專利名稱：一種利用陰離子交換柱輔助聚乙二醇修飾水蛭素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)修飾技術(shù)領(lǐng)域，涉及到蛋白的聚乙二醇固相修飾，特別 涉及一種利用陰離子交換柱輔助聚乙二醇修飾水蛭素的方法。
技術(shù)背景聚乙二醇(PEG)修飾是一個(gè)用中性的、化學(xué)惰性、親水的PEG聚合物修飾 蛋白藥物的化學(xué)反應(yīng)。上世紀(jì)70年代以來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一些藥用蛋白經(jīng)PEG 修飾后，其藥用性質(zhì)大大改善，如體內(nèi)半衰期延長，免疫原性降低等等。現(xiàn)在已經(jīng)上市的一些PEG-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物如Adagen， Oncospar， PEG-Intron 等，均是基于第一代PEG化技術(shù)制備出來的，其特征是(1)修飾劑的分子量 一般都很低；(2)雙官能團(tuán)聚乙二醇雜質(zhì)容易引起交聯(lián)和團(tuán)聚；(3)連接鍵的 水解穩(wěn)定性差；(4)選擇性低，即反應(yīng)后得到修飾度不同的修飾產(chǎn)物，而且存 在副反應(yīng)。為解決上述弊端，基于第二代PEG化技術(shù)的聚乙二醇修飾劑正在得 到越來越廣泛的應(yīng)用。第二代PEG化的聚乙二醇修飾以定點(diǎn)修飾為目標(biāo)。Nekta公司開發(fā)的各類活 化PEG使蛋白的定向修飾成為可能，主要產(chǎn)品有針對氨基、巰基以及N端氨基 修飾的各類直鏈或支鏈的PEG衍生物，以及帶有標(biāo)簽的各類PEG。但是這種特異 性的修飾也存在其局限性，如巰基的修飾要求被修飾蛋白含有游離巰基，并且 處于活性位點(diǎn)之外；針對N端a -氨基的修飾，需將Lys的e -氨基保護(hù)，且反 應(yīng)條件較為苛刻(一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)a-氨基的方法，CN1687106)。水蛭素(hirudin)作為特異性的凝血酶抑制劑，其體內(nèi)半衰期短的缺點(diǎn)嚴(yán)重地制約了其臨床應(yīng)用，因此有必要采用PEG修飾方法改善其藥用性質(zhì)。分析 水蛭素的氨基酸組成，其分子中無游離的-SH供相應(yīng)的PEG修飾，而末端氨基是 其活性必需的，故不能選擇專一性修飾末端氨基的PEG，最終選擇相應(yīng)的PEG專 一性修飾水蛭素賴氨酸(Lys)。前期的實(shí)驗(yàn)研究表明，若水蛭素上4個(gè)賴氨酸 殘基都被PEG修飾，其生物活性就會明顯降低。分析水蛭素與凝血酶的作用情 況，發(fā)現(xiàn)47位Lys位于凝血酶與水蛭素作用的凹槽內(nèi)，若47位Lys被修飾， 其活性會受到影響。為保護(hù)水蛭素的活性位點(diǎn)不被修飾，親和保護(hù)是一種常用的固相修飾策略 (親和方法保護(hù)活性位點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)的方法、產(chǎn)品及用途，CN1453292)。這種 方法雖然具有保護(hù)活性位點(diǎn)，特異性強(qiáng)等一系列優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是步驟繁瑣， 需要找到與目的蛋白具有親和作用的配基，而且一些配基造價(jià)高昂，提高了藥 物的成本，限制了其使用范圍。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于尋找一種蛋白PEG修飾方法，此方法快速、簡捷，可得 到單一的、活性更高的修飾產(chǎn)品。發(fā)明中提供一種利用陰離子交換柱輔助PEG 修飾水蛭素的方法，這種方法不僅可以利用離子交換柱屏蔽水蛭素的活性中心， 提高PEG修飾的專一性，而且可以簡化修飾產(chǎn)物的分離步驟，縮短操作時(shí)間。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的步驟如下(A)將溶于20 50mM磷酸鹽緩沖液a中的水蛭素上樣于經(jīng)相同緩沖液平 衡的離子柱中，至全部樣品吸附于離子交換介質(zhì)上，沒有洗脫物流出為止。其 中水蛭素包括天然提取水蛭素、重組水蛭素各類變異體，水蛭素的濃度范圍l 10mg/ml;緩沖液pH范圍6 9，離子交換柱中介質(zhì)為交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖，交 換基團(tuán)是季氨基，基質(zhì)平均粒徑范圍30 90iim。(B) 將溶于a液中的活化PEG溶液泵入步驟A的柱中，至全部溶液充滿柱 中，即停止流速。其中PEG與水蛭素摩爾比3:1 9:1， PEG分子量范圍2kDa 35kDa之間，mPEG活化方式是琥珀酰亞胺碳酸酯活化法或者羰基二咪唑活化法。(C) 待反應(yīng)15 120min后，用a液沖洗步驟B的離子交換柱，至無洗脫 物流出。然后用含有1 2M氯化鈉或氯化鉀的a液對步驟B柱子中物質(zhì)進(jìn)行梯 度洗脫，洗脫方式為梯度或階段洗脫，洗脫時(shí)間30 120min。然后收集洗脫組 分。(D) 將步驟C中收集到的組分進(jìn)行電泳(SDS-PAGE)分析，染色方法為碘 染，即針對PEG的染色方法。(E) 將步驟D中驗(yàn)證的單修飾組分用Lowry法測定蛋白濃度，凝血酶滴定 法測定活力，計(jì)算得到其體外比活力。測定活力時(shí)，以血纖維蛋白酶原為底物， 加入水蛭素，當(dāng)凝血酶滴定至血纖維蛋白酶原凝結(jié)時(shí)為滴定終點(diǎn)，水蛭素活力 用滴定的凝血酶活力表征。本發(fā)明的效果和益處是整合反應(yīng)和分離步驟，縮短操作時(shí)間，提高效率。 與傳統(tǒng)的液相修飾相比，可以提高產(chǎn)物的單一性以及體外活性。與采用親和策 略的固相修飾方法相比，簡化操作步驟，無需尋找與蛋白相互作用的配基。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例。實(shí)施例一4ml溶于0. 02M pH8磷酸鹽緩沖液a中的水蛭素溶液，其濃度為1. 5mg/ml 上樣于用相同緩沖液平衡的Hitr即Q HP 5ml預(yù)裝離子交換柱(柱內(nèi)微珠結(jié)構(gòu) 為6%高度交聯(lián)瓊脂糖，孔徑為34um，帶電基團(tuán)季氨基)，待沒有洗脫物流出， 然后將4ml溶于緩沖液a中的琥珀酰亞胺活化mPEG5kDa (SOPEG國)溶液，上樣于柱中，上樣量與水蛭素摩爾比9:1，反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后洗脫。洗脫時(shí)采 用線性梯度0 30。/。b液，其中b液為含有l(wèi)MNaCl的a液。洗脫時(shí)間100min。手動收集各洗脫物，經(jīng)電泳驗(yàn)證各洗脫組分，電泳染色方法為碘染。染色液為 0. 1M含有5X BaCh的I/KI溶液。染色時(shí)間4min，脫色時(shí)間12h。驗(yàn)證得到的 單修飾產(chǎn)物為mPEG5,-hirudin，其分子量為12kDa。比活測定中，蛋白濃度測 定采用Lowry法，修飾后產(chǎn)物活力測定采用凝血酶滴定法。體外比活保留率為 91%。實(shí)施例二4ml溶于0. 02M pH 8磷酸鹽緩沖液a中的水蛭素溶液，濃度為1. 5mg/ml，上 樣于用相同緩沖液平衡的Hitrap Q HP 5ml預(yù)裝離子交換柱，待沒有洗脫物流 出，然后將4 ml溶于緩沖液a中的琥珀酰亞胺活化的mPEG 20kDa (SC-PEG扁。) 溶液，上樣于柱中，上樣量與水蛭素摩爾比9: 1，反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后洗脫。 洗脫采用線性梯度0 30% b液，其中b液為含有1M NaCl的a液。洗脫時(shí)間 60min。手動收集各洗脫物，經(jīng)電泳驗(yàn)證各洗脫組分，電泳染色方法為碘染。染 色液為O. 1M含有5X BaCl2的I/KI溶液。染色時(shí)間4min，脫色時(shí)間12h。收集 到的單修飾產(chǎn)物產(chǎn)物為mPEG2。。。fhirudin，其分子量為27kDa。比活測定中，蛋 白濃度測定采用Lowry法，修飾后產(chǎn)物活力測定采用凝血酶滴定法。 mPEG2。。。。-hirudin體外比活保留率為96%。
權(quán)利要求
1. 一種利用陰離子交換柱輔助聚乙二醇修飾水蛭素的方法，其特征包括以下步驟(A)將溶于磷酸鹽緩沖液a中的水蛭素上樣于經(jīng)相同緩沖液平衡的離子柱中，直至全部樣品吸附于離子交換介質(zhì)上，沒有洗脫物流出為止；(B)將溶于a液中的活化聚乙二醇溶液上樣于步驟A的柱中，至全部溶液充滿離子柱，停止上樣；(C)待反應(yīng)結(jié)束后，用a液沖洗步驟B的反應(yīng)離子柱，至無洗脫物流出；用含有氯化鈉或氯化鉀的a液對步驟B柱子中物質(zhì)進(jìn)行洗脫，并收集洗脫組分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用陰離子交換柱輔助聚乙二醇修飾水蛭素的方 法，其特征在于，步驟A中的水蛭素包括天然提取水蛭素、重組水蛭素各類 變異體，其濃度范圍l 10mg/ml;所使用離子柱為強(qiáng)陰離子交換柱，帶電基 團(tuán)為季氨基；柱中基質(zhì)為交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖，平均粒徑范圍為30 90tim; 磷酸鹽緩沖液a的pH范圍為6 9，濃度20 50mM。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用陰離子交換柱輔助聚乙二醇修飾水蛭素的 方法，其特征在于，步驟B中聚乙二醇分子量在5 kDa到35kDa之間，優(yōu) 選的聚乙二醇分子量為20 kDa;聚乙二醇的活化形式包括各種以修飾氮基 為目標(biāo)的活化形式，如羰基二咪唑法活化，琥珀酰亞胺碳酸酯活化；聚乙二 醇與水蛭素摩爾比范圍3:1 9:1，反應(yīng)時(shí)間15 120min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用陰離子交換柱輔助聚乙二醇修飾水蛭素的方 法，其特征在于，步驟C中洗脫緩沖液為含有1 2M氯化鈉或氯化鉀的a液， 洗脫方式為梯度洗脫，修飾產(chǎn)物先于原蛋白洗脫，洗脫時(shí)間60 120min。
全文摘要
一種利用陰離子交換柱輔助聚乙二醇(PEG)修飾水蛭素的方法，屬于蛋白修飾技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的特征是采用離子交換柱輔助蛋白進(jìn)行PEG修飾。反應(yīng)pH為6～9，反應(yīng)時(shí)間15～120min，水蛭素與PEG摩爾比1∶3～1∶9。離子交換柱為強(qiáng)陰離子交換柱，帶電基團(tuán)為季氨基。柱中基質(zhì)為交聯(lián)葡聚糖或瓊脂糖，基質(zhì)平均粒徑范圍30～90μm。本發(fā)明的效果和益處是簡化蛋白修飾中反應(yīng)和分離的步驟，相應(yīng)減少各個(gè)步驟之間樣品的損耗，洗脫水蛭素脫鹽后可以回收。與傳統(tǒng)的液相方式修飾相比，可以得到體外活性很高的單PEG化水蛭素。
文檔編號C07K1/107GK101279999SQ20081001155
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月21日
發(fā)明者修志龍, 李曉暉, 李雪芹 申請人:大連理工大學(xué)