一種人源殺蟲蛋白及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別是一種人源殺蟲蛋白及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇云金芽孢桿菌（Bt)是一種昆蟲病原菌，其主要 殺蟲活性物質(zhì)為細(xì)胞內(nèi)毒素伴胞晶體蛋白，對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲具有特異性毒殺作用（Bravo and Soberon，2008) ;CrylB是Bt毒素的一種，其對(duì)鱗翅目昆蟲的靶標(biāo)受體主要包括中腸 刷狀緣膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV)上的胺膚酶（aminopeptidase N，APN)和鈣粘蛋白（cadherin) ((Bravo et al·，2004; Pigott and Ellar, 2007)， APN屬于鋅結(jié)合金屬蛋白酶家族蛋白，它的碳端結(jié)合部位富含N-乙酰氨半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine，GalNAc),這些區(qū)域就是同CrylB類毒素的結(jié)合位點(diǎn)（Knight et al·，1994 ;Knight et al·，2004)?？?CrylB 毒素獨(dú)特型單鏈抗體（Anti-idiotype antibody scFvs, Anti-Id scFvs),可以模擬CrylB毒素的結(jié)構(gòu)與功能，因此推測(cè)其受體也 是昆蟲BBMV上的APN。
[0003] Bt毒素使用量增加使其在害蟲抗藥性及次生害蟲上升等方面存在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn) (Bravo and Soberon, 2008 ;Pigott ei a/, 2008)，這一現(xiàn)狀促使高特異活性和新功能類 的Bt毒素抗蟲資源的積極開發(fā)，CrylB毒素抗獨(dú)特型單鏈抗體由于可模擬CrylB毒素并與 其競(jìng)爭(zhēng)受體蛋白，已成為目前國(guó)內(nèi)外科研的重點(diǎn)，公開號(hào)為CN103773775A的中國(guó)專利公開 了一種人源抗蟲基因及其編碼的抗CrylB毒素獨(dú)特型單鏈抗體C7 (以下簡(jiǎn)稱C7)，其能模 擬Bt毒素并用作生物農(nóng)藥防治蟲害，取得了積極的效果，但是該抗體與昆蟲BBMV結(jié)合能力 不高，殺蟲效果不甚理想。
[0004] 實(shí)際上，基因工程抗體常常存在親和力低的問題，實(shí)踐中通常采用易錯(cuò)PCR技術(shù) 以提高抗體親和力，但是隨機(jī)突變的氨基酸大部分并不能落在影響親和力的關(guān)鍵氨基酸殘 基上，這種突變存在一定的盲目性，成功率較低（Kobayash et al.，2010)?；谟?jì)算機(jī)分子 模擬為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變是則是更為理性的突變方法，其在已知蛋白三維結(jié)構(gòu)及功能等方面 ?目息的基礎(chǔ)上，可以預(yù)測(cè)分子間結(jié)合區(qū)域并確定關(guān)鍵氣基酸殘基（Qiao et al.，2013)，關(guān) 鍵氨基酸的有利突變可以提高抗體的親和力，在體外通過定點(diǎn)突變等基因工程手段可以構(gòu) 建限定性突變抗體庫(kù)，進(jìn)而篩選到高親和力的抗體（Sheedy et al.，2008)。
[0005] 隨著對(duì)抗體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)知不斷加深，借助計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)進(jìn)行抗體改造 可以在限定范圍內(nèi)有目的地引入突變，對(duì)不利于抗體-抗原結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與 定向改造，Wong等（1995)在已知抗原-抗體復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，對(duì)抗苯偶氮基胂酸 酯（anti-p-azophenylarsonate)Fab重鏈108位上的Phe定點(diǎn)突變?yōu)門rp之后，相對(duì)野 生抗體而言，突變體親和力就提高了 10倍；Farady等（2009)采用同源建模、分子對(duì)接等方 法將Π 型跨膜絲氨酸蛋白酶（matriptase，又名epithin)的抗體E2重鏈⑶R3區(qū)98位氨 基酸由Thr到Arg突變產(chǎn)生了大量的自由能變化，接下來的實(shí)驗(yàn)證實(shí)突變將親和力提高了 14倍，達(dá)到了 240 pM ;Zhang等（2013)在構(gòu)建了抗成纖維細(xì)胞活化蛋白單鏈抗體E3突變庫(kù) 的前提下，對(duì)CDR區(qū)進(jìn)行了有目的地定點(diǎn)突變，其中效果最好的突變?yōu)閷捂溈贵wE3的重 鏈33位氨基酸Asp變?yōu)镚ly，107位Tyr變?yōu)镠is,此E3 Mut2比野生型E3親和力提高了 4倍，這些定點(diǎn)突變的氨基酸幾乎都分布在抗原抗體結(jié)合區(qū)域內(nèi)，對(duì)抗體⑶R區(qū)一些結(jié)構(gòu)產(chǎn) 生微小的變化，使得抗體和抗原結(jié)合區(qū)域的互補(bǔ)性更趨完善（Cauerhff et al.，2004)。為 進(jìn)一步對(duì)抗體分子結(jié)合區(qū)域改造指明了方向，目前結(jié)合定點(diǎn)突變來篩選抗CrylB毒素獨(dú)特 型單鏈抗體的方法尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供一種人源殺蟲蛋白及其制備方法與應(yīng)用，該人源殺 蟲蛋白是通過對(duì)C7定向突變后篩選獲得，與稻縱卷葉螟（medinalis Guenee)中腸 BBMV具有較高的親和力，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的： 一種人源殺蟲蛋白，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0007] 本發(fā)明所述人源殺蟲蛋白的制備方法，其特征在于，具體步驟如下： (a) 對(duì)抗CrylB毒素獨(dú)特型單鏈抗體C7和稻縱卷葉螟中腸 BBMV上的APN分別同源建 模：抗CrylB毒素獨(dú)特型單鏈抗體C7的VH選取人類生殖細(xì)胞抗體3-23/B3作為同源建模 的模板，VL模板選取人類抗體V κ域作為同源建模的模板；CmAPN選擇人APN Cdl3作為同 源建模的模板； (b) 利用ZDOCK程序?qū)笴rylB毒素獨(dú)特型單鏈抗體C7和稻縱卷葉螟中腸 BBMV上的 APN的同源建模進(jìn)行分子對(duì)接，將獲得的對(duì)接復(fù)合物提交至Mitchell Lab的熱點(diǎn)預(yù)測(cè)服務(wù) 器KFC2,定義抗CrylB毒素獨(dú)特型單鏈抗體C7為配體，確定配體的熱點(diǎn)； (c) 根據(jù)步驟b確定的熱點(diǎn)，以抗CrylB毒素獨(dú)特型單鏈抗體C7序列的重鏈3區(qū)A123、 Y124以及輕鏈2區(qū)S204、S207進(jìn)行飽和突變，具體為： 首先以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3為引物，以C7菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增 產(chǎn)物置于冰上，加入Dpn I酶混勻，于37°C酶切過夜，次日獲得產(chǎn)物A ; 然后以產(chǎn)物A和SEQ ID No. 2為引物，以C7菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置 于冰上，加入Dpn I酶混勻，于37°C酶切過夜，次日獲得產(chǎn)物B ; 再以SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 2為引物，產(chǎn)物B為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物C; 最后以SEQ ID No. 1和產(chǎn)物C為引物，產(chǎn)物B為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物置于冰 上，加入Dpn I酶混勻，于37°C酶切過夜，次日獲得產(chǎn)物D ; (d) 用NcoI酶和NotI酶對(duì)純化后的產(chǎn)物D以及噬菌體載體pIT2分別進(jìn)行雙酶切，回 收酶切產(chǎn)物并以Τ4 DNA連接酶連接，16°C溫度下過夜；次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TGl電轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于TYE-AG平板中，37°C培養(yǎng)過夜；第二天，向TYE-AG平 板中加入I mL TY-甘油培養(yǎng)基，混勻后，獲得飽和突變抗體庫(kù)； 所述TY-甘油培養(yǎng)基為含有終濃度為15%甘油的2 X TY液體培養(yǎng)基； (e) 以昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡蛋白為靶抗原，利用噬菌體展示技術(shù)，經(jīng)三輪"吸附-洗 脫-擴(kuò)增"的淘篩過程，篩選出所述人源殺蟲蛋白。
[0008] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述人源殺蟲蛋白的制備方法，步驟c所述PCR擴(kuò)增是指： PCR 擴(kuò)增體系為：2X PCRPremix25yl、10 μΜ 的引物各 ΙμL、模板 5yl、ddH20# 足至50 μ I ; PCR擴(kuò)增條件：94°C 5 min;94°C 45 s，56°C 45 s，72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C 延 伸 10 min;4°C保持。
[0009] -種本發(fā)明所述人源殺蟲蛋白在農(nóng)業(yè)害蟲防治中的應(yīng)用。
[0010] 一種含有本發(fā)明所述人源殺蟲蛋白的殺蟲劑。
[0011] 本發(fā)明通過預(yù)測(cè)抗CrylB毒素獨(dú)特型單鏈抗體C7和稻縱卷葉螟中腸 BBMV上的 APN (CmAPN)相互作用的熱點(diǎn)來確定配體C7的改造位點(diǎn)，進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而定向構(gòu)建C7 的飽和突變抗體庫(kù)，并通過對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)一步篩選，獲得與稻縱卷葉螟中腸 BBMV具有較高親 和力的人源殺蟲蛋白Y124G，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于： (1)本發(fā)明所定點(diǎn)突變改造 C7的方法與傳統(tǒng)抗體改造方法(易錯(cuò)PCR等）相比，避免了 盲目性，成功率較高，而且基于計(jì)算機(jī)分子模擬為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變，在已知蛋白三維結(jié)構(gòu)及 功能等方面信息的基礎(chǔ)上，預(yù)測(cè)分子間結(jié)合區(qū)域并確定關(guān)鍵氨基酸殘基，關(guān)鍵氨基酸殘基 更加準(zhǔn)確的反應(yīng)了抗體蛋白作用界面的特征，從而使得分子模擬計(jì)算更加準(zhǔn)確，大大提高 了預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。
[0012] (2)由C7定點(diǎn)突變構(gòu)建的飽和突變抗體庫(kù)，其中的抗體骨架區(qū)（恒定區(qū)）未變，與 C7同屬于人源抗體，因此Y124G應(yīng)用于農(nóng)業(yè)蟲害防治時(shí)，對(duì)人體危害小。
[0013] (3)Y124G與昆蟲BBMV的親和力顯著高于突變前的抗體C7,可更有效的替代CrylB 毒素用于生物防治。
【附圖說明】
[0014] 圖1是C7的氨基酸序列結(jié)構(gòu)示意圖。
[0015] 圖2是C7的重、輕鏈三維結(jié)構(gòu)示意圖；其中，A為VH的三維結(jié)構(gòu)示意圖(選取人類 生殖細(xì)胞抗體3-23/B3為模板)，B為VL的三維結(jié)構(gòu)示意圖(選取人類抗體Vk域?yàn)槟０?。
[0016] 圖3是C7和CmAPN三維結(jié)構(gòu)模型示意圖；其中，A為C7三維結(jié)構(gòu)圖；B為CmAPN 三維結(jié)構(gòu)圖。
[0017] 圖 4 是模型的 Ranmachandan plot 圖；其中 A 為 C7 模型的 Ranmachandan plot 圖，B 為 CmAPN 模型的 Ranmachandan plot 圖。
[0018] 圖5是Profiles-3D可靠性驗(yàn)證結(jié)果示意圖；其中，A為C7模型的可靠性驗(yàn)證結(jié) 果示意圖，B為CmAPN模型的可靠性驗(yàn)證結(jié)果示意圖。
[0019] 圖6是PyMOL軟件輸出的C7-CmAPN對(duì)接復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020] 圖7是熱點(diǎn)預(yù)測(cè)服務(wù)器KFC2預(yù)測(cè)的C7與CmAPN接觸界面的熱點(diǎn)示意圖。
[0021] 圖8是單克隆ELISA篩選突變型克??；其中C7為野生型對(duì)照，CK-為陰性對(duì)照D5。
[0022] 圖9是殺蟲蛋白Y124G與稻縱