人間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在抗組織纖維化及瘢痕形成中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物研發(fā)，細胞生物學、分子生物學領(lǐng)域。其設及人廝帶間充質(zhì)干細胞 來源的外泌體，可用于多種情況，包括括抗組織器官纖維化、癒痕過度形成W及皮膚關(guān)節(jié)的 癒痕粘連等。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌成纖維細胞(myofibroblast)是一種表達平滑肌肌動蛋白（a-SMA)的由成纖維 細胞高度分化而來的細胞，它參與了纖維化級聯(lián)反應中纖維形成和細胞外基質(zhì)重塑兩個階 段（Van De Water L,Varney S,Tomasek JJ,Mechanoregulation of the Myofibroblast in Wound Contraction,Scarring,and Fibrosis:Opportunities for NewTherapeutic Intervention.2013 May;2(4):122-141)cTomasek(Tomasek JJ,Gabbiani G，Him B，et al.Myofibmblas and mechalno-regulation of connective tissue remodelling.Nat Rev Mol Cell Biol.2002 May;3(5) :349-63.)等指出，肌成纖維細胞是創(chuàng)面肉芽收縮和纖 維收縮性疾病主要的細胞，它的功能是產(chǎn)生力量和改變組織張力。運些細胞大量分泌膠原、 纖維連接蛋白、生長因子和各種酶類。在傷口愈合和纖維化的細胞外基質(zhì)中主要負責組織 收縮。當組織由于氧化應激、低氧狀態(tài)、炎癥、調(diào)亡等刺激而受到損傷時，雖然通過用細胞外 基質(zhì)將損傷組織置換而試圖進行修復，但當損傷很嚴重時或者該刺激變?yōu)槁曰瘯r等，組 織無法充分地發(fā)揮其功能，肌成纖維細胞分化則不受調(diào)控進而引起不適當或過度的纖維結(jié) 締組織生成，即一種被統(tǒng)稱為纖維化的過程。運樣的疾病和病癥包括纖維化肝病、肝硬化、 屯、臟纖維化和肺纖維化(包括特發(fā)性肺纖維化）。而在皮膚損傷引起的過度癒痕增生，在關(guān) 節(jié)部位引起的癒痕粘連李縮都可W-并認為肌成纖維細胞的過度增生。更有文獻表明它的 存在與促進腫瘤生長也有直接關(guān)系（Van De Water L,Varney S,Tomasek JJ, Mechanoregulation of the Myofibroblast in Wound Contraction, Scarring, and Fibrosis:Opportunities for NewTherapeutic Intervention.2013 May;2(4):122-141; Junker JPl, Kratz C , Tollback A , Kratz G , echanical tension stimulates the transdifferentiation of fibroblasts into myofibroblasts in human burn scars .Burns. 2008 Nov; ；34(7): 942-6.)。
[0003] 近年來，干細胞相關(guān)機制及應用的研究在創(chuàng)面修復領(lǐng)域有了新的突破。研究表明 (Heldin CH,LandstrSm !,Moustakas A.Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest ,apoptosis ,and epithe11ial-mesenchymal transition!! J]. Curr Opin Cell Biol，2009，21:166-176)，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能夠促進組織 器官創(chuàng)傷的愈合并且能夠括抗癒痕過度形成。其機制包括（I)在創(chuàng)面的局部微環(huán)境下可W 誘導分化為創(chuàng)面修復所必需的成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞和血管內(nèi)皮細胞等。（2)具有抗 炎、免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制作用，可通過調(diào)控創(chuàng)傷局部的炎癥反應調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合（Zhang Q， Shi S,Liu Y，et al.Mesenchymal stem cells derived from human gingiva are capable of immunomodulatory functions and ameliorate inflammation-related tissue destruction in experimental colitis[J].J Immunol，2009，183(12):7787- 7798)。（3)幾乎可W自分泌或旁分泌創(chuàng)面修復需要的所有細胞因子或生長因子。促進創(chuàng)傷 局部或循環(huán)中的細胞遷移、增殖和新血管形成。尤其可W調(diào)控TGF-齡田胞因子的表達。在癒 痕增生W及許多內(nèi)臟器官的纖維化過程中TGF-0/SMAD信號通路廣泛存在并起到重要作用 (Heldin CH,LandstrSm !,Moustakas A.Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest ,apoptosis ,and epithe11ial-mesenchymal transition!! J]. Curr Opin Cell Biol，2009，21:166-176)，當肌成纖維細胞過度聚集時，SMAD2和SMAD3過度表達并且呈高 憐酸化水平，干擾它們的表達可調(diào)控成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化繼而減輕過度纖維 化。然而，MSC本身并不易于儲存并且活性隨時間推移急劇下降，并且在移植入體內(nèi)后存在 安全性問題，長期使用甚至有致瘤隱患，極大的限制了臨床應用，尋找能夠替代MSC在組織 損傷修復括抗纖維化W及癒痕過度增生的生物材料或干細胞制品顯得十分迫切。
[0004] 外泌體(exosome)作為是一種脂質(zhì)雙分子膜包裹的小囊泡，由細胞的多囊體與質(zhì) 膜融合后，W胞吐的方式釋放到胞外環(huán)境中。其成分較復雜，表面含有大量與其來源和功能 密切相關(guān)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分（Simpson RJ，Lira JW，Mo;ritz I?L，et.Exosomes:p;roteomic insights and diagnostic potential[J].Expert Rev Proteomics,2009,6(3)：267- 283)。當外泌體和祀細胞融合后，它會把諸如受體和配體等重要的生物分子運輸?shù)届爰毎?并將其釋放（Record M，Subra C，Silvente - Poirot S,et 01.Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectom[J].Biochem Pharmaeol， 2011,81(10) = 1171-1182)。其轉(zhuǎn)運在調(diào)節(jié)多種細胞的增殖、分化、調(diào)亡等過程中發(fā)揮作用。 后續(xù)的研究又證實外泌體在高溫、缺氧、各種pH環(huán)境、反復凍融等惡劣條件下仍能保持穩(wěn) 定，還能對抗RNase的作用。
[0005] 外泌體作為非細胞的微囊泡，可將間充質(zhì)干細胞來源的活性成分如蛋白，核酸等 包裹并保持其完整性（Umezu T，0hyashiki KJuroda M，et al.Leukemia cell to endothelial cell communication via exosomal miRNAs[J].Oncogene，2013，32(22): 2747-55.)，穩(wěn)定地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞中，并在新的細胞中發(fā)揮功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀W及體內(nèi)體外實驗基礎，我們發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源的外泌 體中的核酸W及蛋白阻斷了 TGF-0/Smads信號傳導通路，抑制了 TGF-0誘導成纖維細胞向肌 成纖維細胞的分化，阻止肌成纖維細胞在組織損傷后過度聚集，減少膠原沉積，細胞外基質(zhì) 降解增強，從而起到抗纖維化的作用。與傳統(tǒng)的細胞治療相比，它的安全系數(shù)和穩(wěn)定性更 高，可W為癒痕過度增生W及器官組織纖維化的提供新的祀向治療方案。
[0007] 本發(fā)明的目的在于（1)提供間充質(zhì)干細胞來源的外泌體的制備方法；（2)提供包含 間充質(zhì)來源的外泌體的組合物的制備方法；（3)提供間充質(zhì)干細胞來源的外泌體及其組合 物對于括抗癒痕和/或組織器官纖維化的用途。
[0008] 本發(fā)明中所提到的間質(zhì)干細胞來源的外泌體及其組合物均為無菌產(chǎn)品，間充質(zhì)干 細胞主要為骨髓及廝帶，資源獲取便捷，其分泌的外泌體可W作為干細胞治療的有效替代 品，具有極佳的臨床應用價值。
[0009] 本發(fā)明的第一方面提供了間充質(zhì)干細胞來源的外泌體。
[0010] 本發(fā)明所述的外泌體，優(yōu)選為廝帶來源的間充質(zhì)干細胞分泌的。
[0011] 其制備方法步驟如下：
[0012] (1)間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)、擴增：1)取新鮮廝帶，經(jīng)憐酸鹽緩沖液反復沖洗后， 浸泡于含有1 %青鏈霉素的kDMEM約5分鐘，剪成直徑約1.5mm大小的組織塊;含10 %胎牛血 清心016