列完全一致；2F7序列的重鏈2區(qū)76位出現(xiàn)終止子；因 此最終只選擇3A5 (Y124G)用作下一步的Biacore分析，與Y124G相對應的上清液為突變 型上清液。
[0044] 實施例4殺蟲蛋白Y124G與昆蟲BBMV的結合實驗 取實施例3中處于平臺期的突變型上清液200 μ L，（野生型對照、陰性對照分別取實 施例3中獲得的C7上清液和D5上清液)加入到20 mL 2XTY-AG培養(yǎng)基中，于250 r/min、 37°C條件下振蕩培養(yǎng)至0D6(I(I=0.4 (約2 h)后，加入2X1011輔助噬菌體M13K07,200 r/ 11^11、37 1：振蕩培養(yǎng)111;于1 800 #條件下離心1〇1^11，去上清液，用2〇1^2\1￥-41(培 養(yǎng)基重懸沉淀，200 r/min、30 °C振蕩培養(yǎng)過夜；次日于1800綠件下離心10 min，加入5 mL PEG/NaCl充分混勻后冰浴I h ;然后于3300 g條件下離心30 min，棄上清，再用10 mL PBS重新懸浮沉淀，最后再于116000 g條件下離心10 min，取上清液，作為突變樣品用于 后續(xù)樣品檢測；野生型對照為處于平臺期的C7上清液，其檢測樣品為野生型樣品；陰性對 照為處于平臺期的D5上清液，其檢測樣品為陰性樣品。
[0045] 實驗操作使用BIAcore XlOO實驗平臺（GE Healthcare)，數(shù)據分析使用Biacore XlOO 評價軟件（GE Healthcare)，實驗方法米用 Richter 等（2014)和 Kalyoncu 等（2014) 的實驗方法，反應過程中所用材料氨基偶聯(lián)試劑盒、系統(tǒng)緩沖液HBS-EP (10 mmol/L HEPES pH 7.4,150 mmol/L NaCl，3 mmol/L EDTA，0. 05% Tween 20)、上樣緩沖液（10 mmol/L NaAc ρΗ=4·0，4.5，5.0，5. 5);再生緩沖液（10 mmol/L Glycine-HCl pH=L 5，2.0，2.5， 3.0,5 mmol/L NaOH )和CM5傳感芯片（sensor chip CM5)均為Biacore標配產品。實驗所 用受體蛋白稻縱卷葉螟中腸 BBMV使用PBS溶解到500 mg/L，反應時用NaAc稀釋到50 mg/ L;待測樣品Cry IB (陽性對照CK+)和抗獨特型單鏈抗體Y124G (突變型)、C7 (野生型)、D5 (陰性對照CIO使用HBS-EP緩沖液稀釋到指定濃度，所有試劑均用去離子水配制，用0. 22 μ m濾膜過濾，使用前超聲除氣。
[0046] 稻縱卷葉螟中腸 BBMV作為受體蛋白，通過氨基偶聯(lián)法固定到CM5傳感芯片上。 將CM5傳感芯片F(xiàn)Cl通道設為對照通道，F(xiàn)C2通道設為反應通道?；罨疐C2通道并且待基 線平穩(wěn)后，分別進樣一定體積的不同pH值（4. 0,4. 5, 5.0，5. 5)，包含BBMV (50 mg/L)的 NaAcQO mmol/L)緩沖液，通過傳感圖譜判斷吸附情況選取合適的pH值，封閉并確定固定 BBMV至芯片上的蛋白量。然后使用不同pH值（1.5，2.0，2. 5，3.0)再生緩沖液確定芯片 再生反應的最適PH值。所有樣品均以10 yL/min的流速連續(xù)經過芯片表面，上樣時間均 為120 s，再生時間60 s。FCl通道為氨基偶聯(lián)試劑盒活化-失活處理的對照通道，F(xiàn)C2通 道是固定了 BBMV的反應通道。最后的傳感圖顯示FC2-FC1的響應值（以RU表示）。該RU 值排除了受體和配體之間靜電吸附導致的非特異性干擾信號，并扣除液體折射參數(shù)的變化 和背景的非特異性作用。
[0047] SPR測定上樣緩沖液選擇ρΗ=4·0的NaAc (10 mmol/L)最終偶聯(lián)量為1267 RU， 再生選擇？^1值2.5的617(^1^-!1(：1(10臟〇1/1)和5臟〇1/1恥0!1。￥1246、〇7、05、(：巧18 作為待測分析物，逐個流過CM5芯片表面。樣品同BBMV的結合能力如圖9所示，陰性對照 D5同BBMV基本沒有結合，CrylB毒素（20 μ g/mL)的結合能力最強。突變型Y124G比野生 型C7的結合能力強，提高了 2. 1倍。
[0048] 實施例5生物測驗 將新鮮水稻葉分別放入IOmL實施例4制備的突變樣品中，浸漬10 s后取出晾干；野生 型對照為實施例4制備的野生型樣品，陰性對照為實施例4制備的陰性樣品，陽性對照為濃 度為0.2g/L CrylB毒素，空白對照為清水。
[0049] 將處理后的水稻葉分別放入養(yǎng)蟲小管，每管接入1頭已饑餓4 h的稻縱卷葉螟3 齡幼蟲，然后置小管于溫度為26±1 °C，相對濕度80±5 %，光照條件大于14 h的培養(yǎng)箱內 飼養(yǎng)。24、48、72 h后分別觀察、記錄死亡蟲數(shù)，并于每次觀察后更換新的處理葉或對照葉繼 續(xù)飼養(yǎng)直到實驗結束。取出幼蟲檢查時以小毛筆輕觸蟲體，無明顯反應者為死亡。各處理 使用20頭3齡幼蟲，每處理3次重復。試蟲死亡率采用Abbott公式對死亡率進行校正，并 以平均數(shù)土標準誤表示（3次重復試驗)。
[0050] 校正死亡率=(處理死亡率一對照死亡率）/ (1 一對照死亡率）X 100% 各處理時間相同時各個樣品之間的比較采用單因素方差分析（One -way AN0VA)和 Tukey顯著性檢驗，使用SPSS軟件進行數(shù)據處理，處理結果如表2所示： 表2抗獨特型單鏈抗體對稻縱卷葉螟的殺蟲效果比較
注：表中各列數(shù)據后不同小寫字母表示差異顯著（K0. 05)。
[0051] 由表2可見，經過24 h的處理，殺蟲蛋白Y124G跟野生型C7單殺蟲效果無明顯差 異，但是48 h后，尤其是經過72 h的處理，Y124G將野生型C7的校正死亡率從42. 22%提 高到56. 67%，殺蟲活性顯著提高，因此認為，殺蟲蛋白Y124G為" β型"，且與CmAPN具有較 高親和力。
[0052] 本發(fā)明所保護的技術方案并不僅限于上述實施例，本領域技術人員應當理解，根 據本實施例記載的內容，不經過創(chuàng)造性勞動對其進行部分修改或等同替換，而不脫離本發(fā) 明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種人源殺蟲蛋白，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。2. 如權利要求1所述人源殺蟲蛋白的制備方法，其特征在于，具體步驟如下： (a)對抗CrylB毒素獨特型單鏈抗體C7和稻縱卷葉螟中腸BBMV上的APN分別同源建 模：抗CrylB毒素獨特型單鏈抗體C7的VH選取人類生殖細胞抗體3-23/B3作為同源建模 的模板，VL模板選取人類抗體VK域作為同源建模的模板；CmAPN選擇人APN Cdl3作為同 源建模的模板； (b)利用ZDOCK程序對抗CrylB毒素獨特型單鏈抗體C7和稻縱卷葉螟中腸BBMV上的 APN的同源建模進行分子對接，將獲得的對接復合物提交至Mitchell Lab的熱點預測服務 器KFC2,定義抗CrylB毒素獨特型單鏈抗體C7為配體，確定配體的熱點； (c) 根據步驟b確定的熱點，以抗CrylB毒素獨特型單鏈抗體C7序列的重鏈3區(qū)A123、 Y124以及輕鏈2區(qū)S204、S207進行飽和突變，具體為： 首先以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3為引物，以C7菌液為模板進行PCR擴增，將擴增 產物置于冰上，加入DpnI酶混勻，于37°C酶切過夜，次日獲得產物A; 然后以產物A和SEQ ID No. 2為引物，以C7菌液為模板進行PCR擴增，將擴增產物置 于冰上，加入DpnI酶混勻，于37°C酶切過夜，次日獲得產物B; 再以SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 2為引物，產物B為模板進行PCR擴增，獲得產物C; 最后以SEQ ID No. 1和產物C為引物，產物B為模板進行PCR擴增，將擴增產物置于冰 上，加入DpnI酶混勻，于37°C酶切過夜，次日獲得產物D; (d)用NcoI酶和NotI酶對純化后的產物D以及噬菌體載體pIT2分別進行雙酶切，回 收酶切產物并以T4 DNA連接酶連接，16°C溫度下過夜；次日將連接產物轉入TGl電轉化感 受態(tài)細胞中，然后將轉化菌均勻涂布于TYE-AG平板中，37°C培養(yǎng)過夜；第二天，向TYE-AG平 板中加入I mL TY-甘油培養(yǎng)基，混勻后，獲得飽和突變抗體庫； 所述TY-甘油培養(yǎng)基為含有終濃度為15%甘油的2XTY液體培養(yǎng)基； (e) 以昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡蛋白為靶抗原，利用噬菌體展示技術，經三輪"吸附-洗 脫-擴增"的淘篩過程，篩選出所述人源殺蟲蛋白。3. 如權利要求2所述人源殺蟲蛋白的制備方法，其特征在于，步驟c所述PCR擴增是 指： PCR擴增體系為：2XPCRPremix25iil、10iiM的引物各liil、模板 5ia、ddH20# 足至50ill; PCR擴增條件：94°C5min;94°C45s，56°C45s，72°Clmin，共 30 個循環(huán)；72°C延 伸 10min;4°C保持。4. 如權利要求1所述人源殺蟲蛋白在農業(yè)害蟲防治中的應用。5. -種含權利要求4所述人源殺蟲蛋白的殺蟲劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種人源殺蟲蛋白，其編碼核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；該人源殺蟲蛋白是由抗Cry1B毒素獨特型單鏈抗體C7定向突變形成飽和突變庫后應用噬菌體展示技術篩選獲得；其與昆蟲BBMV的親和力顯著高于突變前的抗體C7，可有效的替代Cry1B毒素用于生物防治蟲害，且其與C7同屬于人源抗體，作為生物農藥時，對人體危害小。
【IPC分類】C12N15/13, C07K16/12, A01P7/04, A01N47/44
【公開號】CN104926940
【申請?zhí)枴緾N201510326036
【發(fā)明人】劉賢金, 仲建鋒, 徐重新, 張霄, 劉媛, 張存政, 何鑫, 武愛華
【申請人】江蘇省農業(yè)科學院
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月15日