專利名稱：新的黃皮酰胺的光學活性衍生物、其制法和其藥物組合物與用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及羥芐基、羥基、苯基取代γ-內酰胺(黃皮酰胺)的立體異構體，光活的立體異構體，及它們的制備方法，以它們作為活性物質的藥物組合物，和它們在制備促智，抗衰老藥物的應用。
背景技術：
目前我國人口的平均壽命已超過70歲，比解放時的人均壽命增加了一倍。國外一項科學研究預測到2025年時，15歲以下兒童的比例將占總人口的18.6％，而65歲及65歲以上的老年人將超過童數(shù)，達到18.8％，這個數(shù)字表明，再過20余年，每5個人中就有1個老年人。早老性癡呆癥(Alzheimer’s Disease)多發(fā)生在50余歲。因腦血管病變引發(fā)的多發(fā)性栓塞性癡呆或老年性癡呆多發(fā)生在60歲以后?？梢姡捎谌丝诘睦淆g化，早老性癡呆癥和老年性癡呆癥的發(fā)病率也必將增加。老年人及其特有的神經(jīng)退化性疾病——各種癡呆癥要經(jīng)歷兩種死亡，首先是精神上的死亡，后是肉體上的死亡，苦不堪言，更給社會和家庭帶來沉重負擔。人口老齡化被認為是僅次于戰(zhàn)爭，瘟疫，饑荒，資源能源短缺而影響社會發(fā)展和安定的不利因素。
防治衰老和治療老年癡呆的藥物種類繁多。腦血管擴張藥，通過改善腦血流量有助于提供能量和改善智能，但真正有價值的腦血管擴張藥必須具有高度選擇性，不影響腦代謝，無“竊血”現(xiàn)象，有抗血小板聚集和抗血栓作用。鈣拮抗劑尼莫地平雖符合上述某些條件，但它僅作用于電壓依賴性鈣通道中的L-通道，對N型和T型鈣通道無影響。增強膽堿系統(tǒng)功能的藥物中，Ach前體僅有微弱的治療作用，Ach受體激動劑和膽堿脂酶抑制劑雖有一定效果，但作用較短暫，毒副作用較大。多種神經(jīng)肽和神經(jīng)生長因子曾被認為有治療癡呆癥的希望，但臨床效果不佳，可能主要歸因于這類物質難以通過血腦屏障進入腦內發(fā)揮作用，2-吡咯烷酮乙酰胺(piracetam國內已生產(chǎn)，商品名腦復康)問世后，在早期文獻中屬沒有爭論的一類新型促智藥(nootropil，該詞是從希臘詞noo(腦)和tropein(向)衍化而來)，近幾年來國內外報道，該藥對各類型的記憶障礙和老年癡呆作用輕微或尚無定論，一個主要原因是該藥為水溶性化合物，通過血腦屏障率低，不易集中到靶點發(fā)揮作用。
本發(fā)明人從蕓香科植物黃皮[Clausena Lansium(lour.)Skells]中第一次分離出含有腦復康藥的γ-內酰胺骨架的化合物，稱之為黃皮酰胺(黃皮酰胺)。黃皮酰胺是具有四個手性中心的γ-內酰胺，天然品為消旋體，消旋黃皮酰胺的合成方法曾申請歐洲專利，其申請?zhí)枮镋P0414020，中國專利申請為86107090，90107145.5和90107144.7。左旋黃皮酰胺具有較好的促智作用，該化合物的純物質、制備方法及其潛在的醫(yī)藥應用本發(fā)明人已申請專利，CN00124630.5。
黃皮酰胺分子中有4個手性中心，應有16個光活的立體異構體，組成互為非對映關系的8對對映異構體(其構型與命名如表1)
表1 8對光活立體異構體

其中黃皮酰胺的一對對映體(I1)本發(fā)明人已申請專利(專利申請?zhí)朇N00124630.5)。消旋的新黃皮酰胺(I2)和消旋的表新黃皮酰胺(I4)是公知的，但光活新黃皮酰胺(I2)和表新黃皮酰胺(I4)及其制備方法未見文獻報道。(-)和(+)黃皮酰胺(I1)的體內、外代謝的研究結果表明兩者的代謝物的種類基本相同，而(-)黃皮酰胺的代謝物中(-)N-羥甲基去甲黃皮酰胺[(-)-CM1]和(-)-5-羥基黃皮酰胺[(-)-CM2]的含量明顯高于(+)黃皮酰胺的代謝產(chǎn)物中相應的[(+)-CM1]和[(+)-CM2]的含量。其母體(-)黃皮酰胺的藥理試驗表明，具有明顯的促智作用，而(+)黃皮酰胺無此作用，并有拮抗作用，據(jù)此合成了代謝物CM1和CM2的一對對映體及其衍生物，其中CM11的制備本發(fā)明人已發(fā)表，。
現(xiàn)有技術不能直接用于制備本發(fā)明所述的具有光學活性黃皮酰胺及其衍生物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一類新的光活的手性藥物黃皮酰胺衍生物。
本發(fā)明的另一目的在于提供制備本發(fā)明的光學活性黃皮酰胺衍生物的方法；
本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的光學活性化合物(一)黃皮酰胺在制備促智，抗衰老作用藥物的應用。
具體講，本發(fā)明涉及如通式(I)所示的黃皮酰胺光活衍生物中的另外14個立體異構體，組成互為非對映關系的7對對映異構體，(其構型與命名如表2) 其中，各個碳原子的立體構型為I2(3R，4S，5R，6S) (+)新黃皮酰胺(3S，4R，5S，6R) (-)新黃皮酰胺I3(3R，4S，5S，6S) (+)表黃皮酰胺(3S，4R，5R，6R) (-)表黃皮酰胺I4(3R，4S，5R，6R) (+)表新黃皮酰胺(3S，4R，5S，6S) (-)表新黃皮酰胺I5(3S，4S，5S，6R) (+)順黃皮酰胺(3R，4R，5R，6S) (-)順黃皮酰胺I6(3R，4R，5S，6R) (+)順新黃皮酰胺(3S，4S，5R，6S) (-)順新黃皮酰胺I7(3S，4S，5S，6S) (+)順表黃皮酰胺(3R，4R，5R，6R) (-)順表黃皮酰胺I8(3R，4R，5S，6S) (+)順表新黃皮酰胺(3S，4S，5R，6R) (-)順表新黃皮酰胺根據(jù)本發(fā)明，還涉及黃皮酰胺光活衍生物中I2、I4、I5、I6、I7和I8的制備方法，反應路線如路線1所示。
路線1其中(a)堿催化環(huán)合可用NaOCH3、(CH3)4NOH或二異丙基胺基鋰(LDA)；(b)拆分劑(-)-薄荷醇氧乙酰氯、N保護的氨基酸酰氯；(c)羥基的保護，二氫吡喃，乙酰氯/吡啶或乙酸酐/吡啶；(d)還原C6酮的還原劑NaBH4或L-selectride；(e)還原C6酮的還原劑Al(i-C3H7O)3；(f)氧化C3-OH的氧化劑K2Cr2O7/H+、或KMnO4+CuSO4、MnO2orDMSO/(COCl)2；(g)還原Δ3，4雙鍵的還原劑NaBH4/H+、NaBH4/AlCl3或催化氫化；(h)C3-OH的構型反轉，用偶氮甲酸二異丙酯(DIAD)或偶氮甲酸二乙酯(DEAD)/TPP，H+(Mitsunobu method)或以CsOAc/18-冠醚-6完成。
本路線均以已知的消旋或光活的N-甲基-N-苯甲?；?3-苯基縮水甘油酰胺(A)為原料。若以光活的化合物A為原料，則可略去步驟2(b)拆分這一步。
本發(fā)明化合物中黃皮酰胺的光活立體異構體中I3(C6差向異構體表黃皮酰胺)的制備方法如路線2所示。
路線2本路線原料的原料消旋3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧-I3)為已知化合物，是拜爾藥廠合成消旋黃皮酰胺的中間體[Walfgang Hartwig，Liborrious Born，J.Org，Chem.，1987，52，4352.]的副產(chǎn)物。本路線經(jīng)化合物3-去氧-I3引入C3位羥基得到消旋表黃皮酰胺(I3)?；蛳炔鸱值玫?-去氧-I3的光活體，然后引羥得到光活的表黃皮酰胺(I3)。
(1)3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧-I3)中引入3位羥基，采用的條件是選自二異丙基胺基鋰(LDA)/O2/亞磷酸三乙酯(P(OEt)3)/六甲基磷酰胺(HMPT)/THF。
(2)3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧-I3)的拆分，拆分劑選自O-乙酰-R-扁桃酸、O-乙酰-S-扁桃酸、薄荷醇氧乙酸、N-保護的氨基酸。
(3)水解拆分劑采用K2CO3/CH3OH的條件。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明化合物和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-95重量％的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領域公知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等，優(yōu)選口服。
本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射和皮內注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應用。
例如，將本發(fā)明化合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調節(jié)劑等。這些輔料是本領域常用的此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
為達到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明中藥學成分的使用劑量是本領域技術人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實際藥物數(shù)量，加以適當?shù)恼{整，以達到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預防或治療目的。本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍本發(fā)明的化合物的用量為0.001-150mg/Kg體重，優(yōu)選為0.01-100mg/Kg體重，更優(yōu)選為0.01-60mg/Kg體重，最優(yōu)選為0.1-10mg/Kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。
每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對癥藥物合并使用并調整劑量。
在對人胚胎腦神經(jīng)干細胞克隆形成率的試驗中本發(fā)明的化合物具有明顯促進人胚胎腦神經(jīng)干細胞克隆形成的作用，說明本發(fā)明的化合物具有治療老年性神經(jīng)退行性疾病如老年性癡呆的作用。
在對神經(jīng)細胞胞漿游離鈣的影響的試驗中本發(fā)明的化合物有升高神經(jīng)細胞胞漿游離鈣水平的趨勢。鈣作為第二信使在細胞活動中起著重要作用，胞漿游離鈣濃度的變化與許多生理/病理刺激和細胞內效應器的反應具有密切關系。
在對大鼠海馬長時程增強(LTP)的試驗中本發(fā)明化合物對大鼠海馬長時程增強(LTP)具有明顯的增強作用，(P＜0.05vs control，n＝5)。本發(fā)明化合物對神經(jīng)細胞基礎突觸傳遞有增強作用，說明本發(fā)明的化合物有促智作用。


圖1 16種光學活性黃皮酰胺對人胚腦神經(jīng)干細胞的影響具體實施方式
實施例1光活新黃皮酰胺(I2)的制備(見路線1)消旋新黃皮酰胺酮的拆分消旋新黃皮酰胺酮2.7g，加至由2.7g(-)-薄荷醇氧乙酸制備的(-)-薄荷醇氧乙酰氯的30mL的二氯甲烷溶液，以冰水浴冷卻，然后加入1.5mL吡啶，室溫攪拌至反應完全，反應液以50mL的二氯甲烷稀釋，依次以2N鹽酸，飽和碳酸鈉溶液和食鹽水洗，有機層用無水硫酸鈉干燥。濃縮后得6g油狀物，加入己烷固化，固體過濾，以甲醇重結晶得1.48g 3-O-[(-)薄荷醇氧乙?；鵠-(3R，4S，5R)-新黃皮酰胺酮[酯(a)]，mp170-172℃，[α]D15＝-50.9(c，1.25，CHCl3)，收率33.8％。濾液柱層析得到3-O-[(-)薄荷醇氧乙酰基]-(3S，4R，5S)-新黃皮酰胺酮[酯(b)]，mp104-105℃，[α]D15＝-31.2(c，1.40，CHCl3)，收率31.8％。酯(a)和酯(b)分別以對甲苯磺酸的甲醇溶液水解，蒸去甲醇，殘余物溶于二氯甲烷，溶液依次以堿和酸的水溶液洗，從6g酯(a)得到3.25g的(-)-(3R，4S，5R)-新黃皮酰胺酮，收率86％，mp164-167℃，[α]D15＝-14.9(c，0.60，CHCl3)；5.5g酯(b)得到3.0g的(+)-(3S，4R，5S)-新黃皮酰胺酮，收率89％，mp167-169℃，[α]D15＝+14.1(c，0.54，CHCl3)。
光活新黃皮酰胺(I2)由光活新黃皮酰胺酮的3-O-四氫吡喃醚還原得到。
(+)-3-O-四氫吡喃基新黃皮酰胺酮0.45g(1.19mmol)的10ml無水四氫呋喃液注入到-25--30℃的2.5ml 1.0M LTBB/THF中，反應1小時后，用40ml冰水(含2ml，30％H2O2)分解，用二氯甲烷提取，合併提取液，依次用2N NaOH、飽和NaHCO3及NaCl水溶液洗滌(PH≈8)，無水硫酸鈉干燥，濃縮得油狀物，用3ml無水乙醇及25mg TSOH·H2O，60℃反應30分鐘，稍冷后加乙醚5ml，續(xù)冷析出(+)-(3R，4S，5R，6S)-新黃皮酰胺(I2)，mp186-187℃，[α]D18＝+89.5(c，0.20，MeOH)，收率77.9％。
(-)-3-O-四氫吡喃基新黃皮酰胺酮0.379g(1.0mmol)，同上法還原去保護得(-)-(3S，4R，5S，6R)-新黃皮酰胺(I2)，mp186-187℃，[α]D18＝-88.6(c，0.18，MeOH)，收率77.4％。
實施例2光活表新黃皮酰胺(I4)的制備(+)-(3S，4R，5S)-新黃皮酰胺酮1.05g(3.56mmol.)，異丙醇鋁2.4g(11.75mmol.)溶于30ml無水無水異丙醇中，加熱攪拌，慢慢蒸出異丙醇及丙酮，并同時等速滴加無水異丙醇，約6.5小時反應完成，蒸除大部分溶劑，冷至室溫加60ml水及20ml 3N鹽酸室溫攪拌，析出大量白色固體，用甲醇重結晶，得(-)-(3S，4R，5S，6S)-表新黃皮酰胺，收率85％，m.p.217-219℃，[α]D24＝-36.5(c，0.128，MeOH)。用甲醇再次重結晶，m.p.221-222℃，[α]D20＝-37.3(c，0.15，MeOH)。
(-)-(3R，4S，5R)-新黃皮酰胺酮為原料，同上操作，以異丙醇鋁還原，得(+)-(3R，4S，5R，6R)-表新黃皮酰胺，m.p.220-222℃，[α]D20＝+36.5(c，0.16，MeOH)。
實施例3表黃皮酰胺(I3)的制備(見路線2)A(±)-表黃皮酰胺(I3)的制備將(±)-(4R*，5R*，6R*)-3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧I3)90mg(0.032mmol.)，用2.5mL無水THF和0.7mL六甲基磷酰胺溶解(N2保護下)，冷至-70℃，攪拌5分鐘，用注射器加入1mL(0.32mmol.)新制的二異丙基氨基鋰THF溶液，-60℃至-70℃下攪拌1小時，加入亞磷酸三乙酯53ul，通入依次經(jīng)過氫氧化鉀、濃硫酸、無水氯化鈣處理過的O2，保持溫度在-60℃至-70℃，2小時后停止通氣，反應液用0.5mol/L鹽酸在冰水浴下調至PH值＝3-4，再依次用乙酸乙酯洗、水洗、氯化鈉水溶液洗，無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)溶劑后柱層析得到標題化合物40mg，回收原料40mg，收率40％，重結晶mp193-195℃。
B(-)-(3S，4R，5R，6R)-表黃皮酰胺(I3)和(+)-(3R，4S，5S，6S)-表黃皮酰胺(I3)的制備將(±)-3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧I3)600mg溶于30mL無水二氯甲烷中，再將O-乙酰-(-)-R-扁桃酸621mg，4-(二甲基氨基)吡啶26mg及1，3-二環(huán)己基碳酰亞胺880mg依次加入，室溫下攪拌1小時，濾去不溶物，20mL二氯甲烷洗滌濾餅，有機相用2mol/L鹽酸洗至偏酸，再用飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗，無水硫酸鈉干燥過夜，蒸去溶劑得油狀物930mg。硅膠H乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2。純化得(4R，5R，6R)-5-O-乙酰-R-扁桃?；?3-去氧表黃皮酰胺452mg，收率46％，mp212-215℃；和(4S，5S，6S)-5-(O-乙酰-R-扁桃酰)-O-3-去氧表黃皮酰胺370mg，mp 206-209℃，收率40％。
將(4S，5S，6S)-5-(O-乙酰-R-扁桃酰基)-O-3-去氧表黃皮酰胺234mg溶于20mL甲醇和10mL二氯甲烷中，加入碳酸鉀141mg，室溫攪拌12小時。用2mol/L鹽酸中和后減壓蒸去溶劑，再用二氯甲烷溶解，水洗后用飽和氯化鈉水溶液洗一次，無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)溶劑得150mg固體。柱層析純化得(+)-(4S，5S，6S)-3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧I3)134mg，白色固體，收率93％。mp239-242℃[α]30D＝+137(c，0.465，甲醇)按上步反應同樣的方法，將(4R，5R，6R)-5-O-乙酰-R-扁桃?；?3-去氧表黃皮酰胺以K2CO3/CH3OH處理得到(-)-(4R，5R，6R)-3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧I3)，白色固體，收率與上相近，mp237-240℃，[α]30D＝-136(c，0.480，甲醇)。
以(-)-(4R，5R，6R)-3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧I3)或(+)-(4S，5S，6S)-3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧I3)為原料，應用消旋3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧I3)引入3位羥基的方法，可分別得到(-)-(3S，4R，5R，6R)-表黃皮酰胺(I3)，mp107-109℃，[α]29D＝-204(c，0.445，甲醇)或(+)-(3R，4S，5S，6S)-表黃皮酰胺(I3)，mp108-110℃[α]29D＝+201(c，0.245，甲醇)。
實施例4順黃皮酰胺(I5)的制備 路線5順黃皮酰胺(I5)的制備酸性重鉻酸鈉溶液(0.7g重鉻酸鈉，0.7g濃硫酸和5mL水配成)加至0.25g的(+)-(3S，4R，5S)新黃皮酰胺酮的10ml二氯甲烷溶液，在室溫攪拌5小時，加入二氯甲烷提取，提取液依次以碳酸氫鈉溶液和水洗，蒸去溶劑，殘留物以甲醇重結晶得0.19g，收率78％，mp157-159℃，[α]D15＝-199.6(c，0.75，CHCl3)的(-)-(5S)Δ3，4-新黃皮酰胺酮(-)-(5S)-Δ3，4-新黃皮酰胺酮0.1克溶于含有1ml醋酸，0.01mol硼氫化鈉的10ml二氯甲烷，攪拌，以薄層跟蹤反應完畢后，滴入醋酸以分解剩余的硼氫化鈉，然后加入20ml二氯甲烷，反應液傾至50ml冰水中，分離出有機層，依次以飽和碳酸氫鈉水溶液和水洗，蒸去二氯甲烷，殘留物柱層折得0.074g的(-)-(3S，4S，5S)-順黃皮酰胺酮，收率73％，mp145-147℃，[α]D20＝-111.0(C，0.48，CHCl3)。
(-)-(3S，4S，5S)-順黃皮酰胺酮0.08g溶于10ml二氯甲烷，以0.01g硼氫化鈉/甲醇還原，在反應完畢后加入30ml二氯甲烷，然后以乙酸處理剩余硼氫化鈉，用碳酸氫鈉和水洗，蒸去溶劑得油狀物，以丙酮和石油醚重結晶，得(+)-(3S，4S，5S，6R)-順黃皮酰胺(I5)的晶體0.59g，收率77％，mp197-199.5℃，[α]D22＝+6.30(c，0.46，CHCl3)。
以(-)-(3R，4S，5R)-新黃皮酰胺酮為原料，按上述方法反應得(+)-(5R)-Δ3，4-新黃皮酰胺酮，收率75％，m.p.154-156℃，[α]15D＝+206.8(c，0.90，CHCl3)；(+)-(3R，4R，5R)-順黃皮酰胺酮，收率76％，m，p，130-132℃，[α]D20＝+116.5(c，40，CHCl3)；(-)-(3R，4R，5R，6S)-順黃皮酰胺(I5)，產(chǎn)率69％，m，p，196-198℃，[α]D22＝-6.07(c，0.67，CHCl3)。
實施例5順表黃皮酰胺(I7)的制備 R＝-CO-R’(R’＝C1-C6)，四氫吡喃，MEM[(2-甲氧基-乙氧基)-亞甲基)，MOM(甲氧基亞甲基)路線6順表黃皮酰胺(I7)的制備將0.2克6-O-乙酰表新黃皮酰胺溶于20ml二氯甲烷溶劑中，分批滴加重鉻酸鈉的酸性水溶液(Na2Cr2O7/H2SO4＝20mol/7mol)5ml，室溫攪拌至原料點消失，加入20mlCH2Cl2稀釋，分去水層，用水和飽和碳酸氫鈉水溶液分別洗滌有機層，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑后得淺棕色固體，柱層折分離(CH2Cl2/CH3OH 50/1)得產(chǎn)物0.163g，mp166.5-168℃，產(chǎn)率65％。
本方法亦適用于相應光活體的合成.
由(+)-(3R，4S，5R，6R)-表新黃皮酰胺得(5R，6R)-6-O-乙酰-Δ3，4-表黃皮酰胺，[α]D22＝+80.4°(c，0.47，CHCl3)，mp170-172℃，由(-)-(3S，4R，5S，6S)-表新黃皮酰胺得(5S，6S)-6-O-乙酰-Δ3，4-表黃皮酰胺，[α]D22＝-83.4°(c，0.37，CHCl3)，mp168-170℃。
將0.1g 6-O-乙酰-Δ3，4-表黃皮酰胺溶于20mL二氯甲烷中，室溫下滴加冰醋酸0.5mL，分批加入0.2g硼氫化鈉，攪拌至原料點消失，再加入20mL二氯甲烷稀釋，傾入50mL冰水中，攪拌數(shù)分鐘后分去水層，有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌2次，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得到白色固體，用乙醚/石油醚重結晶得到白色絲狀晶體0.073g，mp128-130℃，收率71％。
本方法同樣適用于光活體的合成，由光活的原料分別得到(+)-(3R，4R，5R，6R)-6-O-乙酰順表黃皮酰胺，mp128-130℃，[α]D16＝+13.8(c，0.50，CHCl3)；(-)-(3S，4S，5S，6S)-6-O-乙酰順表黃皮酰胺，mp126-128℃，[α]D16＝-14.3(c，0.43，CHCl3)。
將0.07g 6-O-乙酰順表黃皮酰胺溶于10mL甲醇中，加入0.05g無水碳酸鉀，室溫下攪拌至原料點消失，蒸去大部分溶劑后，加入30mL二氯甲烷稀釋，分別用0.1N鹽酸、水和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑得到白色固體，用丙酮/乙醚/石油醚重結晶得到白色絲狀固體0.04g，mp191-193℃，收率65％。
本方法同樣適用于光活體的合成，由光活的原料可得到(-)-(3R，4R，5R，6R)順表黃皮酰胺(I7)，mp197-199℃，[α]D15＝-38.7(c，0.385，CHCl3)；(+)-(3S，4S，5S，6S)順表黃皮酰胺(I7)，mp199-202℃，[α]D16＝+39.7(c，0.785，CHCl3)。
實施例6順新黃皮酰胺(I6)和順表新黃皮酰胺(I8)的制備 路線7順新黃皮酰胺(I6)和順表新黃皮酰胺(I8)的制備A順新黃皮酰胺酮的制備方法一，以偶氮二甲酸二乙酯/氯乙酸/三苯磷轉位的方法制備順新黃皮酰胺酮將2.10g mL的偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)漸漸滴入1.5g(-)-(3R，4S，5R)-新黃皮酰胺酮，2.6g三苯磷和0.99g氯乙酸的甲苯溶液中，反應液在室溫下攪拌12小時，然后加入乙酸乙酯和石油醚的混合液，過濾，濾餅以乙酸乙酯洗滌，合并濾液和洗滌液，以水洗后蒸去溶劑，殘余物以750mg對甲苯磺酸的3mL甲醇溶液在室溫下攪拌18小時，蒸去甲醇，殘余物溶于二氯甲烷，有機層依次用碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗，蒸去溶劑，殘余物經(jīng)柱層析分離后重結晶得到1.05g(-)-(3S，4S，5R)-順新黃皮酰胺酮，mp145.8-146.9℃，[α]D25＝-138.6(c，0.81，CHCl3)。
以(+)-(3S，4R，5S)-新黃皮酰胺酮為原料，按上述方法，得到(+)-(3R，4R，5S)-順新黃皮酰胺酮，mp143.8-145.7℃，[α]D25＝+139.8(c，1.74，CHCl3)。
方法二，以碳酸銫/冠醚轉位的方法制備順新黃皮酰胺酮消旋新黃皮酰胺酮1g溶于10mL無水吡啶中，冰水浴冷卻下加入0.42g甲磺酰氯，然后在室溫下攪拌至反應完全，加入50mL二氯甲烷稀釋反應液，以稀鹽酸中和，然后水洗，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑得到殘余物1.18g，收率94％。
取上述磺酸酯0.5g溶于30mL無水苯中，加入4.1g醋酸銫和2.4g二苯酰-18-冠醚-6，加熱洄流至反應完全，冷卻濃縮除去苯，柱層析得3-O-乙酰順新黃皮酰胺酮0.39g，油狀物，收率87％。
以上述3-O-乙酰順新黃皮酰胺酮0.27g溶于40mL甲醇中，加入對甲苯磺酸118mg，加熱洄流至反應完全，蒸去甲醇，殘余物溶于二氯甲烷，依次以飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水溶液洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮得到固體0.21g收率89％，乙酸乙酯/石油醚重結晶得到消旋順新黃皮酰胺酮，mp189.3-192.4℃。
本法以光活新黃皮酰胺酮為原料得到光活順新黃皮酰胺酮，結果與方法一相同。
B順新黃皮酰胺酮還原制備順表新黃皮酰胺(I8)消旋順新黃皮酰胺的制備將0.15g(0.5mmol)(±)順新黃皮酰胺酮溶于20ml甲醇中，攪拌下分批加入0.41g(1.1mmol)硼氫化鈉，室溫攪拌3小時，TLC(乙酸乙酯/石油醚＝2∶1)監(jiān)測原料點消失，并有Rf值0.26和0.33兩點生成，用醋酸中和，并傾入到50mlCH2Cl2/20ml冰水攪拌液中，然后分出有機層，分別用水、飽和NaHCO3洗滌，無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑得白色固體0.134g，柱層分離，得前組分(±)順新黃皮酰胺0.04g，收率26.5％，用乙醚重結晶，得白色絲狀結晶，m.p164.5-166℃，和后組分(±)順表新黃皮酰0.075g，收率49.7％，甲醇重結晶得白色片晶，m.p252-254℃，光活順新黃皮酰胺的制備以250mg(+)-3R，4R，5S-順新黃皮酰胺酮為原料，同上操作，用硼氫化鈉還原，得(+)-(3R，4R，5S，6R)-順新黃皮酰胺73mg，收率29％，m.p164.5-166℃，[α]D20＝+66.7(c，0.525，MeOH)；同時還得到3R，4R，5S，6S-順表新黃皮酰胺132mg，收率52.45％，m.p248-250℃，[α]D22+19.2(c，0.525，MeOH)以250mg(-)-3S，4S，5R-順新黃皮酰胺酮為原料，同上操作，用硼氫化鈉還原，得(-)-(3S，4S，5R，6S)-順新黃皮酰胺67mg，收率26.6％，m.p168-170℃，[α]D22＝-65.3(c，0.32，MeOH)；同時還得到(-)-(3S，4S，5R，6R)-順表新黃皮酰胺134mg，收率53.24％m.p250-252℃，[α]D22＝-20.75(c，0.265，MeOH)上述(-)-(3S，4S，5R)-順新黃皮酰胺酮100mg溶于5mL異丙醇鋁中，加入160mg異丙醇鋁，在100℃的油浴中加熱，攪拌蒸出異丙醇和丙酮，并等速補加無水異丙醇，歷時數(shù)小時后反應完畢，蒸去大部分異丙醇，加水以分解異丙醇鋁，以6N的鹽酸酸化，冰水浴冷卻析出90mg的片晶，薄層層析顯示產(chǎn)物中順表新黃皮酰胺(I8)和順新黃皮酰胺(I6)的比率約為3/1，總收率90％，以甲醇重結晶得到(-)-(3S，4S，5R，6R)-順表新黃皮酰胺(I8)，mp271.1-273℃，[α]D30＝-33.3(c，0.34，DMSO)
以(+)(3R，4R，5S)-順新黃皮酰胺酮為原料，按上述方法還原可得到(+)-(3R，4R，5S，6S)-順表新黃皮酰胺(I8)，mp275-277℃，[α]D30＝+31.2(c，0.31，DMSO)表二黃皮酰胺16個光活異構體的常數(shù)

藥理實驗實驗例1本發(fā)明化合物對人胚胎腦神經(jīng)干細胞克隆形成率的影響目的和意義神經(jīng)干細胞數(shù)量的增加或壽命的延長對增加神經(jīng)元和防止神經(jīng)元丟失具有特別重要的意義。我們建立人胚胎腦神經(jīng)干細胞的特殊培養(yǎng)結合細胞克隆形成的方法檢測黃皮酰胺16個光活異構體是否具有促進神經(jīng)干細胞增殖的作用。
方法人胚胎腦神經(jīng)干細胞在含有表皮生長因子(EGF)20ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子(FGF-2)20ng/ml、N-2添加劑的DMEM/F12培養(yǎng)基(購于BIBCO公司)和在5％CO2和37℃培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。用0.1％胰蛋白酶溶液將人胚胎腦神經(jīng)干細胞的神經(jīng)球消化成單細胞懸液，離心1000rpm×5min，再用培養(yǎng)基沖洗，細胞經(jīng)接種于96孔培養(yǎng)板中，神經(jīng)干細胞1×103細胞/孔，每組4孔，連續(xù)培養(yǎng)。24h后加藥，16種光學活性的黃皮酰胺異構體(No.1-No.16名稱見表1)的給藥劑量為1μM，每周換一次含藥的低營養(yǎng)培養(yǎng)基(FGF-22ng/ml、EGF 2ng/ml和N-2添加劑的DMEM/F12培養(yǎng)基)，每周兩次在顯微鏡下觀測細胞生長狀態(tài)，在第3周，4周，6周分別在顯微鏡下計數(shù)細胞克隆數(shù)，用t檢驗與對照組進行統(tǒng)計學處理。
結果見表1和附圖1表1-A.16種化合物對人胚胎腦神經(jīng)干細胞克隆形成的影響

●p＜0.05(single tail T test)；#p＜0.05(double tail T test)表1-B.本發(fā)明化合物對人胚胎腦神經(jīng)干細胞克隆形成的影響


●*P＜0.05；#P＜0.01。
結論本發(fā)明的16種光學活性黃皮酰胺異構體中有三種黃皮酰胺(異構體I2((+)新黃皮酰胺))；I4((-)表新黃皮酰胺)和I6((-)順新黃皮酰胺)具有明顯促進人胚胎腦神經(jīng)干細胞克隆形成的作用，這對老年性神經(jīng)退行性疾病如老年性癡呆等具有特別重要的意義。
實驗例2、化合物對神經(jīng)細胞胞漿游離鈣的影響目的和意義鈣作為第二信使在細胞活動中起著重要作用，胞漿游離鈣濃度的變化是聯(lián)系許多生理/病理刺激和細胞內效應器反應之間的樞紐，化合物對胞漿游離鈣濃度的影響在藥物篩選中有著重要意義。
方法取新生大鼠，分離大腦皮層神經(jīng)細胞，制備單細胞懸液106細胞/ml，在37度條件下，細胞經(jīng)熒光探針(Fura-2/AM，購于SIGMA公司)5μM劑量進行負載40min，在日本SHIMADZU RF-5000熒光光密度測定儀中測定細胞內鈣離子的熒光強度，在靜息時和加入藥物37℃溫育5分鐘，以及50mM KCl刺激后的胞漿游離鈣濃度，分別計算加藥5分鐘和加入KCl后的胞漿游離鈣升高幅度，每種化合物重復做5-8次(N＝5～8)，結果合并計算出每個化合物的細胞內游離鈣濃度。
結果見表2表2.16個化合物對神經(jīng)細胞胞漿游離鈣的影響


本發(fā)明的化合物中有6黃皮酰胺(I1(+)黃皮酰胺)；(I2(+)新黃皮酰胺)；(I3(-)表黃皮酰胺)；(I6(-)順新黃皮酰胺)；(I7(-)順表黃皮酰胺)；(I8(-)順表新黃皮酰胺)有升高胞漿游離鈣水平的趨勢。鈣作為第二信使在細胞活動中起著重要作用，胞漿游離鈣濃度的變化與許多生理/病理刺激和細胞內效應器的反應具有密切關系。
實驗例3本發(fā)明化合物對大鼠海馬長時程增強(LTP)的影響目的和意義黃皮酰胺在多種行為學實驗中表現(xiàn)出明顯的促智作用，但其對突觸傳遞活動的影響目前還不清楚，而突觸是神經(jīng)系統(tǒng)中細胞間信息傳遞和加工的基礎環(huán)節(jié)，其功能活動和形態(tài)結構上的改變是學習記憶活動的神經(jīng)生物學基礎，因此，本實驗采用電生理學技術從突觸水平對黃皮酰胺的促智作用進行研究。
方法成年雄性SD大鼠(5只/組)以20％(w/v)烏拉坦(1.0g·kg-1，ip)麻醉并固定于立體定位儀上。參照Pellegrino大鼠腦立體定位圖譜，在海馬齒狀回顆粒細胞層埋藏記錄電極(外覆絕緣層，尖端裸露0.2mm，直徑0.2mm的不銹鋼針)。側腦室給予表9所示的4對光學活性的黃皮酰胺。刺激電極(兩枚間距0.5mm，外覆聚四氟乙烯絕緣層，尖端裸露0.2mm，直徑0.15mm的不銹鋼針構成)埋植于大鼠內嗅區(qū)穿通路(perforant path，PP)纖維間。電子刺激器產(chǎn)生持續(xù)的電流刺激后，經(jīng)刺激隔離器和刺激電極輸向PP。調整刺激電極的位置，直到觀察到典型的興奮性突觸后電位(EPSP)。電流通過放大器放大后，經(jīng)過計算機DataWave軟件處理。刺激強度則采用引起最大群峰電位(Populationspike，PS)所需刺激強度的1/2。在整個實驗過程中，每30秒鐘給予一次測試刺激頻率，記錄群峰電位幅度(Population spike amplitude，PSA)，根據(jù)公式(PSA/基礎幅度值)計算出相對的PSA百分率。
結果見表3表3.16種光學活性黃皮酰胺對大鼠海馬長時程增強(LTP)的結果

結論由實驗結果(表達)可知，本發(fā)明16種光學活性黃皮酰胺異構體中有4種黃皮酰胺異構體((I6(+)順新黃皮酰胺)；(I5(-)順黃皮酰胺)；(I1(-)黃皮酰胺)；(I3(+)表黃皮酰胺))對大鼠海馬長時程增強(LTP)具有明顯的增強作用，(P＜0.05vs control，n＝5)。本發(fā)明化合物對神經(jīng)細胞基礎突觸傳遞有增強作用，說明本發(fā)明的化合物有促智作用。
權利要求
1.如通式(I)所示的黃皮酰胺光活立體異構體化合物 其特征在于I2(3R，4S，5R，6S) (+)新黃皮酰胺(3S，4R，5S，6R) (-)新黃皮酰胺I3(3R，4S，5S，6S) (+)表黃皮酰胺(3S，4R，5R，6R) (-)表黃皮酰胺I4(3R，4S，5R，6R) (+)表新黃皮酰胺(3S，4R，5S，6S) (-)表新黃皮酰胺I5(3S，4S，5S，6R) (+)順黃皮酰胺(3R，4R，5R，6S) (-)順黃皮酰胺I6(3S，4S，5S，6S) (+)順表黃皮酰胺(3R，4R，5R，6R) (-)順表黃皮酰胺I7(3R，4R，5S，6R) (+)順新黃皮酰胺(3S，4S，5R，6S) (-)順新黃皮酰胺I8(3R，4R，5S，6S) (+)順表新黃皮酰胺(3S，4S，5R，6R) (-)順表新黃皮酰胺
2.如權利要求1所述光活立體異構體化合物I2、I4、I5、I6、I7和I8的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 路線1其中(a)堿催化環(huán)合可用NaOCH3、(CH3)4NOH或二異丙基胺基鋰(LDA)；(b)拆分劑(-)-薄荷醇氧乙酰氯、N保護的氨基酸酰氯；(c)羥基的保護，二氫吡喃，乙酰氯/吡啶或乙酸酐/吡啶；(d)還原C6酮的還原劑NaBH4或L-selectride；(e)還原C6酮的還原劑Al(i-C3H7O)3；(f)氧化C3-OH的氧化劑K2Cr2O7/H+、或KMnO4+CuSO4、MnO2orDMSO/(COCl)2；(g)還原Δ3，4雙鍵的還原劑NaBH4/H+、NaBH4/AlCl3或催化氫化；(h)C3-OH的構型反轉，用偶氮甲酸二異丙酯(DIAD)或偶氮甲酸二乙酯(DEAD)/TPP，H+(Mitsunobu method)或以CsOAc/18-冠醚-6完成；本路線均以已知的消旋或光活的N-甲基-N-苯甲?；?3-苯基縮水甘油酰胺(A)為原料。若以光活的化合物A為原料，則可略去步驟2(b)拆分這一步。
3.如權利要求1所述光活立體異構體化合物I3(C6差向異構體表黃皮酰胺)的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 路線2消旋3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧-I3)引入C3位羥基得到消旋表黃皮酰胺(I3)；或先拆分得到3-去氧-I3的光活體，然后引羥得到光活的表黃皮酰胺(I3)；(1)3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧-I3)中引入3位羥基，采用的條件是選自二異丙基胺基鋰(LDA)/O2/亞磷酸三乙酯(P(OEt)3)/六甲基磷酰胺(HMPT)/THF；(2)3-去氧表黃皮酰胺(3-去氧-I3)的拆分，拆分劑選自O-乙酰-R-扁桃酸、O-乙酰-S-扁桃酸、薄荷醇氧乙酸、N-保護的氨基酸；(3)水解拆分劑采用K2CO3/CH3OH的條件。
4.一種藥物組合物，其特征在于，含有有效劑量的如權利要求1所述的任一化合物，以及藥效學上可接受的載體。
5.如權利要求1所述的化合物在制備促智，抗衰老作用藥物的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及羥芐基、羥基、苯基取代γ－內酰胺(黃皮酰胺)的立體異構體，光活的立體異構體，及它們的制備方法，以它們作為活性物質的藥物組合物，和它們在制備促智，抗衰老藥物的應用。
文檔編號C07D207/267GK1618790SQ20031012387
公開日2005年5月25日 申請日期2003年12月31日 優(yōu)先權日2002年12月31日
發(fā)明者黃量, 張均田, 吳克美, 鄭國鈞, 馮志強, 陳世明 申請人:中國醫(yī)學科學院藥物研究所