具有延長體內(nèi)半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領域，具體涉及一種血管性血友病因子裂解酶的突 變體ADAMTS13-MDTCS與人血清白蛋白HSA的融合蛋白、制備方法及其在制備治療血栓性血 小板減少性紫癜（TTP)藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] I. 1血栓性血小板減少性紫癜
[0003] 血檢性血小板減少性紫癒（thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)是一 種微血管血栓出血綜合征，是因為血小板大量消耗而減少，在血液微循環(huán)中形成了血小板 血栓，臨床特征表現(xiàn)為在皮膚表面形成紫癜。微血管溶血性貧血和血小板減少是本疾病最 核心的兩大特征，另外或伴有神經(jīng)系統(tǒng)損傷、腎臟損害及發(fā)熱表現(xiàn)。臨床上TTP分先天性 TTP (基因突變）和獲得性TTP (產(chǎn)生自身抗體）。TTP臨床表現(xiàn)預后差，病程短，死亡率高， 達80%~90%，TTP緩解后復發(fā)率較高，為30%~60%。在TTP臨床治療方面，目前尚無 特效藥，治療通常采用血漿置換療法或全血置換療法，此類治療方法費用高昂，過程復雜， 且副作用較多，臨床上存在交叉感染等諸多風險。因此，TTP的新型藥物的研發(fā)成為治療本 病的關(guān)鍵。
[0004] I. 2ADAMTS13 與 TTP
[0005] 血管性血友病因子裂解酶（A Disintegrin And Metalloprotease with Thrombospondin type Repeats 13, ADAMTS13)是 ADAMTS 家族的成員之一，屬于金屬蛋 白酶。ADAMTS13基因位于9號染色體長臂（9q34)，cDNA全長4597kb，由29個外顯子組 成，開放閱讀框為4284bp，編碼1427個氨基酸。ADAMTS13蛋白由肝臟內(nèi)皮細胞合成并分 泌到血液中，其主要功能是剪切在新生的富血小板血栓內(nèi)的血管性血友病因子（VWF因 子），以防止溶血、血小板減少和組織梗塞。該酶在正常機體內(nèi)可以特異性地裂解VWF-A2 區(qū)的Tyrl605-Metl606之間的肽鍵，從而使VWF裂解，保持正常的止血和血循環(huán)功能。當 ADAMTS13缺乏或活性減低時，不能夠有效的裂解VWF與血小板糖蛋白結(jié)合形成的超大分子 量VWF (UL-VWF)分子時，便使之形成富含血小板和VWF的血栓，導致TTP的發(fā)生。由于發(fā)現(xiàn) TTP發(fā)病與ADAMTS13蛋白酶的功能缺失密切相關(guān)，因此ADAMTS13重組蛋白成為治療TTP疾 病的新的研宄方向。目前，體外表達ADAMTS13基因，獲得功能性的ADAMTS13重組蛋白，仍 處于實驗研宄階段。
[0006] I. 3ADAMTS13 全長蛋白（ADAMTS13-FL)與 ADAMST13 截斷型突變體 (ADAMTS13-MDTCS)
[0007] ADAMTS13作為ADAMTS家族一員，ADAMTS13-FL包含以下公共結(jié)構(gòu)域，分別是信號 肽（signal sequence, SP)，前導肽（propeptide, P)，金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域（metalIoprotease domain, Μ)，去整合素樣結(jié)構(gòu)域（disintegrin-like domain, D)，I型血小板反應蛋白重復序 列（thrombospondin typel, TSPl)，富含半H光氨酸結(jié)構(gòu)域（cysteine-rich domain, C)，空間 結(jié)構(gòu)域（spacer domain, S)，空間結(jié)構(gòu)域后面是7個TSPl重復序列，和ADAMTS13特有的2 個CUB結(jié)構(gòu)域。
[0008] ADAMTS13-MDTCS則包含除了 7個TSPl重復序列和ADAMTS13特有的2個CUB結(jié)構(gòu) 域，其他功能結(jié)構(gòu)域，分別是信號肽，前導肽，金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域，去整合素樣結(jié)構(gòu)域，I型血 小板反應蛋白重復序列，富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，空間結(jié)構(gòu)域，取每個結(jié)構(gòu)域的首字母，因此 稱作MDTCS突變體。
[0009] 有研宄報道ADAMTS13-MDTCS擁有與ADAMTS13-FL同等的生物學功能，但是 ADAMTS13-MDTCS蛋白大小遠遠小于ADAMTS13-FL，因此體外表達生產(chǎn)蛋白的難度更小，預 期的產(chǎn)量也較大，另外更重要的一點是：設計具有蛋白裂解活性但又不被ADAMTS13抗體所 抑制的ADAMTS13重組體蛋白是解決獲得性TTP的關(guān)鍵，可以有效降低ADAMTS13抗體治療 失敗的風險，也有效減少獲得性TTP患者血漿置換治療的頻率。
[0010] 但是，根據(jù)前期的實驗結(jié)果，ADAMTS13-MDTCS蛋白在小鼠體內(nèi)的半衰期實驗表明， ADAMTS13-MDTCS蛋白半衰期較短，均在2小時之內(nèi)，與正常血漿中ADAMTS13蛋白的半衰期 1-2天，差距較大，半衰期較短減少了藥物有效窗口期，降低了本實驗室開發(fā)TTP治療蛋白 藥物的可能性，因此，有效延長ADAMTS13-MDTCS蛋白的半衰期將能使得ADAMTS13-MDTCS蛋 白具有更好的臨床應用前景。
[0011] 1. 4現(xiàn)有延長蛋白藥物半衰期的方法
[0012] 目前，延長蛋白藥物半衰期主要根據(jù)加大蛋白藥物的分子量，有效減少腎小球濾 過率，相對分子質(zhì)量小于69 000的分子都將通過腎小球濾過作用被排出體外；減少異源蛋 白的免疫原性，防止被蛋白酶水解，從而減少其體內(nèi)清除率；持續(xù)緩慢釋放維持藥物濃度， 延長藥物作用時間等三個方面考慮。常用技術(shù)包括：PEG化學修飾、制備緩釋劑型、蛋白基 因融合技術(shù)等。
[0013] 1.4. 1化學修飾法
[0014] 化學修飾法是延長蛋白藥物半衰期的一個重要方法之一，其延長蛋白藥物半衰期 的原理主要包含以下兩部分內(nèi)容：1)蛋白質(zhì)藥物經(jīng)過化學法修飾以后，其化學分子量得到 一定程度的增加，因此在代謝過程中降低了被腎小球過濾的機會；2)把蛋白藥物的非必需 基團與親水惰性的化學高分子共價結(jié)合，進而將蛋白藥物的抗原決定簇屏蔽，大大降低了 作為異源性物質(zhì)在體內(nèi)被免疫系統(tǒng)識別的幾率，也就不產(chǎn)生相應抗體，解除異體蛋白免疫 原性，從而大大降低了蛋白藥物被蛋白酶水解的機會。目前使用的蛋白藥物修飾劑包含以 下試劑：PEG、肝素、聚氯基酸、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷、多聚唾液酸等，其中以PEG修飾 劑最為常用。已上市的PEG化的蛋白藥物如PEG化的IFNa 2a(商品名Pegasys，生產(chǎn)商 Roche)，PEG 化的 IFN a 2b (商品名 PEGIntron，生產(chǎn)商 Schering)，和 PEG 化的 G-CSF (商品 名 Neulasta，生產(chǎn)商 Amgen)等。
[0015] PEG修飾后的蛋白具有熱穩(wěn)定性好，體內(nèi)半衰期顯著延長，不易被體內(nèi)蛋白酶水 解，毒性減小，免疫原性與抗原性顯著降低等優(yōu)點，但本方法也存在許多缺點，例如，1)修 飾反應工藝復雜，需要選擇合適分子量的PEG修飾不同位點的游離氨基，控制修飾反應的 條件，從而篩選最佳修飾方案；2)化學修飾后蛋白藥物純化困難，收率低；3)由于PEG為 非單一化合物，分子量的概念是平均分子量，因此，反應終產(chǎn)品是一組異構(gòu)體組成的混合 物，對人健康的長效影響很難衡量；4)化學修飾后，封閉住了某些蛋白基團，降低了蛋白基 團之間的相互聯(lián)系，導致蛋白質(zhì)的比活性明顯下降。
[0016] 1.4. 2緩釋劑法
[0017] 緩釋劑是指通過某種劑型延緩藥物釋放的速率，進而降低藥物進入機體的吸收速 率，最終取得長期的藥物治療效果。主要分為兩大類：以微球為代表的聚合體給藥系統(tǒng)，以 脂質(zhì)體為代表的脂類緩釋系統(tǒng)。
[0018] 微球是指將藥物溶解或分散在高分子材料中形成微小球狀實體，其粒徑范圍通常 在1~250_。把蛋白藥物或多肽類藥物包封于微球載體中，通過皮下給藥或肌內(nèi)給藥，使 藥物緩慢釋放，藥物在體內(nèi)的有效作用時間可長達1~3個月。用于制備緩釋微球的材料 主要是在進入機體后能逐漸被分解的高分子聚合物，大致可分為天然聚合物和人工合成聚 合物兩類。脂質(zhì)體是將藥物包裹于類脂質(zhì)雙分子層所形成的超微型球狀囊泡，它作為多肽 和蛋白質(zhì)類藥物的載體可起到保護藥物活性，提高穩(wěn)定性，延長半衰期和延緩釋放的作用。 脂質(zhì)體根據(jù)其結(jié)構(gòu)和所包含的雙層磷脂膜層數(shù)，可分為單室脂質(zhì)體和多室脂質(zhì)體。兩種緩 釋劑法已經(jīng)被廣泛使用，目前，已經(jīng)有LHRH、hGH等多種蛋白質(zhì)和多肽的緩釋微球制劑上市 銷售。
[0019] 蛋白質(zhì)多肽類藥物的緩釋微劑法不僅大大減少了給藥頻率，也有效避免藥物濃度 的峰谷變化導致的不良作用，而且能夠增加藥物的穩(wěn)定性和靶向性，減少藥物對周圍組織 及非靶位組織細胞的毒副作用等。但是，該技術(shù)尚需進一步優(yōu)化，不足之處包括：大量藥物 一次性植入體內(nèi)，患者額外承擔了藥物突然釋放的毒性風險；蛋白藥物長期包裹植入體內(nèi)， 蛋白藥物的生物活性一致性無法保障等。
[0020] 1.4. 3基因融合法
[0021] 基因融合法是選取與人體相容性好，無毒副作用，不易引起免疫清除，分子量大且 半衰期長的蛋白作為載體蛋白，將目的蛋白與其融合，利用載體蛋白分子量大的性狀將目 的蛋白的非活性區(qū)域折疊包裹，僅暴露出活性部位，從而保留目的蛋白的生物作用并在體 內(nèi)緩慢釋放藥物，達到延長藥物半衰期的目的。
[0022] 目前，關(guān)于如何在保證原有蛋白ADAMTS13-MDTCS的生物學活性的同時，有效延長 ADAMTS13-MDTCS蛋白的半衰期方面的技術(shù)，尚未見明確的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明目的之一在于提供一種具有延長的半衰期的ADAMTS13-MDTCS融合蛋白、 及其對應的核苷酸序列、載體及宿主細胞。
[0024] 本發(fā)明的目的之二在于提供上述融合蛋白的制備方法。
[0025] 本發(fā)明的目的之三在于提供一種治療血栓性血小板減少性紫癜（TTP)的藥物。
[0026] 本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：
[0027] 發(fā)明提供了一種ADAMTS13-MDTCS融合蛋白，包含人血清白蛋白HSA和血管性血友 病因子裂解酶的突變體ADAMTS13-MDTCS，所述人血清白蛋白HSA位于所述血管性血友病因 子裂解酶的突變體ADAMTA13-MDTCS的C-端。
[0028] 所述人血清白蛋白HSA與所述血管性血友病因子裂解酶的突變體 ADAMTA13-MDTCS通過連接肽連接。
[0029] 連接肽是連接目標蛋白與人血清白蛋白HSA之前的部分，其保證蛋白兩部分有必 要的間隔，保持蛋白活性必需的空間構(gòu)象，并且避免融合蛋白兩部分產(chǎn)生相互作用。連接 肽主要由甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸組成，通用的連接鏈為甘氨酸和絲氨酸的重復序 列。在構(gòu)建融合蛋白時連接肽的長度對蛋