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一種代謝綜合征的大鼠模型建立方法與流程

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一種代謝綜合征的大鼠模型建立方法與流程

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體地說(shuō),涉及一種由高脂高糖飲食與灌胃玉米油聯(lián)合暴露致大鼠代謝綜合征模型的建立方法。



背景技術(shù):

代謝綜合征,是指人體的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)發(fā)生代謝紊亂,是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群,在臨床上出現(xiàn)一系列綜合征,即稱代謝綜合征。其病因目前認(rèn)為是多基因和環(huán)境相互作用的結(jié)果,與遺傳、免疫等均有密切關(guān)系。其具有以下特點(diǎn):1.多種代謝紊亂集于一身,包括肥胖、高血糖、高血壓、血脂異常、高血黏、高尿酸、高脂肪肝發(fā)生率和高胰島素血癥,這些代謝紊亂是心、腦血管病變以及糖尿病的病理基礎(chǔ)??梢?jiàn)糖尿病不是一個(gè)孤立的病,而是代謝綜合征的組成部分之一。2.有共同的病理基礎(chǔ),目前多認(rèn)為它們的共同原因就是肥胖尤其是中心性肥胖所造成的胰島素抵抗和高胰島素血癥。3.可造成多種疾病增加,如高血壓、冠心病、腦卒中、甚至某些癌癥,包括與性激素有關(guān)的乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌,以及消化系統(tǒng)的胰腺癌、肝膽癌、結(jié)腸癌等。4.有共同的預(yù)防及治療措施,防治住一種代謝紊亂,也就有利于其他代謝紊亂的防治。由于代謝綜合征中的每一種成分都是心血管病的危險(xiǎn)因素,它們的聯(lián)合作用更強(qiáng),所以有人將代謝綜合征稱為“死亡四重奏”(中心性肥胖、高血糖、高甘油三酯血癥和高血壓),因此代謝綜合征是對(duì)一組高度相關(guān)疾病的概括性和經(jīng)濟(jì)的診斷與治療的整體概念。在實(shí)驗(yàn)中建造代謝性綜合癥的模型為實(shí)驗(yàn)研究提供科學(xué)指導(dǎo)。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

為了研究和學(xué)習(xí)代謝綜合征導(dǎo)致的病理特征,制備其大鼠模型,本發(fā)明提供了一種由高脂高糖飲食與灌胃玉米油聯(lián)合暴露致大鼠代謝綜合征模型的建立方法,包括以下步驟:

步驟1:購(gòu)買spf級(jí)sd大鼠40只,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為兩組,分別為高脂飼料的造模組、普通飼料的對(duì)照組;

步驟2:按照配方進(jìn)行制備高脂飼料和普通飼料,對(duì)造模組給予高脂飼料飼養(yǎng),對(duì)照組給予普通飼料飼養(yǎng);每日按飼料/體重=8g/100g投放飼料,自由攝食、飲水;

步驟3:每周定時(shí)對(duì)大鼠體重進(jìn)行空腹監(jiān)測(cè);每四周對(duì)大鼠進(jìn)行空腹血糖水平監(jiān)測(cè);

步驟4:每日早8點(diǎn)對(duì)大鼠按體重每kg進(jìn)行空腹灌胃玉米油5ml;

步驟5:飼養(yǎng)到第10周對(duì)每組隨機(jī)抽取4只大鼠進(jìn)行肝臟b超檢測(cè)是否有脂肪肝形成;

步驟6:飼養(yǎng)90天后,將大鼠禁食12h,按大鼠體重每kg進(jìn)行空腹灌50%葡萄糖溶液2mg,分別于葡萄糖負(fù)荷后0min,15min,30min,60min,120min采血用血糖分析儀測(cè)定葡萄糖水平,繪制ogtt曲線;飼養(yǎng)90天后,將大鼠禁食12h,按大鼠體重每kg進(jìn)行腹腔注射生物合成胰島素0.75iu,分別于胰島素注射后0min,15min,30min,60min,120min尾靜脈采血,利用血糖分析儀測(cè)定血糖水平;然后將大鼠進(jìn)行剖殺取材。

所述步驟2中飼料配方為:

普通組飼料:63.02%碳水化合物,24.93%蛋白質(zhì),12.05%脂肪;

高脂高糖組飼料:66.14%碳水化合物,10.33%蛋白質(zhì),23.53%脂肪。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)為一種由高脂高糖飲食與灌胃玉米油聯(lián)合暴露致大鼠代謝綜合征模型的建立。在飼養(yǎng)大鼠的過(guò)程以5ml/kg體重進(jìn)行玉米油灌胃,模擬人群高脂高糖不良飲食習(xí)慣的生活方式、誘導(dǎo)代謝綜合征模型的建立,與人群代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展較為接近。且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物代謝綜合征相關(guān)癥狀和機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變也與人類相似,動(dòng)物模型穩(wěn)定性較好,更有助于代謝綜合征機(jī)制及藥物治療研究。實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇sd大鼠,種屬純正,是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最為常見(jiàn)的大鼠類別,該動(dòng)物模型可向外界提供一定的參考。

附圖說(shuō)明

此處所說(shuō)明的附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解,構(gòu)成本發(fā)明的一部分,本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明,并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中:

圖1是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的體重趨勢(shì)圖。

圖2是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的肝臟b超圖。

圖3是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的肝臟視覺(jué)檢查照片。

圖4是是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的肝he染色鏡下病理學(xué)檢測(cè)。

圖5是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的ogtt曲線圖。

圖6是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的itt變化。

圖7是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的胰腺he染色鏡下病理學(xué)檢測(cè)。

圖8是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的脂肪he染色鏡下病理學(xué)檢測(cè)。

圖9是本發(fā)明中實(shí)施例大鼠的脂肪組織鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)變化。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種由高脂高糖飲食與灌胃玉米油聯(lián)合暴露致大鼠代謝綜合征模型的建立方法,包括以下步驟:

spf級(jí)sd大鼠40只,雌雄各半,體重150g±10g,購(gòu)買第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):(scxk(渝)2012-0005))。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為兩組,分別為高脂飼料造模組(造模組)、普通飼料對(duì)照組(對(duì)照組)。

按照配方進(jìn)行制備高脂高糖飼料和普通飼料。對(duì)造模組給予高脂飼料飼養(yǎng),對(duì)照組給予普通飼料飼養(yǎng)。每日按8g/100g干飼料投放飼料,自由攝食、飲水。普通組飼料:63.02%碳水化合物,24.93%蛋白質(zhì),12.05%脂肪;高脂高糖組飼料:66.14%碳水化合物,10.33%蛋白質(zhì),23.53%脂肪;飲水為spring純水系統(tǒng)所制去離子水。

體重檢測(cè),每周定時(shí)對(duì)大鼠體重進(jìn)行空腹監(jiān)測(cè)

每日早八點(diǎn)對(duì)大鼠以5ml/kg進(jìn)行空腹灌胃玉米油。玉米油為山東魯花牌非轉(zhuǎn)基因物理壓榨玉米油。

飼養(yǎng)至第10周每組隨機(jī)抽取4只大鼠進(jìn)行肝臟b超測(cè)定是否有脂肪肝形成。動(dòng)物房備皮后送至遵義市第一人民醫(yī)院行彩色超聲檢查,檢查由主治醫(yī)師進(jìn)行并報(bào)告結(jié)果。結(jié)果包括有無(wú)脂肪肝及肝斜徑,肝斜徑測(cè)量方法如下:參考《超聲醫(yī)學(xué)》第六版,2014,388。實(shí)驗(yàn)大鼠10%水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉后取仰臥位,以肝右靜脈和肝中靜脈匯入下腔靜脈的右肋緣下肝臟測(cè)量肝臟右葉為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量切面測(cè)量。測(cè)量位置為:測(cè)量點(diǎn)分別置于肝右葉前、后緣之肝包膜處,測(cè)量其最大垂直距離即為肝斜徑。

空腹血糖水平實(shí)驗(yàn)開始后,于第0天、30天、60天、90天定期檢測(cè)空腹血糖水平(血糖儀檢測(cè)尾靜脈血)。

口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oralglueosetolerancetest,ogtt)于實(shí)驗(yàn)開始第90天對(duì)大鼠禁12h后,按2mg/kg劑量灌胃,給予50%葡萄糖溶液,分別于葡萄糖負(fù)荷后0min,15min,30min,60min,120min采血用血糖分析儀測(cè)定0min,15min,30min,60min,120min葡萄糖水平,繪制ogtt曲線。

胰島素耐量試驗(yàn)(insulintolerancetest,itt)于實(shí)驗(yàn)開始第90天對(duì)大鼠禁食12h后,按0.75iu/kg劑量腹腔注射方式給予生物合成胰島素,于胰島素注射后0min,15min,30min,60min,120min尾靜脈采血。利用血糖分析儀測(cè)定0min,15min,30min,60min,120min的血糖水平。計(jì)算胰島素注射后各時(shí)間點(diǎn)血糖值相對(duì)于注射前的血糖值的比率。

飼養(yǎng)大鼠至90天后,隔夜空腹稱重后麻醉剖殺取材,取腹主動(dòng)脈全血靜置兩小時(shí)后離心全自動(dòng)血生化分析檢測(cè)肝功、脂代謝指標(biāo),取完整肝臟、胰腺、脂肪仔細(xì)觀察肉眼形態(tài),放入生理鹽水中洗凈血液并用濾紙吸干,稱濕重計(jì)算臟器指數(shù),適當(dāng)組織于10%的多聚甲醛中固定,以石蠟包埋,連續(xù)切片,he染色鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變。

本發(fā)明中,一種由高脂高糖飲食與玉米油灌胃致大鼠代謝性綜合癥的模型建立詳述如下:

(1)體重變化每7天定期監(jiān)測(cè)體重。

(2)b超檢測(cè)大鼠灌胃至第70天,每組隨機(jī)抽取4只大鼠,動(dòng)物房備皮后送至遵義市第一人民醫(yī)院行彩色超聲檢查,檢查由主治醫(yī)師進(jìn)行并報(bào)告結(jié)果。結(jié)果包括有無(wú)脂肪肝及肝斜徑,肝斜徑測(cè)量方法如下:參考《超聲醫(yī)學(xué)》第六版,2014,388。實(shí)驗(yàn)大鼠10%水合氯醛(0.5ml/100g)麻醉后取仰臥位,以肝右靜脈和肝中靜脈匯入下腔靜脈的右肋緣下肝臟測(cè)量肝臟右葉為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量切面測(cè)量。測(cè)量位置為:測(cè)量點(diǎn)分別置于肝右葉前、后緣之肝包膜處,測(cè)量其最大垂直距離即為肝斜徑。

(3)肝臟視覺(jué)檢查剖殺大鼠時(shí),開腹后行肉眼觀察肝臟大體形態(tài)、大小,顏色,食指、中指并攏,以指腹觸摸感受肝臟質(zhì)地,取血后取肝臟觸摸肝臟切面。與對(duì)照組比較,普通飲食組低、中劑量組肝臟大小無(wú)肉眼可見(jiàn)區(qū)別,肝臟呈深紅色,質(zhì)軟,肝韌帶附近無(wú)明顯脂肪組織,高劑量則呈現(xiàn)出輕度包膜緊張,切面輕微油膩感。

(4)臟器系數(shù)灌胃飼養(yǎng)90天后隔夜空腹稱重后麻醉大取完整肝臟于生理鹽水中洗凈,用濾紙擦干稱重并計(jì)算肝體指數(shù)。肝臟系數(shù)=肝濕重/末次體重×100%

(5)空腹血糖水平實(shí)驗(yàn)開始后,于第0天、30天、60天、90天定期檢測(cè)空腹血糖水平(血糖儀檢測(cè)尾靜脈血)。

(6)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oralglueosetolerancetest,ogtt)于實(shí)驗(yàn)開始第90天對(duì)大鼠禁12h后,按2mg/kg劑量灌胃,給予50%葡萄糖溶液,分別于葡萄糖負(fù)荷后0min,15min,30min,60min,120min采血用血糖分析儀測(cè)定0min,15min,30min,60min,120min葡萄糖水平,繪制ogtt曲線。

(7)胰島素耐量試驗(yàn)(insulintolerancetest,itt)于實(shí)驗(yàn)開始第90天對(duì)大鼠禁食12h后,按0.75iu/kg劑量腹腔注射方式給予生物合成胰島素,于胰島素注射后0min,15min,30min,60min,120min尾靜脈采血。利用血糖分析儀測(cè)定0min,15min,30min,60min,120min的血糖水平。計(jì)算胰島素注射后各時(shí)間點(diǎn)血糖值相對(duì)于注射前的血糖值的比率。

(8)組織病理學(xué)改變?nèi)「闻K、胰腺、脂肪組織于10%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、連續(xù)石蠟切片,蘇木精染色并用中性樹脂封片在在光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

代謝性綜合癥模型建造成功的標(biāo)準(zhǔn):

2型糖尿病動(dòng)物模型建造成功的標(biāo)準(zhǔn):實(shí)驗(yàn)性嚙齒類大、小鼠2型糖尿病動(dòng)物模型血糖值的確立標(biāo)準(zhǔn)各文獻(xiàn)報(bào)道不一,近年來(lái)通過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)者基本傾向于認(rèn)定空腹或非空腹血糖值>11.1mmoll或>16.7mmoll,還要伴有胰島素抵抗等2型糖尿病特征,通過(guò)灌胃葡萄糖耐量試驗(yàn),依據(jù)空腹血糖和葡萄糖負(fù)荷結(jié)果來(lái)判斷。肥胖的模型建立成功主要體現(xiàn)在體重和血脂,脂肪重量上。實(shí)驗(yàn)性嚙齒類大、小鼠非酒精性脂肪肝模型建立成功的金標(biāo)準(zhǔn)為肝臟細(xì)肝臟細(xì)胞有脂肪泡大面積的脂肪樣變性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)錄入spss18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,有差異再用snk法進(jìn)行兩兩比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果分析

(1)一般情況:實(shí)驗(yàn)過(guò)程中c組大鼠精神狀態(tài),飲水?dāng)z食正常,活動(dòng)靈敏,皮毛潔白,墊料5天更換一次;ch組飲水?dāng)z食變化不明顯,實(shí)驗(yàn)約90天,行動(dòng)稍顯遲緩,皮毛逐漸泛黃,失去光澤。墊料易潮濕,平均3天更換一次。

(2)體重:在1周、4周、8周、12周、13周體重均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,隨著時(shí)間變化造模組體重均大于對(duì)照組的趨勢(shì)。

(3)b超結(jié)果本發(fā)明b超超聲結(jié)果顯示,對(duì)照組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的強(qiáng)回聲區(qū)域,提示沒(méi)有脂肪肝形成。造模組發(fā)現(xiàn)有明顯的回聲區(qū)域,提示有脂肪肝形成。

(4)肝臟視覺(jué)檢查剖殺大鼠時(shí),開腹后行肉眼觀察肝臟大體形態(tài)、大小,顏色,食指、中指并攏,以指腹觸摸感受肝臟質(zhì)地,取血后取肝臟觸摸肝臟切面。與對(duì)照組比較,普通飲食組低、中劑量組肝臟大小無(wú)肉眼可見(jiàn)區(qū)別,肝臟呈深紅色,質(zhì)軟,肝韌帶附近無(wú)明顯脂肪組織,高劑量則呈現(xiàn)出輕度包膜緊張,切面輕微油膩感。

(5)臟器系數(shù)造模組肝體指數(shù)稍大于對(duì)照組。卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

(6)肝功變化區(qū)腹主動(dòng)脈全血靜置兩小時(shí)離心取上清液于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀做肝功能檢測(cè)。

(7)空腹血糖水平:在第0月、1月、2月空腹血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第90天、100天、110天、120天ch組空腹血糖水平均大于c組(p<0.05);90天c組血糖水平(6.32±0.56mmol/l),ch組血糖水平(9.05±0.81mmol/l);100天c組血糖水平(6.38±0.72mmol/l),ch組血糖水平(10.35±0.86mmol/l);110天c組血糖水平(6.56±0.91mmol/l),ch組血糖水平(11.25±1.29mmol/l);120天c組血糖水平(6.32±0.65mmol/l),ch組血糖水平(11.93±0.85mmol/l)。從110天開始,結(jié)合下述ogtt實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以認(rèn)為糖尿病動(dòng)物模型造模成功。

(8)ogtt:灌胃葡萄糖后,兩組大鼠血糖值均顯著升高。與c組比較,ch組大鼠糖耐量曲線明顯上抬,曲線下面積顯著增加;ch組大鼠出現(xiàn)糖耐量異常。如圖1所示。

(9)itt:腹腔注射胰島素后,各組大鼠血糖水平有不同程度降低。與c組比較,ch組大鼠胰島素耐量曲線下面積顯著增加。胰島素耐量異常,如圖2所示。

(6)組織病理學(xué)改變:肝臟組織he染色鏡下觀察組織病理學(xué)改變時(shí)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組對(duì)照組匯管區(qū)無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞間極少量充血,未發(fā)現(xiàn)明顯的脂肪病變,而造模組可發(fā)現(xiàn)明顯大泡性脂肪變肝細(xì)胞逐漸增多;如圖4。對(duì)照組胰腺組織細(xì)胞胞質(zhì)緊密,排列整齊,細(xì)胞未見(jiàn)明顯水腫、壞死等病變;造模組胰腺組織細(xì)胞胞質(zhì)疏松,出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞水腫、壞死,胰腺細(xì)胞發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),胰島細(xì)胞數(shù)減少;如圖7所示。,可以看出,造模組的細(xì)胞比較飽滿,對(duì)照組脂肪組織的細(xì)胞面積小于造模組細(xì)胞面積;如圖8所示。

(7)對(duì)脂肪組織鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組平均鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯的大于對(duì)造模組,說(shuō)明對(duì)照組的細(xì)胞面積和體積是小于造模組的。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)為一種由高脂高糖飲食與玉米油灌胃致大鼠代謝性綜合癥的模型建立,與人群肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等代謝綜合癥的發(fā)生、發(fā)展較為接近。且實(shí)驗(yàn)代謝性綜合癥相關(guān)癥狀和機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變也與人類相似,動(dòng)物模型穩(wěn)定性較好,更有助于代謝性綜合癥機(jī)制及藥物治療研究。實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇sd大鼠,種屬純正,是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最為常見(jiàn)的大鼠類別,該動(dòng)物模型可向外界提供一定的參考。

應(yīng)當(dāng)指出,綜上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本實(shí)驗(yàn)原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾,這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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