對東方粘蟲有殺蟲活性的Bt蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及幾種對東方粘蟲具有殺蟲活性的Bt蛋白及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 東方粘蟲（Mythimna separata)屬于鱗翅目，夜蛾科，是一種典型的遠(yuǎn)距離迀飛害 蟲，嚴(yán)重威脅我國糧食生產(chǎn)安全。其危害特點主要有三點，首先是發(fā)生范圍廣，危害世代多。 我國除新疆以外，全國各地均受其危害，每年可有4~5次大范圍迀飛危害，在亞洲和澳洲 其它國家也常發(fā)生危害，爆發(fā)成災(zāi)。其次是危害的作物種類和組織多。東方粘蟲可以危害玉 米、小麥和水稻等主要禾谷類糧食作物以及棉花、豆類、蔬菜等上百種植物，由于其可咬斷 麥穗、谷穗甚至將作物的葉片吃光，因而造成嚴(yán)重的作物減產(chǎn)和絕產(chǎn)。再次是暴發(fā)性明顯， 造成的產(chǎn)量損失嚴(yán)重。1990以來，粘蟲的局部危害從未停止，至2012年全國粘蟲的大發(fā)生， 2012年，3代粘蟲在華北、東北的發(fā)生面積達(dá)397. 4萬公頃，多數(shù)省份危害程度居歷史之最。
[0003] 此外，由于氣候變暖、種植模式的改變導(dǎo)致病蟲害加重，使得粘蟲危害的形勢非常 嚴(yán)峻，防治問題刻不容緩。而化學(xué)防治所需人力物力頗多，因此生物防治是解決當(dāng)前問題的 最佳途徑。
[0004] 蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis)產(chǎn)生的伴胞晶體蛋白是主要的殺蟲 成分，已有研宄發(fā)現(xiàn)大多數(shù)晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食 毛目多種昆蟲，以及一些線蟲、螨類和原生動物具有特異性的殺蟲活性。
[0005] 相對于使用Bt防治棉鈴蟲，其對粘蟲防治研宄發(fā)展相對滯后，關(guān)注較少。為防治 東方粘蟲對農(nóng)作物帶來的危害，尋找對東方粘蟲高毒力的Bt蛋白可為防治東方粘蟲生物 災(zāi)害提供多種殺蟲資源，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。此外，也將為我國抗蟲 轉(zhuǎn)基因作物的研宄提供優(yōu)良的候選基因。
[0006] 并且對東方粘蟲有活性的Bt蛋白研宄較少，因此產(chǎn)生交互抗性的風(fēng)險較大，對東 方粘蟲有活性的Bt蛋白資源的挖掘，尤其與CrylA類蛋白氨基酸序列相似性低的蛋白，為 防治這類害蟲提供豐富的候選蛋白，將對延緩抗性產(chǎn)生具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了幾種對東方粘蟲有殺蟲活性的 Bt蛋白，以克服東方粘蟲防治資源的匱乏，延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了對東方粘蟲有殺蟲活性的Bt蛋白，所述蛋白質(zhì)來源于蘇云金芽胞 桿菌，所述蛋白選自CrylAb蛋白、CrylBb蛋白、CrylBe蛋白、Cry2Ab蛋白、Cry9Aa蛋白、 Cry9Eb蛋白或Cry9Ee蛋白中的至少一種。
[0010] 本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，上述的Bt蛋白選自CrylAb蛋白、CryIBb蛋白、CryIBe蛋 白、Cry2Ab蛋白的至少一種。
[0011] 本發(fā)明的再一個優(yōu)選的方面，上述的Bt蛋白中含有對東方粘蟲有體重抑制作用 的Bt蛋白，所述Bt蛋白選自Cry9Aa蛋白、Cry9Eb蛋白或Cry9Ee蛋白中的至少一種。
[0012] 本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，上述蛋白是如下序列組成的：其中，CrylAb蛋白是如下 1)或 2):
[0013] 1)序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0014] 2)在序列表中序列1的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸組成的且具有1)相同功能的蛋白；
[0015] CrylBb蛋白是如下1)或2):
[0016] 1)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0017] 2)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸組成的且具有1)相同功能的蛋白；
[0018] CrylBe蛋白是如下1)或2):
[0019] 1)序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0020] 2)在序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸組成的且具有1)相同功能的蛋白；
[0021] Cry2Ab蛋白是如下1)或2):
[0022] 1)序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0023] 2)在序列表中序列4的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸組成的且具有1)相同功能的蛋白；
[0024] Cry9Aa蛋白是如下1)或2):
[0025] 1)序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0026] 2)在序列表中序列5的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸組成的且具有1)相同功能的蛋白；
[0027] Cry9Eb蛋白是如下1)或2):
[0028] 1)序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0029] 2)在序列表中序列6的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸組成的且具有1)相同功能的蛋白；
[0030] Cry9Ee蛋白是如下1)或2):
[0031] 1)序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白；
[0032] 2)在序列表中序列7的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸組成的且具有1)相同功能的蛋白。
[0033] 本發(fā)明的另一個目的是提供了含有上述Bt蛋白的應(yīng)用。
[0034] 本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，上述組合物中的Bt蛋白含量為10-70%，優(yōu)選30-50%， 特別優(yōu)選40%。
[0035] 進(jìn)一步地，所述的Bt蛋白在制備東方粘蟲殺蟲劑上的應(yīng)用。
[0036] 更近進(jìn)一步地，所述的Bt蛋白在制備抗東方粘蟲轉(zhuǎn)基因植物上的應(yīng)用。
[0037] 本發(fā)明再一個目的是提供了含有上述Bt蛋白的殺蟲劑或生物制劑。
[0038] 本發(fā)明還提供了含有上述Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。
[0039] 本發(fā)明提供的防治東方粘蟲的Bt蛋白，可為防治東方粘蟲的生物災(zāi)害提供多種 殺蟲資源，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。此外，也將為我國抗東方粘蟲轉(zhuǎn)基因 作物的研宄提供優(yōu)良的候選基因，因此有望對其進(jìn)行多基因轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)，有望延緩 害蟲抗藥性的產(chǎn)生。上述蛋白也將為抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)提供新的基因來源。
【附圖說明】
[0040] 圖 1 為 CrylAb、CrylAc、Cry2Ab、CryIAKCrylCa 蛋白的 SDS-PAGE 電泳結(jié)果圖；其 中從左到右依次是分子標(biāo)記物，泳道I :BSA，泳道2 :Cry IAb蛋白，泳道3 :Cry IAc蛋白，泳 道4 :Cry ICa蛋白，泳道5 :Cry 2Ab蛋白，泳道6 :空白對照無晶體突變株HD73-。
[0041] 圖 2 為 CrylBa、CrylBb、CrylBe、Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee、Vip3Aall 蛋白的 SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；從左到右依次是分子標(biāo)記物，泳道I :BSA，泳道2 :CrylBa蛋白，泳 道3 :CryIBb蛋白，泳道4 :CryIBe蛋白，泳道5 :Cry9Aa蛋白，泳道6 :Cry9Eb蛋白，泳道7 : Cry9Ee蛋白，泳道8 :Vip3Aall蛋白，泳道9 :pEB空載體。
【具體實施方式】
[0042] 以下實施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本 發(fā)明精神和實質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0043] 本發(fā)明所用的菌株均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研宄所植物病蟲害生物學(xué)國 家重點實驗室。
[0044] 本發(fā)明所用到的培養(yǎng)基：
[0045] 1/2LB液體培養(yǎng)基：0.5 %胰蛋白胨、(λ