人胚胎干細(xì)胞，和(b)在不含飼養(yǎng)細(xì)胞和異源污染物、包括來源于人的纖連蛋白基質(zhì)和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，從而制備出人胚胎干細(xì)胞制品。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種在不含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，使人胚胎干細(xì)胞保持未分化、多能性和增殖狀態(tài)的方法，所述方法包含在包括基質(zhì)和添加了至少一種生長因子的組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)所述人胚胎干細(xì)胞，其中所選擇的生長因子的濃度范圍能夠使干細(xì)胞維持至少56次傳代，倍增時(shí)間為至少25小時(shí)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述基質(zhì)是纖連蛋白基質(zhì)。
根據(jù)又一優(yōu)選實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述纖連蛋白選自牛纖連蛋白、重組牛纖連蛋白、人纖連蛋白、重組人纖連蛋白、小鼠纖連蛋白、重組小鼠纖連蛋白、和合成纖連蛋白。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述培養(yǎng)條件中基本上不含有異源污染物，同時(shí)所述基質(zhì)選自人血漿纖連蛋白基質(zhì)、重組人血漿纖連蛋白基質(zhì)、人細(xì)胞纖連蛋白基質(zhì)、重組人細(xì)胞纖連蛋白基質(zhì)、人工合成纖連蛋白基質(zhì)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征是所述人胚胎干細(xì)胞系包含至少85％的未分化人胚胎干細(xì)胞。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征是所述人胚胎干細(xì)胞系的所述細(xì)胞所維持的倍增時(shí)間至少為25小時(shí)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述組織培養(yǎng)基進(jìn)一步包括血清和/或血清替代品。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述血清和/或血清替代品的濃度至少是10％。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述血清和/或血清替代品的濃度是15％。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述TGFβ1的濃度至少是0.06ng/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述TGFβ1的濃度是0.12ng/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述bFGF的濃度至少是2ng/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述bFGF的濃度是4ng/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述LIF的濃度至少是500u/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述LIF的濃度是1000u/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述基質(zhì)是物種來源的纖連蛋白基質(zhì)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件中基本上不含異源污染物。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述物種胚胎干細(xì)胞系的細(xì)胞所維持的倍增時(shí)間至少是20個(gè)小時(shí)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述組織培養(yǎng)基包括來源于物種的血清和/或血清替代品。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，來源于物種的血清的濃度至少是5％。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述組織培養(yǎng)基進(jìn)一步包括至少一種生長因子。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述的至少一種生長因子選自TGFβ1、bFGF、LIF。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述組織培養(yǎng)基是來源于物種的條件培養(yǎng)基。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述人胚胎干細(xì)胞能夠保持未分化、多能性和增殖狀態(tài)至少38次傳代。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述TGFβ1的濃度范圍是0.06-0.24ng/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述bFGF的濃度范圍是2-8ng/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述LIF的濃度范圍是500-2000u/ml。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式的進(jìn)一步的特征，所述培養(yǎng)條件包括濃度為15％的血清替代品、濃度為0.12ng/ml的TGFβ1、濃度為1000u/ml的LIF、和濃度為4ng/ml的bFGF。
本發(fā)明提供了一種利用無飼養(yǎng)細(xì)胞、無異源的培養(yǎng)體系來建立和繁殖人胚胎干細(xì)胞系的方法，并提供了存在于無異源污染物和飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中的、能夠保持未分化、多能性和增殖狀態(tài)的干細(xì)胞，從而成功地克服了現(xiàn)有已知技術(shù)方案的不足。
除非另有說明，本申請所使用的所有科技術(shù)語的含義均等同于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的一般理解。下面對實(shí)施本發(fā)明所適用的方法和材料進(jìn)行詳細(xì)描述，不過與上述方法和材料類似或等價(jià)的方法和材料同樣適用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明。如果存在歧義，則以本專利說明書包括定義為準(zhǔn)。另外，下述的材料、方法和實(shí)施例僅是對本發(fā)明的說明，而不是限定本發(fā)明。
附圖簡述參考后面的附圖并給合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述。下面詳細(xì)參考附圖，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是附圖所顯示出了各種細(xì)節(jié)僅作為例子，用于解釋本發(fā)明所優(yōu)選的實(shí)施方式，并為了有助于在原理上和概念上更容易地理解本發(fā)明。從這點(diǎn)上來說，附圖不需要顯示出本發(fā)明更為詳細(xì)的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，其只要能夠滿足對本發(fā)明的基本理解就可以了，帶有附圖的本說明書能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員很顯然地得出本發(fā)明所包含的幾種實(shí)施方式。
關(guān)于附圖附

圖1a-d是顯微照片，顯示在無飼養(yǎng)細(xì)胞體系中，在來源于牛纖連蛋白基質(zhì)上生長的ES細(xì)胞克隆和ES單細(xì)胞。明亮區(qū)域顯示在存在血清替代品和各種生長因子組合的條件下，在纖連蛋白上生長的各種ES細(xì)胞系。附圖1a顯示在存在TGFβ1、LIF和bFGF(TLF)的培養(yǎng)條件下生長的I-6ES細(xì)胞系，進(jìn)行31次傳代后的情況(尺寸條代表100μm)。附圖1b顯示在存在TLF的培養(yǎng)條件下生長的I-3ES細(xì)胞系，進(jìn)行21次傳代后的情況(尺寸條代表50μm)；附圖1c顯示在存在TLF的培養(yǎng)條件下生長的I-6ES細(xì)胞系，進(jìn)行31次傳代后的情況(尺寸條代表50μm))；附圖1d顯示TGFβ1和bFGF(TF)條件下生長的I-3ES細(xì)胞系，進(jìn)行20次傳代后的情況(尺寸條代表38μm)。記錄細(xì)胞之間的間隔(附圖1a-c)和人ES細(xì)胞典型的高核/細(xì)胞質(zhì)比。
附圖1e-h是免疫組織化學(xué)顯微照片，顯示在無飼養(yǎng)細(xì)胞的體系中，在來源于牛的纖連蛋白基質(zhì)上生長的人I-3和I-6ES細(xì)胞系，其表面標(biāo)記物的表達(dá)情況，該標(biāo)記物的表達(dá)是未分化細(xì)胞的典型特征。熒光圖象分別顯示在存在TF的條件下生長傳代17次并用抗-SSEA4抗體標(biāo)記的人ES細(xì)胞(I-3細(xì)胞系)(附圖1e，尺寸條代表50μm)；在存在TLF的條件下生長傳代38次并用抗-SSEA4抗體標(biāo)記的I-3ES細(xì)胞(附圖1f，尺寸條代表6μm)；在存在TLF的條件下生長傳代30次并用抗-TRA-60抗體標(biāo)記的I-6ES細(xì)胞(附圖1g，尺寸條代表6μm)；在存在TF的條件下生長傳代21次并用抗-TRA-81抗體標(biāo)記的I-3ES細(xì)胞(附圖1h，尺寸條代表6μm)。獲取熒光圖象既可以使用倒置熒光顯微鏡(附圖1e)，也可以使用共聚焦顯微鏡(附圖1f-h)。
附圖2a-c顯示在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系下，在牛來源的纖連蛋白基質(zhì)上生長的hES細(xì)胞在體外的分化情況。顯示無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中生長的細(xì)胞所衍生出的EBs組織切片。附圖2a是24小時(shí)時(shí)的簡單EB，來源于在TF中生長傳代28次后的I-3細(xì)胞系(尺寸條代表100μm)；附圖2b是14天的EB，其來源于在TF中生長傳代28次后的I-3細(xì)胞系(尺寸條代表50μm)；附圖2c是14天的EB，其來源于在TLF中生長傳代30次的I-3細(xì)胞系(尺寸條代表25μm)。注意EB的外部保護(hù)上皮(附圖2b，箭頭)和由柱形上皮組成的被間充質(zhì)組織包圍的球狀結(jié)構(gòu)(附圖2c)。
附圖2d-f顯示在本發(fā)明的無飼養(yǎng)細(xì)胞體系中，在不同條件培養(yǎng)基下在牛來源的纖連蛋白基質(zhì)上生長的ES細(xì)胞所形成的14天的Ebs的細(xì)胞中，中胚層和外胚層代表性標(biāo)記物的表達(dá)情況。用不同的抗體探針對來源于各種ES細(xì)胞系的EB細(xì)胞進(jìn)行熒光免疫染色。附圖2d顯示在TLF中生長傳代22次的I-6細(xì)胞系，對其進(jìn)行免疫染色使用的是抗神經(jīng)特異性微管蛋白的抗體(尺寸條代表6μm)。附圖2e顯示在TLF中生長傳代30次的I-3細(xì)胞系，對其免疫染色使用的是抗平滑肌肌動蛋白的抗體(尺寸條代表6μm)。附圖2f顯示在TF中生長傳代28次的I-3細(xì)胞系，對其免疫染色使用的是抗CD-31的抗體(尺寸條代表6μm)。
附圖3顯示了用RT-PCR確定I-3或I-6ES細(xì)胞和由其形成的胚胎樣小體(EBs)的分化階段，其中I-3和I-6ES細(xì)胞是在無飼養(yǎng)細(xì)胞體系中在來源于牛的纖連蛋白基質(zhì)上生長的。從I-3、I-6ES細(xì)胞或由其形成的EBs中提取RNA樣品，然后對該樣品進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。泳道1顯示在TF中生長傳代19次的I-3ES細(xì)胞；泳道2顯示在TLF中生長傳代20次的I-3ES細(xì)胞；泳道3顯示在TLF中生長傳代23次的I-3ES細(xì)胞所衍生出的14天的EBs；泳道4顯示在TF中生長傳代28次的I-3ES細(xì)胞所衍生出的14天的EBs；泳道5顯示在TLF中生長傳代30次的I-3ES細(xì)胞所衍生出的14天的EBs；泳道6顯示在TLF中生長傳代29次的I-3ES細(xì)胞所衍生出的14天的EBs；泳道7顯示在TLF中生長傳代22次的I-6ES細(xì)胞所衍生出的14天的EBs。在不存在RNA的情況下驗(yàn)證上述反應(yīng)的特異性(附圖3，泳道8)。注意泳道3-6的EBs樣品來自于四種不同批次的I-3ES細(xì)胞。
附圖4a-c顯示I-3和I-6ES細(xì)胞系在無飼養(yǎng)細(xì)胞的含TLF的體系中在牛來源的纖連蛋白基質(zhì)上分別生長傳代26次和19次后，所衍生出的畸胎瘤的組織切片。畸胎瘤切片包括有髓神經(jīng)(附圖4a)、透明軟骨的細(xì)節(jié)(附圖4b)和杯形細(xì)胞中富含的分泌性上皮(附圖4c)。尺寸條代表25μm。
附圖5a-c是形態(tài)學(xué)顯微照片，顯示在無飼養(yǎng)細(xì)胞的體系中在人來源的纖連蛋白基質(zhì)上生長的ES細(xì)胞的集落。顯示的是在存在血清替代品和TF生長因子組合的條件下在人細(xì)胞纖連蛋白上生長傳代22次的I-3ES細(xì)胞系的亮區(qū)圖像。
附圖5d-f是免疫組織化學(xué)顯微照片，顯示在無飼養(yǎng)細(xì)胞體系中，在人來源的纖連蛋白基質(zhì)上生長的人I-3和H-9ES細(xì)胞系，其表面標(biāo)記物的表達(dá)情況，該標(biāo)記物的表達(dá)是未分化細(xì)胞特有的。熒光圖象分別顯示在存在TF的條件下，在人細(xì)胞纖連蛋白上培養(yǎng)傳代16次，并用抗-TRA-1-60抗體(附圖5d)或抗-TRA-1-81抗體(附圖5e)標(biāo)記的人I-3ES細(xì)胞系；在存在TLF的條件下，在人血漿纖連蛋白上培養(yǎng)傳代10次，并用抗-SSEA4抗體標(biāo)記的人H-9ES細(xì)胞系(附圖5f)。
附圖6a-c顯示在無異源、無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，在人纖連蛋白基質(zhì)上生長的hES細(xì)胞在體外的分化情況。圖象顯示在不同培養(yǎng)條件下生長的I-3ES細(xì)胞所衍生出的14天時(shí)的EBs。附圖6a是在存在TLF生長因子條件下，在人細(xì)胞纖連蛋白基質(zhì)上生長傳代17次；附圖6b是在存在TF生長因子條件下，在人細(xì)胞纖連蛋白基質(zhì)上生長傳代17次；附圖6c是在存在TLF生長因子條件下，在人血漿纖連蛋白基質(zhì)上生長傳代16次。
附圖7顯示通過RT-PCR確定I-3ES細(xì)胞和由其形成的胚胎樣小體(EBs)的分化階段，其中I-3ES細(xì)胞是在無飼養(yǎng)細(xì)胞體系中在來源于人的纖連蛋白基質(zhì)上生長的。從I-3ES細(xì)胞或由其形成的EBs中提取RNA樣品，然后對該樣品進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。泳道1顯示在TF中生長傳代22次的I-3ES細(xì)胞；泳道2顯示在TLF中生長傳代18次的I-3ES細(xì)胞；泳道3顯示在TLF中生長傳代17次的I-3ES細(xì)胞；泳道4顯示在TF中生長傳代17次的I-3ES細(xì)胞所衍生出的14天的EBs；泳道5顯示在TLF中生長傳代17次的I-3ES細(xì)胞所衍生出的14天的EBs；泳道6顯示在TLF中生長傳代16次的I-3ES細(xì)胞所衍生出的14天的EBs。在不存在RNA的情況下驗(yàn)證上述反應(yīng)的特異性(附圖7，泳道7)。
附圖8a-c顯示I-3(附圖8a)、I-6(附圖8b)和H-9(附圖8c)hES細(xì)胞系在不同培養(yǎng)條件下的生長速度。顯示了I-3、I-6和I-9hES細(xì)胞系在如下培養(yǎng)條件下的生長速度，分別是在存在TLF(分別是附圖8a、b和c的粉紅曲線)或TF生長因子組合(分別是附圖8a、b和c的黑色曲線)的條件下，在牛纖連蛋白基質(zhì)上培養(yǎng)；在存在TF生長因子組合的條件下，在人纖連蛋白基質(zhì)上(分別是附圖8a、b和c的亮藍(lán)色曲線)，或在MEFs飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)(分別是附圖8a、b和c的暗藍(lán)色曲線)。
附圖8d是柱狀圖，顯示不同的培養(yǎng)條件維持未分化hES細(xì)胞生長的能力。人ES細(xì)胞是在如下的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)；牛纖連蛋白，在存在TGFβ、LIF和bFGF(TLF BF)條件下；人纖連蛋白，在存在TGFβ、LIF和bFGF(TLF BF)條件下；牛纖連蛋白，在存在TGFβ和bFGF(TF BF)條件下；人纖連蛋白，在存在TGFβ和bFGF(TF BF)條件下；牛纖連蛋白，在存在LIF和TGFβ(LT)條件下；牛纖連蛋白，在存在LIF和bFGF(LF)條件下；牛纖連蛋白，在單獨(dú)存在TGFβ(T)條件下；和牛纖連蛋白，在單獨(dú)存在bFGF(F)的條件下。以兩天的增長測定未分化細(xì)胞的百分率。
附圖9a-f顯示在無飼養(yǎng)細(xì)胞體系中在不同的培養(yǎng)條件下生長的人ES細(xì)胞和人ES細(xì)胞集落。顯示的是在無飼養(yǎng)細(xì)胞體系中生長的各種ES細(xì)胞系的亮區(qū)圖像。附圖9a顯示在存在TLF條件下，在包皮基質(zhì)上生長傳代5次的I-6細(xì)胞系(尺寸條表示75μm)；附圖9b顯示在存在MEF條件培養(yǎng)基的條件下，在MatrigelRTM上生長傳代12次的I-3.2細(xì)胞系(尺寸條表示50μm)；附圖9c顯示在存在TLF條件下，在MEF基質(zhì)上生長傳代幾次的I-6細(xì)胞系(尺寸條表示75μm)；附圖9d顯示在存在TF條件下，在纖連蛋白上生長傳代21次的I-3細(xì)胞系(尺寸條表示50μm)；附圖9e顯示在存在TLF條件下，在MatrigelRTM上生長傳代12次的I-6細(xì)胞系(尺寸條表示75μm)；附圖9f顯示在存在TF條件下，在纖連蛋白上生長傳代20次的I-3細(xì)胞系(尺寸條表示38μm)。
附圖10a-f顯示在纖連蛋白(附圖10a和b)、MEF基質(zhì)(附圖10c、e和f)或MatrigelRTM(附圖10d)上生長的I-6和I-3ES細(xì)胞系在SCID-beige小鼠中所形成的畸胎瘤的組織切片。用蘇木精和曙紅對畸胎瘤切片進(jìn)行染色，包括類似腸的上皮，包括杯形細(xì)胞(附圖10a)、成熟軟骨組織(附圖10b和c)、胚胎肌管(附圖10d)、分層的表皮(附圖10e)和有髓神經(jīng)(附圖10f)。尺寸條表示40μm。
優(yōu)選實(shí)施方式的說明本發(fā)明涉及使用無飼養(yǎng)細(xì)胞、無異源的培養(yǎng)條件來建立和繁殖人胚胎干細(xì)胞系的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及不含異源污染物、能夠在培養(yǎng)中維持其未分化、多能性和可增殖狀態(tài)，并由此高度適用于人類治療用途的人胚胎干細(xì)胞系。
參考附圖和隨后的說明，將能夠更好地理解本發(fā)明所提供制備不含飼養(yǎng)細(xì)胞和異源污染物的人胚胎干細(xì)胞系的方法的原理和操作過程。
在對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明之前，應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明在應(yīng)用方面并不局限于本申請下面的詳細(xì)說明或作為舉例的實(shí)施例的細(xì)節(jié)。本發(fā)明還可以具有其它的實(shí)施方式，可以通過各種途徑來實(shí)施和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。另外，還應(yīng)當(dāng)理解，本申請所使用的措辭和術(shù)語僅用于描述本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制。
為了使人ES細(xì)胞維持其未分化的狀態(tài)，ES培養(yǎng)物必須為細(xì)胞提供使其維持細(xì)胞增殖、抑制ES細(xì)胞分化、并保持多能性的條件。典型的培養(yǎng)條件是通過使用飼養(yǎng)細(xì)胞層而獲得的，其中該細(xì)胞層能夠分泌干細(xì)胞增殖所需的因子、并同時(shí)抑制干細(xì)胞分化。
為了克服與使用飼養(yǎng)細(xì)胞層相關(guān)的局限性，如飼養(yǎng)細(xì)胞污染、不確定的培養(yǎng)體系，人們發(fā)展了更加確定的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系。在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系中使用了基質(zhì)和培養(yǎng)基，ES細(xì)胞附著在基質(zhì)上，培養(yǎng)基為ES細(xì)胞提供細(xì)胞增殖所需的細(xì)胞因子和生長因子并同時(shí)抑制細(xì)胞分化。
常用的基質(zhì)包括從Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的基底膜產(chǎn)品(如MatrigelRTM)、或牛纖連蛋白/層粘連蛋白。這樣的基質(zhì)通常添加小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)條件培養(yǎng)基，或添加了牛血清和生長因子的人工合成條件培養(yǎng)基。
先前使用無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系來培養(yǎng)人ES細(xì)胞的嘗試中，使用了添加新鮮培養(yǎng)基和生長因子混合物的MatrigelRTM或?qū)诱尺B蛋白基質(zhì)(美國專利申請?zhí)?0030017589)?？墒牵鲜鰺o飼養(yǎng)細(xì)胞基質(zhì)是來源于動物的組織，因而有可能使人ES細(xì)胞暴露于動物性病原體之下。另外，上述試驗(yàn)中聯(lián)合使用了六種不同的生長因子，其濃度非常高，有可能對所培養(yǎng)的細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。事實(shí)上，根據(jù)美國專利申請?zhí)?0030017589的描述，ES細(xì)胞的倍增時(shí)間大約為19個(gè)小時(shí)，這提示了腫瘤源性表型。此外，在上述培養(yǎng)條件下，在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系中經(jīng)過14次傳代后，表現(xiàn)出未分化細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞僅為50-70％。
這樣的培養(yǎng)條件對于研究目的可能是適用的，但如果是應(yīng)用于人類的細(xì)胞置換治療或組織再生，則必須在非常明確的基本上不含動物成分的條件下培養(yǎng)人ES細(xì)胞。
在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人設(shè)計(jì)出了不含異源污染物、同時(shí)還能使人干細(xì)胞在培養(yǎng)中維持至少38次傳代的無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件。正如下面實(shí)施例部分所描述的，在上述條件下干細(xì)胞系保持了所有ES細(xì)胞的特性，包括多能性、不死亡、未分化的增殖能力和正常的核型。因此，本發(fā)明的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系首次提供了一種完全無動物成分的培養(yǎng)環(huán)境，其能夠使人ES細(xì)胞處于增殖狀態(tài)同時(shí)又保持ES多能性的時(shí)間至少維持38次傳代。另外，在上述條件下培養(yǎng)的ES細(xì)胞，其中有超過85％的細(xì)胞表現(xiàn)出未分化細(xì)胞形態(tài)，其倍增時(shí)間在30-35小時(shí)之間。
因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種建立能夠維持其未分化、多能性和增殖狀態(tài)，并基本上不含異源污染物的人胚胎干細(xì)胞系的方法。
在此所使用的短語“干細(xì)胞系”指的是這樣的細(xì)胞，其能夠分化為具有特殊、專門功能的其它類型的細(xì)胞(即“完全分化”的細(xì)胞)，或能夠維持未分化狀態(tài)的細(xì)胞，下文稱為“多能性干細(xì)胞”。
本發(fā)明的干細(xì)胞可以是來自任意年齡個(gè)體骨髓組織或新生個(gè)體臍帶血的造血干細(xì)胞，還可以是來自妊娠后所形成的胚胎組織(如胚泡)的胚胎干細(xì)胞(ES)，或者是胚胎生殖細(xì)胞(EG)。干細(xì)胞的衍生和制備方法將在后面加以描述。本發(fā)明優(yōu)選的干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，實(shí)施該方法的過程是獲取人胚胎干細(xì)胞，然后在無飼養(yǎng)細(xì)胞、包括基質(zhì)和含有生長因子的組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞，從而建立起人胚胎干細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的上述方面，培養(yǎng)過程是將干細(xì)胞平鋪到基質(zhì)上，細(xì)胞的密度應(yīng)當(dāng)是能夠有利于細(xì)胞生存和增殖、同時(shí)限制其分化的密度。典型的，所采用的鋪板密度在約15,000細(xì)胞/cm2和約200,000細(xì)胞/cm2之間。
可以理解，雖然一般采用干細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液接種，但也可以采用小的細(xì)胞簇。對于后者，使用酶消化細(xì)胞簇，使細(xì)胞簇?cái)嚅_(參見下面實(shí)施例部分的實(shí)施例1)，在干細(xì)胞完全分散之前終止酶解，然后用洗液管將細(xì)胞搗碎，形成細(xì)胞團(tuán)(即10-200個(gè)細(xì)胞)。但是，需要進(jìn)行檢測以避免產(chǎn)生巨大的、能夠?qū)е录?xì)胞分化的細(xì)胞簇。
可以使用公知的細(xì)胞培養(yǎng)方法來獲得本發(fā)明的干細(xì)胞。例如，可以從人胚泡分離出人胚胎干細(xì)胞。典型的，人胚泡獲自人體內(nèi)植入前胚胎或獲自體外受精(IVF)胚胎。可選擇的，可以將單細(xì)胞的人胚胎擴(kuò)展到胚泡階段。為了分離人ES細(xì)胞，去掉胚泡上的透明帶，并利用免疫外科手術(shù)方法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)，其中將滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞裂解，并用微量吸管將其從完整ICM中去除。然后將TCM平鋪到含有能夠使之長出生長暈的合適條件培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中。9-15天之后，采用物理分離方法或酶降解的方法，將ICM衍生的生長暈分離成細(xì)胞團(tuán)，然后再將細(xì)胞平鋪到新鮮的組織培養(yǎng)基上。用微量吸管挑選出表現(xiàn)為未分化形態(tài)的克隆，采用物理方法將其分離為細(xì)胞團(tuán)，然后再進(jìn)行平板培養(yǎng)。將所得到的ES細(xì)胞每1-2周進(jìn)行一次例行分離。要想獲得更加詳細(xì)的制備人ES細(xì)胞的方法，請參見下述文獻(xiàn)，Thomson等，[美國專利號5,843,780；Science 2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995]；Bongso等，[Hum Reprod 4706，1989]；Gardner等，[Fertil.Steril.6984，1998]。
可以理解，根據(jù)本發(fā)明的上述方面，還可以使用商品化干細(xì)胞。可以從NIH人胚胎干細(xì)胞登記處購買人ES細(xì)胞(http//escr.nih.gov)。商品化的胚胎干細(xì)胞系實(shí)例包括但不限于BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03和TE32。
本發(fā)明使用的干細(xì)胞還可以衍生自人胚胎生殖(EG)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，從來自人妊娠約8-11周胎兒的原生殖細(xì)胞制備人EG細(xì)胞。分離生殖嵴，將其切成小塊，然后使用機(jī)械分裂方法將其分解為細(xì)胞。然后在含有合適條件培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)瓶中使EG細(xì)胞生長。在培養(yǎng)上述細(xì)胞時(shí)，每天更換條件培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)與EG細(xì)胞一致的細(xì)胞形態(tài)，一般要經(jīng)過7-30天或1-4次傳代。更加詳細(xì)的制備人EG細(xì)胞的方法，參見下述文獻(xiàn)，Shamblott等，[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998]，和美國專利號6,090,622。
正如上面所提到的，優(yōu)選使用無飼養(yǎng)細(xì)胞體系培養(yǎng)干細(xì)胞，該無飼養(yǎng)細(xì)胞體系包括的是基質(zhì)，而不是飼養(yǎng)細(xì)胞層。在此所使用的術(shù)語“基質(zhì)”指的是能夠代替飼養(yǎng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)細(xì)胞附著功能的任意基質(zhì)。典型的，這樣的基質(zhì)包含可以使干細(xì)胞附著的細(xì)胞外成分，從而提供合適的培養(yǎng)基層(substrate)。
特別適用于本發(fā)明使用的是來自基底膜的細(xì)胞外基質(zhì)成分，或形成粘著分子受體-配體偶聯(lián)部分的細(xì)胞外基質(zhì)成分。Matrigel，一種商品化的基質(zhì)(Becton Dickinson，USA)，是適于本發(fā)明使用的一個(gè)實(shí)例。Matrigel是來自Engelbreth-Holm-Swarm瘤細(xì)胞的一種可溶性產(chǎn)品，在室溫下成為凝膠狀，形成一種重構(gòu)基底膜；Matrigel還是一種生長因子減少的產(chǎn)品。適用于本發(fā)明的其它細(xì)胞外基質(zhì)成分和成分混合物包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、觸覺蛋白(eatactin)、硫酸乙酰肝素等，單獨(dú)使用一種或聯(lián)合使用幾種。本發(fā)明優(yōu)選的基質(zhì)是來源于纖連蛋白的基質(zhì)。
當(dāng)需要完全不含動物成分的培養(yǎng)條件時(shí)，優(yōu)選人來源的基質(zhì)或使用重組技術(shù)人工合成的基質(zhì)。例如，這樣的基質(zhì)包括人來源的纖連蛋白、重組纖連蛋白、人來源的層粘連蛋白、包皮成纖維細(xì)胞基質(zhì)或人工合成的纖連蛋白基質(zhì)。人來源的纖連蛋白可以是血漿纖連蛋白，或是細(xì)胞纖連蛋白，上述兩種纖連蛋白均可以從Sigma，St，Louis，MO，USA購買。人來源的層粘連蛋白和包皮成纖維細(xì)胞基質(zhì)也可以從上述公司購買。人工合成纖連蛋白基質(zhì)同樣也可以從上述公司購買。
基質(zhì)蛋白的重組合成可以使用表達(dá)載體來進(jìn)行。將編碼基質(zhì)蛋白(如人血漿纖連蛋白)的多核苷酸片段連接到市售的、適于轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞如HeLa細(xì)胞，并適于指導(dǎo)該酶在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體上?？梢岳斫?，可以通過常規(guī)的重組技術(shù)修飾上述市售載體系統(tǒng)，以取代、復(fù)制或突變現(xiàn)有的啟動子或增強(qiáng)子，和/或?qū)肫渌郊拥亩嗪塑账嵝蛄?，如編碼額外選擇標(biāo)記的序列、或編碼報(bào)告多肽的序列，等等。
合適的哺乳動物表達(dá)載體包括，但不限于，購自Invitrogen公司的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pZeoSV2(+-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1，購自Promega公司的pCI，購自Strategene公司的pBK-CMV，購自Clontech公司的pTRES，以及它們的衍生物。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，培養(yǎng)基包括細(xì)胞增殖所需的細(xì)胞因子和生長因子[如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)]，以及抑制干細(xì)胞分化的因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)。
上述培養(yǎng)基可以是添加了血清、血清替代品和/或生長因子的人工合成組織培養(yǎng)基，如KoDMEM(Gibco-Invitrogen Corporationproducts，Grand Island，NY，USA)。
血清可以是任意來源的血清，包括胎牛血清、山羊血清或人血清。為了給人ES細(xì)胞培養(yǎng)提供一種不含動物成分的環(huán)境，優(yōu)選使用人血清或血清替代品TM(Gibco-Invitrogen Corporation，Grand Island，NYUSA)。
血清替代品TM包括白蛋白或白蛋白替代品、氨基酸、維生素、鐵傳遞蛋白或鐵傳遞蛋白替代品、抗氧化劑、胰島素或胰島素替代品、膠原前體和微量元素(國際專利
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