基于陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是基于一種新型陰離子交換柱（DEAE-硅膠分離柱），實(shí)現(xiàn)高效分離純化水蛭素。以廣西菲牛蛭制成的螞蝗粉為原材料，屬于中藥制藥領(lǐng)域，涉及動(dòng)物有效成分的提取，目的是解決水蛭素提取復(fù)雜、成本高、難以工業(yè)化生產(chǎn)的問題。本發(fā)明的特征在于圍繞這種新的價(jià)格低廉的DEAE-硅膠分離柱的分離純化系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了水蛭素分離純化的新工藝。本工藝簡單快速，成本低；并且所得到的水蛭素凍干粉活性高，回收率高，純度高，保存期長，可為食品、保健食品、藥品或化妝品等行業(yè)提供安全、優(yōu)質(zhì)的原料。
【專利說明】基于陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本工藝屬于生物醫(yī)藥的分離純化，以及中藥制成藥精制等領(lǐng)域，具體涉及一種基于新型陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]水蛭素(hirudin)是存在于吸血水蛭(螞蝗)的唾液腺中的一種蛋白質(zhì),具有高度特異的抗凝血酶活性，抑制凝血酶結(jié)合底物，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凝血酶天然特異抑制劑。1984年,Haycraft發(fā)現(xiàn)水蛭提取物有抗凝血作用。1904年Jocoby首次從醫(yī)用水蛭中分離得到這種活性組分，并命名為水蛭素。1955年，Markwardt成功的從醫(yī)用水蛭頭部分離純化出純品水蛭素，開始進(jìn)行基礎(chǔ)的生物化學(xué)和藥理學(xué)研究，并于1970年確定水蛭素是凝血酶的特異性抑制劑。1986年，Harvey等得到水蛭素的cDNA，隨后水蛭素基因在多種宿主中表達(dá)成功。天然水蛭素是由65個(gè)氨基酸組成的多肽，其作用有以下幾個(gè)方面:1.具有抗凝血作用。不同來源和結(jié)構(gòu)的水蛭素，其抗凝血機(jī)制不盡相同。2.抗凝血酶作用。水蛭素的抗凝血酶作用見于歐洲醫(yī)用水蛭素(hiNmedic5naliX)Llj、亞洲水蛭素(菲牛蛭)、和印度水蛭等。水蛭素對(duì) 凝血酶的作用分兩步進(jìn)行，首先使凝血酶帶正電荷的非催化位點(diǎn)部分與水蛭素的帶負(fù)電荷的極性C-端部分產(chǎn)生靜電作用形成初始結(jié)合體，隨后該結(jié)合體通過控制擴(kuò)散迅速重排，形成同凝血酶活性位點(diǎn)緊密結(jié)合的復(fù)合物。在該復(fù)合物中，水蛙素的C-端結(jié)合在凝血酶的纖維蛋白原識(shí)別位點(diǎn)，抑制凝血酶對(duì)纖維蛋白原的激活作用，N-端則同凝血酶催化位點(diǎn)結(jié)合，抑制凝血酶的催化作用。3.抗血小板作用。1992年，Como等從墨西哥水蛭中提取出一種稱為菲牛蛭抗血小板蛋白質(zhì)，具有特異性抑制膠原又到血小板聚集的作用，而對(duì)其他誘導(dǎo)劑(如血、凝血酶等)誘導(dǎo)血小板聚集無抑制作用。4.降解纖維蛋白(原)作用。1984年,Malin-conlco等從亞馬遜巨型水蛭中提取一種稱為hementin的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以降解纖維蛋白(原)的特定肋鏈，具有抗凝血酶活性并能顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，對(duì)于預(yù)防血栓性疾病的發(fā)生有明顯的作用。
[0003]水蛭素還是一種非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，在干燥狀態(tài)下極其穩(wěn)定，單純的溫度升高(100°C水浴)或pH值的改變(1.47-12.9)都不影響其活力，在某些變性劑存在的情況下也非常穩(wěn)定，只有當(dāng)溫度和PH值同時(shí)升高時(shí)其活力才開始下降。一般室溫下水蛭素在水中能穩(wěn)定存在6個(gè)月，80°C下加熱15min不被破壞。提高溶液的pH值，其穩(wěn)定性則降低。20°C下，在 0.lmol/LHCI 或 0.1mol/LNaOH 中，可穩(wěn)定 15min,在 pH= 13 的條件下經(jīng) 80°C處理 15min即完全失活。
[0004]對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中天然水蛭素的生產(chǎn)方法檢索到的一些技術(shù)方案如下:
1.中國專利:03113566.8發(fā)明名稱:菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取技術(shù)。摘要:本發(fā)明提供了一種菲牛蛭的養(yǎng)殖方法及水蛭素的提取方法，是通過引進(jìn)優(yōu)良種源或野外捕捉到健壯的菲牛蛭，進(jìn)行人工分級(jí)分段馴、喂養(yǎng)，進(jìn)行人工繁殖，待飼養(yǎng)到一定程度，采用化學(xué)物質(zhì)刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然后對(duì)其唾液進(jìn)一步分離過濾得到水蛭素粗品，再將水蛭素粗品進(jìn)行深加工得到符合醫(yī)用的水蛭素，該菲牛蛭含抗凝血物質(zhì)比其它品種菲牛蛭含量高，藥用效果好，提取水蛭素方法簡單，提取水蛭素后將菲牛蛭放回水池養(yǎng)殖，相隔一周或十天又可以再提取，每條鮮活菲牛蛭可以反復(fù)提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫克左右，產(chǎn)品質(zhì)量好，又節(jié)約資源，提高了菲牛蛭的利用價(jià)值。
[0005]2.中國專利:200610019531.0發(fā)明名稱:一種以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法與應(yīng)用。摘要:本發(fā)明公開了以吸血水蛭為原料制備水蛭素的方法與應(yīng)用，該制備方法的特征在于包括吸血水蛭制漿、配制懸濁液和干燥三個(gè)步驟，所得到的粉末，它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。本發(fā)明具有工藝簡單，生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品保存期長、并可采用Matkwatdt凝血酶直接滴定法檢測天然水蛭素含量，從而使質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品療效有保證等特點(diǎn)。水蛭素應(yīng)用范圍廣泛，可通過常規(guī)的方法單獨(dú)做成膠囊、軟膠囊、顆粒劑、片劑使用，或與其他動(dòng)、植物藥制成復(fù)方制劑，用于防治腦中風(fēng)、高血壓、高脂血癥、冠心病等心腦血管疾病。
[0006]3.中國專利:200710026461.6發(fā)明名稱:一種以菲牛蛭唾液為原材料的水蛭素生產(chǎn)工藝。摘要:一種以菲牛蛭唾液為原材料的水蛭素生產(chǎn)工藝，屬于中藥領(lǐng)域，涉及動(dòng)物有效成分的提取。目的是解決傳統(tǒng)誰找死提取工藝難以工業(yè)化生產(chǎn)的問題。該工藝用菲牛蛭唾液提取水蛭素，可以工業(yè)化生產(chǎn)。菲牛蛭唾液用生理鹽水提取，提取液煮沸、過濾、取濾液。固形物用生理鹽水提取，過濾、取濾液。合并前后的全部液體，加入Lyphgel處理兩次，過濾、取濾液。濾液煮沸后迅速冷卻，冷藏過夜。離心，去上清液減壓濃縮后再冷凍干燥成凍干粉。本生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品活力高，有很強(qiáng)的溶血栓左右。
[0007]4.中國專利:200710026462.0發(fā)明名稱:一種以菲牛蛭冷凍新鮮體為原材料的水
蛭素生產(chǎn)工藝。摘要:一種以菲牛蛭冷凍新鮮體為原材料的水蛭素生產(chǎn)工藝，屬于中藥領(lǐng)域，涉及動(dòng)物有效成分的提取。目的是解決傳統(tǒng)誰找死提取工藝難以工業(yè)化生產(chǎn)的問題。該工藝采用從整體菲牛蛭中提取水蛭素，可以工業(yè)化生產(chǎn)。先把菲牛蛭勻漿，漿狀物用生理鹽水提取三次，過濾。濾液煮沸、過濾去除雜蛋白。收集濾液，經(jīng)冷凍濃縮，醇沉后得水蛭素粗品。再用生理鹽水洗滌水蛭素`粗品，然后濃縮洗滌液，最后冷凍干燥得到產(chǎn)品。水蛭素生產(chǎn)工藝方法簡單，成品質(zhì)量合格。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用本工藝提取的水蛭素有很好的藥理作用。
[0008]5.中國專利:200710066096.1發(fā)明名稱:一種天然水蛭素的有效成分的提取方法。摘要:本發(fā)明公開了一種天然水蛭素有效成分的提取方法，使用水清洗吸血水蛭干凈后加入含量15~25%的乙醇溶液浸泡30-50小時(shí)后，過濾，得濾液和藥渣；將菲牛蛭藥渣絞碎，再加含量15~25%的丙酮水溶液浸泡，過濾，得濾液，分別將兩次濾液真空回收乙醇和丙酮后，合并濾液，常規(guī)真空冷凍干燥，得到產(chǎn)品。本發(fā)明工藝簡單，成本低廉，收率較高，產(chǎn)品質(zhì)量好，保存期長，整個(gè)生產(chǎn)過程無“三廢”排放，產(chǎn)品作為醫(yī)藥、美容、保健食品三大領(lǐng)域的原料。
[0009]6.中國專利；201110237495.6發(fā)明名稱:一種天然水蛭素的生產(chǎn)方法。摘要:本發(fā)明公開了一種天然水蛭素的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法的特征在于包括含天然水蛭素液體的提取、酸沉、加熱、脫水和干燥等步驟，所得到的天然水蛭素粉末，可采用Warkawardt凝血酶直接滴定法檢測其活性成分的含量，使質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品療效有保證。該方法具有工藝簡單、提取率高、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品純度高、保存期長等特點(diǎn)，可為食品、保健食品、藥品或化妝品提供安全、優(yōu)質(zhì)的原料。[0010]從上述檢索到的文獻(xiàn)資料了解到，目前國內(nèi)研究提取水蛭素的方法，多是將水蛭絞碎或者干燥后用水、乙醇、超濾或?qū)游龇ㄌ崛?。但是，上述方法有很多不足之處，主要是提取以后有效成分不高，活性一般?5(T6000ATU/g左右，而且根據(jù)不同提取物活性高低不等，雜質(zhì)含量高，不適合注射用藥，有的提取方法繁雜，有的方法過程較慢，不適合用于工業(yè)生產(chǎn)，所以目前水蛭素的提取方法還有很多人在研究，希望找到效率高、成本低、活性成分高的提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本工藝是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種基于新型陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝，這種工藝效率高、成本低，并且得到具有純度高，活性高，質(zhì)量好的天然水蛭素。
[0012]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明的基于新型陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝，包括下述步
驟:
(1)從螞蝗粉中粗提水蛭素:按照材料重量的2倍加入三氯乙酸提取液，8000r/min離心30min，上清備用；沉淀繼續(xù)重復(fù)提取兩次，所有上清液混合，調(diào)節(jié)上清液pH至4.0左右，加三倍冷丙酮沉淀，4°C靜置過夜，回收上清中的丙酮，沉淀去丙酮備用；
(2)DEAE-硅膠柱分離純化:向上述步驟(1)所得沉淀中加1-10倍量的超純水，充分溶解，用DEAE-硅膠柱中壓液相色譜進(jìn)行分離純化，并收集水蛭素峰位置洗脫液，備用；
(3)脫鹽濃縮:把步驟(2)中所得上清液進(jìn)行透析，中間換水2-8次，每次間隔不小于2h ;透析過的上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40-70°C,0-250r/min)進(jìn)行濃縮,0_8°C冷藏備用；
(4)于凍干機(jī)凍干，收集后密封保存。
[0013]所述步驟(2)中所述的DEAE-硅膠柱的填料為大孔硅膠，孔徑在300-600 A，其表面涂覆一層含二乙基胺基的聚合物，填料粒度為30-150 μ m。
[0014]所述的含二乙基胺基的聚合物為甲基丙烯酸二乙基氨基乙脂聚合物以及二乙基氨基乙基取代的纖維素。
[0015]所述步驟(2)中DEAE-硅膠柱分離純化的流動(dòng)相為純鹽溶液，無毒無污染，流動(dòng)相流速高，分離效率好，柱溫為常溫，采用紫外檢測器對(duì)樣品溶液進(jìn)行液相色譜檢測。
`[0016]步驟(3)中所述透析是使用的透析膜是截留分子量小于等于7000的透析袋，透析時(shí)間最少24h ;濃縮是在40-70°C范圍下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除30%~80%的水分，得濃縮液。
[0017]根據(jù)水蛭素能與凝血酶特異性結(jié)合，使凝血酶失活，其結(jié)合比例是1:1的原理，用Matkwardt凝血酶直接滴定法可檢測天然水蛭素的活性。
[0018]水蛭素的計(jì)量單位為國際單位，以ATU表示，凝血酶活性的國際單位為ΝΙΗ，即I個(gè)ATU等于中和I個(gè)NIH凝血酶的水蛭素量。
[0019]天然螞蝗粉中抗凝血活性最高的那一組分通常被認(rèn)為是水蛭素。本工藝所得到的水蛭素粉末成品，可采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測其抗凝血活性。
[0020]天然水蛭素活性檢測方法:
準(zhǔn)確稱取本品粉末0.01g,置于1.5ml離心管中，加入400 μ L 0.9%生理鹽水溶液，搖勻使之溶解，配制成0.025g/ml供試品溶液。精密量取供試品溶液100 μ L，置1.5ml離心管中，加入含有0.5%人纖維蛋白原的三強(qiáng)甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(PH7.4) 200 μ L，搖勻，置水浴(37±0.5)°C中，緩緩滴加每Iml (中)含40NIH (單位)的凝血酶溶液(5 yL /min，邊滴加邊輕輕搖勻)至溶液中出現(xiàn)凝固為止，記錄消耗凝血酶溶液的體積。按下式計(jì)算活性:
U = ClVl / (C2V2 )
式中:u為每I g水蛭素的活性單位(ATU/g)；
Cl為凝血酶溶液的濃度(NIH/mL)；
C2為供試品溶液的質(zhì)量濃度(g/mL )；
Vl為消耗凝血酶溶液的體積(UL);
V2為供試品溶液的加入量(μυ ;
上述天然水蛭素活性檢測方法均適用于天然水蛭素為主要原料所制成的各種產(chǎn)品的質(zhì)量檢測。
[0021]本發(fā)明的工藝簡單、提取率高、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品純度高、保存期長、可采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測其抗凝血活性，特別是本發(fā)明采用的與現(xiàn)有技術(shù)不同的提取、沉淀、分離純化和干燥的工藝，從而使質(zhì)量更穩(wěn)定，攜帶和服用方便，可為食品、保健食品、藥品或化妝品提供安全、優(yōu)質(zhì)的原料，在臨床應(yīng)用中，根據(jù)不同的需要，可以將本發(fā)明制成具有針對(duì)性的產(chǎn)品。
[0022]經(jīng)本發(fā)明的發(fā)明方法純化所得的天然水蛭素純度高，活性高，成本低，操作簡單，易重復(fù)，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
[0023]本工藝所得到的天然水蛭素產(chǎn)品可以用于食品、保健品、藥品或化妝品的原料，具有抗凝溶栓、改善血液循環(huán)、促進(jìn)新陳代謝等作用，在臨床上用于防治心腦血管疾病，如中風(fēng)、誕心病、聞血脂等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為螞蝗粉粗提液的HPLC圖，可看出，螞蝗粉中除水蛭素外，還含有大量的雜蛋白，致使提取高純度水蛭素的難度比較大。經(jīng)多次重復(fù)檢測，并與廣西南寧市金海科康醫(yī)藥科技有限公司提供的水蛭素純化產(chǎn)物HPLC圖(圖3)對(duì)比分析得知9號(hào)蛋白峰即水蛭素純化產(chǎn)物峰。
[0025]圖2為用DEAE-硅膠液相色譜柱分離純化水蛭素提取液的色譜圖，由圖可以看出粗提液中仍然含有大量的雜蛋白，但是用所選DEAE-硅膠液相色譜柱可以把3號(hào)峰與其它蛋白很好地分離開。收集四個(gè)峰位置蛋白溶液，透析并凍干后采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測活性，發(fā)現(xiàn)3號(hào)峰蛋白抗凝血活性最大，平均在10000ATU/g左右，其余吸收峰位置蛋白的水蛭素活性都小于400ATU/g，所以3號(hào)蛋白峰即水蛭素純化產(chǎn)物峰，這個(gè)部分的收集液也就是本實(shí)驗(yàn)的水蛭素純化產(chǎn)物。
[0026]圖3為廣西南寧市金?？瓶滇t(yī)藥科技有限公司提供的水蛭素純化產(chǎn)物HPLC圖，圖中6號(hào)峰為水蛭素純化產(chǎn)物峰。
[0027]圖4為用本工藝得到的水蛭素純化產(chǎn)物的HPLC圖，圖中2號(hào)峰為水蛭素純化產(chǎn)物峰，可看出經(jīng)過提純的水蛭素純度很高。與圖3對(duì)比可以看出，經(jīng)過本工藝提純得到的水蛭素純化產(chǎn)物比該公司提供的純品純度還要高。[0028]HPLC 條件:
色譜柱:TSK2000 7.8 X 300mm檢測器:UV 21Onm
流動(dòng)相:0.1M KH2PO4 0.1M (NH4)2SO4 ΡΗ=6.7柱溫:20°C
進(jìn)樣量:10 μ L流速:lmL/min。
[0029]DEAE-硅膠液相色譜住條件:
色譜柱:DEAE-硅膠液相色譜柱20 X IOOmm檢測器:UV 21Onm
流動(dòng)相:A 液:10mM Tris ΡΗ=7.0 B 液:10mMTris 1.0M NaCl ΡΗ=7.0
進(jìn)樣量:0.5mL流速:5mL/min。
[0030]梯度:0%B 5min 0-50%B 30min柱溫:2(TC。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例一:
稱取南寧市金?？瓶滇t(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的螞蝗粉粉末(活性為300ATU/g) 20g，加入超純水20ml，5%TCA(PH 1.15) 20ml，8000r/min離心20min，上清備用；沉淀繼續(xù)重復(fù)提取兩次，所有上清液混合，調(diào)節(jié)PH至4.0，加三倍冷丙酮沉淀，靜置過夜，HPLC檢測結(jié)果見圖1o
[0032]DEAE-硅膠柱液相色譜柱(20 X 100mm)分離純化，色譜柱填充料為表面涂覆有一層甲基丙烯酸二乙氨基乙脂聚合物的大孔硅膠，大孔硅膠孔徑300 A，填料粒度為30 μ m。
[0033]采用紫外檢測器對(duì)樣品溶液進(jìn)行液相色譜檢測，檢測波長210nm，流速5mL/min，梯度:0%B(A:10mM Tris-HCl PH=7.0, B:1OmM Tris-HCl 1.0M NaCl ΡΗ=7.0)8min，0_50%B30min, 0%B IOmin,收集水蛭素峰位置洗脫液，透析24h，中間換水5次，每次間隔大于2h。透析液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(47V )掉50%的水分，凍干，收集，密封保存，檢測結(jié)果見圖2、圖4。本方法所得到的水蛭素純化產(chǎn)物經(jīng)采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產(chǎn)品水蛭素純化產(chǎn)物的活性為11600ATU/g，收率為1.12%。
[0034]實(shí)施例二:
稱取南寧市金?？瓶滇t(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的螞蝗粉粉末(活性為160ATU/g) 20g，加入超純水20ml，5%TCA(PH 1.15) 20ml，8000r/min離心15min，上清備用；沉淀繼續(xù)重復(fù)提取兩次，所有上清液混合，調(diào)節(jié)PH至4.0，加三倍冷丙酮沉淀，靜置過夜，HPLC檢測結(jié)果見圖1o
[0035]DEAE-硅膠柱液相色譜柱(20 X IOOmm)分離純化，色譜柱填充料為表面涂覆有一層二乙基氨基乙基取代的纖維素的大孔硅膠，大孔硅膠孔徑400 A，填料粒度為60 μ m。
[0036]采用紫外檢測器對(duì)樣品溶液進(jìn)行液相色譜檢測，檢測波長210nm，流速5mL/min，梯度:0%B(A:10mM Tris-HCl PH=7.0, B:1OmM Tris-HCl 1.0M NaCl ΡΗ=7.0) 5min，0_60%B30min,0%B lOmin，收集水蛭素純化產(chǎn)物峰位置洗脫液，透析24h，中間換水5次，每次間隔大于2h。透析液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(47°C)掉60%的水分，凍干，收集，密封保存，檢測結(jié)果見圖2、圖4。本方法所得到的水蛭素純化產(chǎn)物經(jīng)采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產(chǎn)品水蛭素的活性為6560ATU/g，收率為0.24%。
[0037]實(shí)施例三:
稱取南寧市金?？瓶滇t(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的螞蝗粉粉末(活性為160ATU/g) 20g，加入超純水20ml，5%TCA(PH 1.15) 20ml，8000r/min離心15min，上清備用；沉淀繼續(xù)重復(fù)提取兩次，所有上清液混合，調(diào)節(jié)PH至4.0，加三倍冷丙酮沉淀，靜置過夜，HPLC檢測結(jié)果見圖1o
[0038]DEAE-硅膠柱液相色譜柱(20 X IOOmm)分離純化，色譜柱填充料為表面涂覆有一層甲基丙烯酸二乙氨基乙脂聚合物的大孔硅膠，大孔硅膠孔徑500 A，填料粒度為100 μ m。
[0039]采用紫外檢測器對(duì)樣品溶液進(jìn)行液相色譜檢測，檢測波長210nm，流速5mL/min，梯度:0%B(A:10mM Tris-HCl PH=7.0, B:1OmM Tris-HCl 1.0M NaCl ΡΗ=7.0) 5min，0_60%B30min,0%B lOmin，收集水蛭素純化產(chǎn)物峰位置洗脫液，透析24h，中間換水5次，每次間隔大于2h。透析液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(47°C)掉60%的水分，凍干，收集，密封保存，檢測結(jié)果見圖2、圖
4。本方法所得到的水蛭素純化產(chǎn)物經(jīng)采用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產(chǎn)品水蛭素純化產(chǎn)物的活性為6580ATU/g，收率為0.23%。
【權(quán)利要求】
1.一種基于陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝，其特征在于包括下述步驟: (1)從螞蝗粉中粗提水蛭素:按照材料重量的2-6倍加入三氯乙酸提取液，離心，上清備用；沉淀繼續(xù)重復(fù)提取兩次，所有上清液混合，調(diào)節(jié)上清液pH至4.0左右，加三倍冷丙酮沉淀，0-8°C靜置過夜，回收上清中的丙酮，沉淀去丙酮備用； (2)DEAE-硅膠柱分離純化:向上述步驟(1)所得沉淀中加1-10倍量的超純水，充分溶解，用DEAE-硅膠柱中壓液相色譜進(jìn)行分離純化，并收集水蛭素峰位置洗脫液，備用； (3)脫鹽濃縮:把步驟(2)中所得上清液進(jìn)行透析，中間換水2-8次，每次間隔不小于2h ;透析過的上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40-70°C,0-250r/min)進(jìn)行濃縮,0_8°C冷藏備用； (4)于凍干機(jī)凍干，收集后密封保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:步驟(2)中所述的DEAE-硅膠柱的填料為大孔硅膠，孔徑在300 -600 A，其表面涂覆一層含二乙基胺的聚合物，填料粒度為30-150 iim。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:所述的含二乙基胺的聚合物為甲基丙烯酸二乙基氨基乙脂聚合物以及二乙基氨基乙基取代的纖維素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:分離洗脫方法簡便，對(duì)環(huán)境無污染，所述步驟(2)中DEAE-硅膠柱分離純化是通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的離子濃度進(jìn)行梯度洗脫的，柱溫為常溫，采用紫外檢測器對(duì)樣品溶液進(jìn)行液相色譜檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于陰離子交換柱高效分離出高活性水蛭素的生產(chǎn)工藝，其特征在于:步驟(3)中所述透析是使用的透析膜是截留分子量小于等于7000的透析袋，透析時(shí)間最少24h ;濃縮是在40-70°C范圍下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除30%~80%的水分，得濃縮液。
【文檔編號(hào)】C07K14/815GK103509105SQ201210220494
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】馮會(huì)藏, 趙堃, 李培培, 王輝, 趙平, 李璐璐, 黃明賢 申請(qǐng)人:鄭州英諾生物科技有限公司