專利名稱：一種生產(chǎn)人造血增效因子的制備方法及所用的核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域。具體而言，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)人造血增效因子的制備方法，本發(fā)明還涉及所述的方法中使用的特異的核苷酸序列。
背景技術：
造血干細胞移植按造血干細胞來源可分為骨髓移植(BMT)、外周血造血干細胞移植(PBSCT)和臍血造血干細胞移植(CBSCT)。PBSCT可分為自體(Auto-PBSCT)和異基因PBSCT(Allo-PBSCT)。近十年來，PBSCT由于較BMT有以下優(yōu)勢而日益受到人們的重視(1)移植后造血功能恢復迅速，減少了感染等并發(fā)癥及住院時間(2)輻射敏感性低，在體內(nèi)植入率高(3)采集方便，避免麻醉和手術，降低病人經(jīng)費開支(4)增加移植物中T細胞和NK細胞數(shù)量，使免疫功能迅速恢復(5)對骨髓內(nèi)有腫瘤細胞浸潤、纖維化或骨盆局部接受放療等原因無法采集骨髓時可采集PBSC。基于這些優(yōu)勢，近年來PBSC正在相當程度上有代替骨髓作為自體和異體移植主要干細胞來源的趨勢。但是造血干細胞移植后造血功能恢復的速度依賴于植入的造血干/祖細胞(HSC/HPC)的數(shù)量。正常人外周血CD34+細胞只占單個核細胞的0.01-0.1％，而保證植入的CD34+細胞最低數(shù)為1×106/Kg。從正常人或病人外周血中收集足夠用于Auto-PBSCT或Allo-PBSCT的造血干細胞數(shù)，需要從數(shù)升甚至10余升血液體積中經(jīng)多次濃集方可得到。多次采血不僅對醫(yī)務人員和病人均很不利，且開支昂貴。目前臨床上主要用造血細胞因子如G-CSF、SCF、GM-CSF等單用或幾種細胞因子聯(lián)合使用的方案，或化療藥物聯(lián)合細胞因子方案對外周血干細胞動員。但是G-CSF、SCF和GM-CSF需多日給藥(4-10天)，仍需要多次采集，費用高，難以預測最佳采集時間，臨床上個體差異較大，且對有些個體不能有效動員。因此，尋找一種可使骨髓中存在的大量造血干細胞快速有效動員到外周血中的制劑或方案，有效提外周血中造血干細胞的含量來減少采集次數(shù)，提高采集效率，具有重要臨床意義。
近年來趨化因子對造血干/祖細胞的動員作用日益引起重視。趨化因子(Chemokines)是一組對白細胞具有趨化作用的分泌型單鏈蛋白質(zhì)，分子量為8-12KD，含兩對二硫鍵，堿性，能結合肝素。GRO(growth related oncogene)家族是一類屬于ELR+CXC族的趨化因子，包括GROα、GROβ、GROγ。GRO基因定位在4q12-13，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。全長GROβ(1-73)含有73個氨基酸，主要生物學特性是趨化、激活中性粒細胞。1995年King等發(fā)現(xiàn)GROβN-端缺失4個氨基酸(APLA)的變異體GROβ-T或GROβ(5-73)為一種新型趨化因子，它由69aa組成，分子量為7550，理論等電點為9.75。
最近發(fā)現(xiàn)GROβ-T主要生物學功能為除比全長GROβ有更強趨化、動員和激活中性粒細胞效能外，還具有快速動員骨髓干細胞進入外周血液中效能和很強的造血增效活性(即刺激CFU-GM增殖)，故將其命名為造血增效因子(hematopoietic synergistic factor，簡稱HSF)，而全長GROβ這種活性很低。美國史密斯克萊思比徹姆(Smithkline Beecham Corporation)科研人員AG.King等是在研究造血調(diào)節(jié)肽SK&F107647化合物功能過程中發(fā)現(xiàn)HSF的，他們通過SK&F107647刺激人TF274骨髓基質(zhì)細胞系和小鼠C6骨髓基質(zhì)細胞系，利用肝素結合柱和抗GROβ親和層析柱分別分離出人HSF和小鼠HSF。同時用RT-PCR方法克隆出編碼人HSF和GROβ基因，亞克隆進原核表達質(zhì)粒pEAKn上，并在E.coli中經(jīng)化學誘導獲得重組人HSF表達。他們?yōu)榱说玫絅-末端無起始子甲硫氨酸(Met)的重組人HSF和便于純化，在人HSF和GROβN端引入一個含有12個aa標簽序列(DET-1)和腸激酶切割位點，即DET-1-DDDDK。融合蛋白DET-1-DDDDK-HSF(或DET-1-DDDDK-GROβ)在E.coli中幾乎等量以包含體和可溶性形式表達。經(jīng)過復性→抗DET-1單克隆抗體親和層析柱分離→腸激酶切割→再次親合柱分離→反相高效液相層析(RP-HPLC)分離，最后獲得重組人HSF純品。這種工藝較復雜，成本高。因此存在著簡化人HSF制備工藝方法的需要。

發(fā)明內(nèi)容
因此，基于上述需要，本發(fā)明一方面涉及如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列。所述的多核苷酸序列是在上述編碼人HSF基因的69個密碼子中，共有34個替換為人大腸桿菌偏愛密碼子獲得的，它們是第4、5、7、8、13、14、16、17、20、21、22、23、24、25、27、28、29、32、33、36、37、38、40、41、42、43、48、50、51、52、53、56、61、65。
本發(fā)明還涉及含有所述的多核苷酸序列的載體。
本發(fā)明還涉及含有所述的載體的陽性表達質(zhì)粒。
本發(fā)明進一步涉及由所述的陽性表達質(zhì)粒表達的造血增效因子。所述的因子主要以包含體的形式表達。
本發(fā)明進一步涉及一種生產(chǎn)人造血增效因子的方法，其包括以下步驟1)含有編碼造血增效因子的多核苷酸序列亞克隆到表達載體上，篩選含有陽性表達質(zhì)粒的克?。?)將所述的陽性表達質(zhì)粒轉入大腸桿菌中，誘導表達以包含體形式表達的造血增效因子；3)將所述的包含體變性裂解，經(jīng)Sephacryl S-100分離，回收目的蛋白；4)目的蛋白復性后，用SP-SepharoseFF分離；其特征在于所述的編碼造血增效因子的多核苷酸序列為SEQ IDNO.1所示的多核苷酸序列。
本發(fā)明進一步涉及所述的造血增效因子用于制備動員造血干細胞進入外周血的藥物中的用途。


圖1顯示引物擴增以后的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果。
圖2顯示表達質(zhì)粒pET30a-hHSF的構建。
圖3顯示陽性克隆pET30a-hHSF的酶切鑒定圖譜。
圖4顯示pET30a-hHSF/BL21(DE3)誘導表達不同時間的SDS-PAGE蛋白電泳圖譜。
圖5顯示Sephacryl S-100純化rhHSF的分離曲線圖。
圖6顯示SP Sepharose純化rhHSF的分離曲線圖。
圖7顯示純化的rhHSF的SDS-PAGE圖譜。
圖8顯示純化的rhHSF的SDS-PAGE紫外掃描圖。
圖9顯示SDS-PAGE測定的rhHSF的分子量。
圖10顯示MALDI-TOF-MS測定的rhHSF分子量。
圖11顯示rhHSF氨基酸組成分析圖譜。
圖12顯示rhHSF的吸收光譜曲線。
本發(fā)明的最佳實施方式以下的參考實施例和試驗實施例詳細描述了本發(fā)明多核苷酸和本發(fā)明的所述的制備HSF的方法，其目的是進一步例示本發(fā)明，而不是限定其范圍。
實施例1hHSF基因的獲得本發(fā)明將編碼hHSF的DNA片段5‘端引入Ndel酶切位點，3’端引入BamHI酶切位點，連接到表達質(zhì)粒pET30a(購自Invitrogene，美國)的NdeI與BamHI酶切位點之間，構建以ATG為起始密碼子的表達質(zhì)粒，得到如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列，其是在編碼人HSF基因的69個密碼子中，共有34個替換為大腸桿菌偏愛密碼子獲得的，它們是第4、5、7、8、13、14、16、17、20、21、22、23、24、25、27、28、29、32、33、36、37、38、40、41、42、43、48、50、51、52、53、56、61和65。其具體替換見表1。
表1

一.質(zhì)粒DNA的提取1.質(zhì)粒DNA的小量提取(堿裂解法)從3ml過夜培養(yǎng)的菌液中取1.5ml倒入Eppendoff管中，7000rpm離心1min，棄去上清。沉淀加入100μL的Solution I(25mMTrisHCl，pH8.0，10mMEDTA，50mM的葡萄糖)，振蕩懸浮，混勻。加入200μL的Solution II(0.2M NaOH，1％SDS)，混勻，冰上放置5min。加入150μL的Solution III(3M醋酸鉀，pH4.8)，混勻，冰上放置10min。15000rpm離心10min，上清轉入另一個Eppendoff中，加入1ml無水乙醇，室溫放置30min。15000rpm離心10min棄上清。沉淀加入0.5ml75％乙醇洗一次，15000rpm離心5min，沉淀室溫放置干燥。加入含20μg/ml RNase A(購自華美生物技術公司)的30μL TE中溶解備用。
2.質(zhì)粒DNA的大量制備(堿裂解法)將50ml過夜培養(yǎng)的菌液放入50ml離心管中，4℃，7000rpm離心5min，棄上清，菌體加入6ml Solution I，振蕩混勻。加入9ml SolutionII，輕輕上下顛倒數(shù)次，混勻，冰浴5min。加入9ml Solution III，上下顛倒混勻，冰浴10min。4℃，15000rpm離心15min，上清轉入另一個50ml離心管。加入等體積的異丙醇(北京化工廠)，混勻，室溫放置10min，14000rpm室溫離心15min。沉淀加入75％乙醇1ml，放置片刻，沉淀懸浮起來后，轉入1.5ml Eppendoff管中。15000rpm離心2min，棄去上清。沉淀真空抽干后，加入含20μg/ml Rnase A的500μL TE中，37℃酶解RNA 1hr。用等體積的1∶1的酚/氯仿(北京化工廠)抽提兩次，氯仿抽提兩次。加入50μL的3mol/L NaAc(pH4.6)，1ml無水乙醇，混勻，-20℃放置10min，15000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗滌，15000rpm離心2min，棄上清，兩次，沉淀真空干燥，用480μL消毒水溶解，加入4mol/L NaCl 120μL和13％PEG 600μL，混勻，冰浴40min，4℃，15000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75％乙醇洗兩次，真空干燥。加入400μL TE溶解備用。
二.DNA重組1.PCR擴增以下是所述的PCR引物P1(38mers)5’引入NdeI酶切位點5’CCCAT ATGACT GAA CTG CGT TGT CAG TGT CTG CAG ACC3’P2(58mers)5’T AAC TTT AAC GGA CTG GAT GTT TTT CAG GTG GAT ACC CTG CAG GGTCTG CAG ACA CTG3’P3(58mers)5’AG TCC GTT AAA GTT AAA TCC CCG GGT CCG CAC TGC GCT CAG ACCGAA GTT ATC GCT AC3’P4(56mers)5’GA AGC CGG GTT CAG ACA AGC TTT CTG ACC GTT TTT CAG GGT AGC GATAAC TTC GGT3’P5(58mers)5’T CTG AAC CCG GCT TCC CCG ATG GTT AAA AAA ATC ATC GAA AAA ATGCTG AAA AAC GGC3’P6(38mers)引入BamHI酶切位點5’CGGGA TCCTTA TTA GTT GGA TTT GCC GTT TTT CAG CAT3’將P1、P2、P3、P4、P5、P6配成50μmol/L濃度。第一輪進行兩個片段拼接(依次P1與P2、P3與P4、P5與P6)。將P1與P2(P1、P2既是模板，又是引物)各取1μL，加入50μL的反應體系中(內(nèi)含2.5mmol/LdNTP(Promega公司產(chǎn)品)8μL，10 x buffer 5μL，Taq酶1-2U，必要時可加入適量的鎂離子，以消毒的重蒸水補足體積)，表面加一層礦物油，放入PCR儀中。P3與P4、P5與P6也如此處理，根據(jù)模板和引物的情況設定反應程序，所述的反應程序為本領域普通技術人員已知的技術，分別擴增出P1-2、P3-4、P5-6。再將P1-2與P3-4各取1μL為模板，分別加入P1、P4各0.5μmol/L進行第二輪PCR，擴增4片段拼接產(chǎn)物P1-4。然后將P1-4、P5-6PCR產(chǎn)物各取1uL為模板，分別加入P1、P6各0.5μmol/L進行第三輪PCR，擴增6片段拼接產(chǎn)物P1-6。PCR產(chǎn)物見圖1。
2.DNA的瓊脂糖電泳稱取適量瓊脂糖，加入相應量的0.5xTBE，配成相應的濃度，融化后冷卻至40-50℃，加入少量EB，倒入插有梳子的電泳槽中，待徹底凝固，撥出梳子，樣品與加樣緩沖液混合，加入加樣孔，接通電源，50-80V電泳。
1)DNA的回收在紫外燈下切下瓊脂糖電泳中分離的DNA片段條帶，用大連寶生物公司生產(chǎn)的DNA片段凝膠回收試劑盒回收。
2)DNA的酒精沉淀含有目的DNA的溶液，加入10％體積的3mol/LNaAc(pH4.6)，二倍體積的無水乙醇沉淀DNA，離心，將沉淀再用75％乙醇洗滌一次，低溫抽干，溶于TE備用。
3)DNA的酶切50μL的反應體系含有質(zhì)粒3～5μg，10 x buffer 5μL，NdeI和BamHI限制性內(nèi)切酶5-10U(大連寶生物公司)，加水至所需體積，37℃保溫3～4hr。
4)DNA的連接20μL的反應體系，含有10 x buffer 2μL，DNA連接酶1U，線性載體和插入目的DNA片段克分子比一般為1∶4，混勻，4℃過夜(16hr)。
3.感受態(tài)菌的制備將大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。挑單菌落接種于3mlLB中，37℃培養(yǎng)16hr。取2.5ml培養(yǎng)物接于200ml LB中，37℃培養(yǎng)2～3hr，至OD550＝0.55～0.65，以4000rpm離心10min，收集菌體，重懸于1/2體積預冷的0.1mol/L MgCl2中，4000rpm離心5min，收集菌體懸浮于1/2體積預冷的0.1mol/L CaCl2中，冰浴30min，4000rpm離心5min，菌體重懸于5-6ml的15-20％甘油-0.1mol/LCaCl2中，200μL/管分裝，-50℃保存。
4.質(zhì)粒轉化取100μL感受態(tài)菌，加入適量質(zhì)粒DNA或連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴40min，42℃熱休克90秒，冰浴2min，加入0.6ml LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1.5hr，取適量菌體，涂布至含有抗生素的平板上，37℃培養(yǎng)過夜。
5.克隆篩選與鑒定1)藍白斑篩選將T載體連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)菌。將含有1.5％瓊脂糖的LB培養(yǎng)基用微波爐溶化，冷卻至60℃左右加入氨芐青霉素(終濃度為100μg/ml)，倒入平板，待凝固后在其表面涂上20mg/mlX-gal 16μL和100mmol/L IPTG 4μL，37℃放置1～2hr，取轉化產(chǎn)物200μL涂板，37℃過夜。長出的菌落出現(xiàn)藍白斑，必要時可在4℃放置1-2hr以使其更清楚。挑白斑鑒定陽性克隆。陽性克隆pET30a-hHSF酶切圖譜見圖3。
具體的pET30a-hHSF的構建見圖2。
2)限制性內(nèi)切酶鑒定用小量堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA，選用適當?shù)膬?nèi)切酶酶切，適當濃度的瓊脂糖電泳鑒定，確定酶切位點是否吻合，片段大小是否正確。
3)PCR方法鑒定以小量堿裂解法提取的質(zhì)粒DNA為模板，以引物P1和P6進行PCR，適當濃度的瓊脂糖電泳鑒定，確定是否有特異區(qū)帶，片段大小是否正確。
6.菌種保存將菌種在LB平板上劃線，次日長出單菌落，挑一單菌落至3ml LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16hr，按比例1∶100接種至另一新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16hr，按比例1∶100接種至另一新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.4-0.6，加入甘油至終濃度15％～20％，-50℃保存。
三.重組蛋白在E.coli中的表達及純化1.重組蛋白的誘導表達1)重組蛋白的小量誘導表達挑單克隆菌落于含有卡那霉素(終濃度50μg/ml)的3ml培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，按1％接種到另一管3ml培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600約為0.4-0.6，加入誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，Promega)，繼續(xù)培養(yǎng)4hr左右，收集菌體，SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達。其表達結果見圖4。
2)重組蛋白的大量誘導表達挑單菌落接種于3mlLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12hr，按0.5％接種于100ml LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm過夜培養(yǎng)，按4％接種于250ml高濃度肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入誘導劑0.5mmol/L IPTG誘導表達4～5hr。收集菌體，超聲破碎，分離純化重組蛋白。
2.重組蛋白的純化1)菌體的超聲破碎菌體用10倍體積的溶液A(50mM Tris-HCl，pH8.0，1％Tritonx-100，10mM EDTA)懸浮，4℃超聲破碎菌體，360W，每次工作時間20秒、間歇時間40秒，12次，12000rpm離心，分別收集上清和沉淀，將沉淀部分重復上述步驟兩次，SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白在菌體中的存在形式(存在于上清為可溶形式，存在于沉淀中為包涵體形式)。
2)包涵體的洗滌將沉淀部分加入等體積的包涵體洗滌液B(50mM Tris-HCl，pH8.0)，混勻，4℃12000rpm離心10min得沉淀，重復一次。
3)包涵體的溶解洗滌后的包涵體加入包涵體裂解液(50mM Tris-HCl，4M鹽酸胍，2M尿素，150mM NaCl，200mM β-巰基乙醇)40ml/L細菌培養(yǎng)液，溶解過夜，14000rpm，4℃離心30min，收集上清。SDS-PAGE鑒定包涵體純度。
4)將包涵體溶解物過2倍柱體積平衡液平衡的Sephacryl S-100(法瑪西亞公司，美國)。得到的分離曲線見圖5。
5)包涵體的復性在冰浴和攪拌情況下將從Sephacryl S-100分離收集的重組蛋白逐滴加入復性液中，4℃復性48hr后，用透析液A充分透析，換液7-8次，每次透析液量至少為透析樣品體積的10倍，透析48hr。
6)過SP Sepharose柱將透析后的樣品上SP Sepharose柱分離，先以洗脫液A洗脫，再以洗脫液B洗脫。
7)以透析液B透析的樣品用SP Sepharose柱分離的目的蛋白。其分離曲線見圖6。
8)留取少量樣品用于理化性質(zhì)鑒定，其余樣品內(nèi)加入1％人白蛋白，混勻后除菌過濾，置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 9)樹脂的處理(1)CM-Sepharose FF的處理用過的樹脂先以2倍柱體積的2mol/L NaCl洗滌，流速快一些。然后用2倍體積的0.5mol/L NaOH-1.5mol/L NaCl處理20-40min。用水洗滌至pH7.0左右，用上樣緩沖液平衡3-5個柱體積備用。短期保存加入少量NaN3，長期保存于20％乙醇中。
(2)SP-Sepharose High Performance的處理用過的樹脂先以1倍柱體積的2.0mol/L NaCl洗滌，處理10-15min，然后用1.0mol/L NaOH處理0.5-1h，用水洗滌至pH7.0左右，用上樣緩沖液平衡至少3個柱體積備用。長期保存于4℃20％乙醇-0.2mol/L乙酸鈉中。
4.重組蛋白的鑒定1)SDS-PAGE蛋白電泳按下表配制濃縮膠和分離膠(單位ml)
表2

待分離膠聚合后上層灌入濃縮膠，完全聚合后拔出梳子，在加樣孔內(nèi)加入處現(xiàn)好的樣品，電泳條件為恒流20mA。樣品處理時加入適量上樣緩沖液，煮沸10min。
2)蛋白含量測定SDS-PAGE-染色-比色法以準確量的rhSCF為標準，用考馬斯亮藍R-250對凝膠染色，經(jīng)凝膠紫外掃描比對一定量的rhSCF與rhHSF的紫外光吸收值，推算出rhHSF含量。
所得的目的蛋白的純度鑒定見圖7。
使包涵體溶于變性劑后純度為75％，經(jīng)SP-Sepharose純化及過濾后，非還原型rhHSF純度為97％，見圖8。
四.重組蛋白理化性質(zhì)測定1.分子量測定1)SDS-PAGE法制備18％的SDS-聚丙烯酰胺變性凝膠，對純化的rhHSF進行SDS-PAGE分析，測定遷移距離。以小分子量蛋白質(zhì)marker的不同分子量蛋白質(zhì)的遷移距離為橫坐標，以其分子量的對數(shù)位縱坐標作圖，繪出一條蛋白質(zhì)的分子量和其遷移距離之間關系的標準曲線。根據(jù)rhHSF的遷移距離，從標準曲線中查出對應分子量值，見圖9。
2)由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所中心實驗室用ABI公司的飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進行測定，見圖10。
2.氨基酸序列分析由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所中心實驗室用ABI公司Applied Biosystems Procise進行測定。結果顯示N-末端10個氨基酸為TELRCQCLQT。
3.氨基酸組成分析由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所中心實驗室用Waters公司2690泵、996二極管陣列檢測器、水解氨基酸分析柱AccQ.TagrM進行測定，見圖11。
4.吸收光譜測定用中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所中心實驗室C18RP-HPLC分離rhHSF，以WatersHPLC-UVmodel 996二極管陣列檢測器在波長210nm-300nm范圍內(nèi)檢測rhHSF的吸收光譜曲線，見圖12。
五.rhHSF對恒河猴外周血造血干/祖細胞的快速動員作用這項實驗由中國軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所羅慶良主任實驗室?guī)椭瓿?，在恒河猴體內(nèi)觀察了rhHSF單獨或與rhG-CSF聯(lián)合應用對外周血CFU-GM數(shù)目、外周血CD34+細胞數(shù)目及外周血象的影響。
1.實驗動物分組八只恒河猴體重4.2±0.33(3.6-4.5)kg，經(jīng)10天喂養(yǎng)后檢查動物體質(zhì)健壯、無外傷畸形及體表感染灶、體溫及血象正常，動物質(zhì)量合格證號BDW95002。動物在緩沖隔離房內(nèi)進行體外風淋清潔、腸道滅菌處理后置層流動物房獨居籠養(yǎng)。層流房的室內(nèi)溫度為22±2℃，相對濕度為70％，日光燈控制晝夜節(jié)律。每閂給予標準塊料、蘋果、干玉米粒、花生米等，涼水置籠側自由飲用，動物飼養(yǎng)設施合格證號B98020。
實驗分為rhHSF和rhG-CSF+rhHSF兩組(因動物數(shù)量有限，未設不給藥對照組)。
2.給藥方法rhG-CSF+rhHSF組動物先皮下注射10μg/kg rhG-CSF，每天一次，連續(xù)給藥4天，第5天兩組動物同時單次皮下注射500μg/kgrhHSF(原液0.3mg/ml)。
3.觀察指標1)外周血象(WBC，RBC，HGB，HCT，PLT，SCC，LCC)用F-820血細胞計數(shù)儀檢測2)瓊脂半固體外周血CFU-GM培養(yǎng)3)用流式細胞儀檢測外周血CD34+細胞數(shù)。
4)體溫及一般狀況各組動物檢測指標的檢測時間見表2。
表2 rhHSF和rh-CSF+rhHSF給藥后檢測指標及檢查時間給藥后時間(min)外周血象PB-CD34+細胞數(shù)PB-CFU-GM體溫0 √ √√ √5 √ √√10 √ √√ √20 √ √30 √ √√ √45 √ √√60 √ √√ √80 √90 √ √√120√ √√ √180√ √√300√ √420√540√ √720√ √4.PBMC的分離將3ml肝素抗凝外周血以等倍體積的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液稀釋后緩慢加入5ml淋巴細胞分離液中，2000rpm離心20min，吸取中間細胞層，以F-820自動血液分析儀進行細胞計數(shù)。
5.外周血CFU-GM的培養(yǎng)CFU-GM培養(yǎng)體系見表2。每個樣品用3個培養(yǎng)皿，置37℃ 5％CO2孵箱中培養(yǎng)14天后計數(shù)集落數(shù)，以含50個以上細胞的細胞團為一個集落。
6.檢測外周血CD34+細胞將小鼠抗人CD34單克隆抗體及對照抗體與外周血孵育30min后以紅細胞裂解液裂解紅細胞15min，1500rpm離心5min，吸去上清，將細胞沉淀以PBS洗滌兩次，1500rpm離心5min后以1mlPBS懸浮細胞，以FACSCalibur流式細胞儀檢測外周血CD34+細胞。
恒河猴體內(nèi)實驗證明純化的rhHSF能快速動員CD34+造血干/祖細胞、CFU-GM及中性粒細胞至外周血。
恒河猴試驗結果表明，單次皮下注射rhHSF 250-1000μg/Kg能使恒河猴外周血CFU-GM增加3.8到11.2倍，持續(xù)2-4hr，與單獨注射G-CSF 10μg/Kg/d×4d外周血CFU-GM升高幅度相當。單次注射hHSF 250μg/Kg后45min外周血CFU-GM增加加58倍。恒河猴給予G-CSF 10μg/Kg/d×4d后外周血CFU-GM增加11.2-17倍，第5天再給予單劑量hHSF 250μg/Kg后CFU-Meg升高到給藥前26倍，較單用G-CSF時CFU-GM升高2倍，CFU-Meg升高200倍，說明hHSF與G-CSF對造血干組細胞動員有明顯協(xié)同作用。人HSF可單獨或與G-CSF聯(lián)合用于動員造血細胞。與G-CSF聯(lián)合應用可以縮短G-CSF的給藥日期，減少G-CSF的日用量，減少采集干細胞的次數(shù)，從而減輕臨床上應用G-CSF的副作用，減少開發(fā)癥，并加速外周血造血干細胞移植后造血系統(tǒng)的恢復。申請人使用PCR方法人工合成編碼人HSF基因，并以非融合蛋白形式在E.coli中獲高達30％的表達，優(yōu)化了復性條件和分離純化工藝，最終獲純度達95％以上重組人HSF純品，該產(chǎn)品N-末端不含甲硫氨酸。在恒河猴體內(nèi)試驗證明本發(fā)明產(chǎn)品能快速動員造血干細胞及中性粒細胞到外周血，并與G-CSF有明顯協(xié)同作用。
雖然根據(jù)以上特定的實施方案描述了本發(fā)明，但應該認識到可以由本領域技術人員對本發(fā)明進行多種修改和改變，而這些修改或改變也包含在所附的權利要求所定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列表<110>中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所<120>一種生產(chǎn)人造血增效因子的制備方法及所用的核苷酸序列<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>292<212>DNA<213>人<400>1tgacttgacg caacagtcac agacgtctgg gacgtcccat aggtggactt ttacatccag60tccgttaaag ttaaatcccc gggtccgcac tgcgctcaga ccgaagttat cgtgtaggtc120aggcaatttc aatttagggg cccaggcgtg acgcgagtct ggcttcaata gcctaccctg180aaaaacggtc agaaagcttg tctgaacccg gcttccccga tggttaaaaa aagatgggac240tttttgccag tctttcgaac agacttgggc cgaaggggct accaattttt tt29權利要求
1.如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列。
2.含有權利要求1所述的多核苷酸序列的載體。
3.含有權利要求2所述的載體的陽性表達質(zhì)粒。
4.由權利要求3所述的陽性表達質(zhì)粒表達的造血增效因子。
5.根據(jù)權利要求4所述的造血增效因子，其特征在于所述的因子以包含體的形式表達。
6.一種生產(chǎn)人造血增效因子的方法，其包括以下步驟1)將含有編碼造血增效因子的多核苷酸序列亞克隆到表達載體上，篩選含有陽性表達質(zhì)粒的克?。?)將所述的陽性表達質(zhì)粒轉入大腸桿菌中，誘導表達以包含體形式表達的造血增效因子；3)將所述的包含體變性裂解，分離并回收目的蛋白；4)目的蛋白復性后，進行分離純化目的蛋白；其特征在于所述的編碼造血增效因子的多核苷酸序列為SEQ IDNO.1所示的多核苷酸序列。
7.根據(jù)權利要求4所述的造血增效因子用于制備動員造血干細胞進入外周血的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域。具體而言，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)人造血增效因子的制備方法，本發(fā)明還涉及所述的方法中使用的特異的核苷酸序列。
文檔編號C07K14/435GK1634962SQ20031012421
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權日2003年12月31日
發(fā)明者陳松森, 齊春梅, 楊克恭, 張艷麗, 羅絲, 鄧艷春 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所