長(zhǎng)效凝血因子和生產(chǎn)它們的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了多肽和編碼它們的多核苷酸，所述多肽包含絨毛膜促性腺激素的至少一個(gè)羧基端肽(CTP)，所述羧基端肽連接至凝血因子的羧基端，但是沒(méi)有連接至凝血因子的氨基端。還公開(kāi)了包含本發(fā)明的多肽和多核苷酸的藥物組合物以及使用和生產(chǎn)它們的方法。
【專利說(shuō)明】長(zhǎng)效凝血因子和生產(chǎn)它們的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 公開(kāi)了包含與凝血因子的羧基端連接的絨毛膜促性腺激素的至少一個(gè)羧基端肽 (CTP)的多肽和編碼它們的多核苷酸。也公開(kāi)包含本發(fā)明的多肽和多核苷酸的藥物組合物 以及使用和生產(chǎn)它們的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 凝血因子補(bǔ)償療法的發(fā)展已經(jīng)改變了許多具有血友病的個(gè)體的生活。血友病是一 組損害身體的控制血液凝固或凝結(jié)的能力的遺傳性基因障礙。具有血友病的患者不會(huì)產(chǎn)生 足夠量的有效血液凝固必需的因子VIII或因子IX蛋白。在嚴(yán)重的血友病患者中，即使微 小損傷可以導(dǎo)致持續(xù)數(shù)天或數(shù)周的失血，并且可能不會(huì)發(fā)生完全愈合，從而導(dǎo)致對(duì)關(guān)節(jié)和 其它器官的虛弱性永久損傷的可能性和過(guò)早死亡。
[0003] -類血友病（血友病B)是一種X-連接的由因子IX(FIX)基因中的突變所造成的 出血障礙，從而導(dǎo)致FIX的促凝活性的缺乏。血友病B患者具有自發(fā)的軟組織出血和反復(fù) 的關(guān)節(jié)積血，經(jīng)常導(dǎo)致摧毀性的關(guān)節(jié)?。╝rthopathy)。這些患者的目前治療方法包括靜脈 內(nèi)施用重組FIX。但是，F(xiàn)IX的成本問(wèn)題和從循環(huán)中相對(duì)快速清除的問(wèn)題使得開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效FIX 成為一項(xiàng)挑戰(zhàn)性的任務(wù)。
[0004] FVIII和FIX的商業(yè)可用性已經(jīng)導(dǎo)致危及生命的出血發(fā)作的改善控制。許多患者 接受預(yù)防性療法，這會(huì)降低出血和它的有關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。但是，高比例的患者（10-30%) 會(huì)發(fā)展針對(duì)外源性施用的FVIII和FIX的抑制性抗體。FVIIa(它是一種旁路產(chǎn)物）的施用 可以誘導(dǎo)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)并提供對(duì)具有抑制性Ab的患者的有效治療。
[0005] 重組FVIIa (NovoSeven?).是商購(gòu)可得的，并且在1996年被批準(zhǔn)用于治療具有 抑制劑的血友病患者中的出血發(fā)作。但是，rFVIIa以2. 5小時(shí)的終末半衰期被快速地清 除。所以，患者通常需要多次頻繁輸注（以2-3小時(shí)間隔施用2-3劑）以在輕度至中度出 血后達(dá)到足夠的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。結(jié)果，在開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效形式的FVIIa中存在許多興趣，所述長(zhǎng)效形式 的FVIIa會(huì)延長(zhǎng)單次劑量以后止血活性的持續(xù)時(shí)間并允許頻率低得多的給藥。長(zhǎng)效FVIIa 也會(huì)增加長(zhǎng)期預(yù)防性療法的可行性。
[0006] 正在開(kāi)發(fā)用于延長(zhǎng)FVIIa的半衰期的不同技術(shù)。但是，挑戰(zhàn)是，實(shí)現(xiàn)該蛋白的延長(zhǎng) 的半衰期，同時(shí)保留它的生物活性并確保修飾不會(huì)誘導(dǎo)顯著的免疫原性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種CTP修飾的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多 肽和連接至所述CTP修飾的FIX多肽的羧基端的3個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
[0008] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含CTP修飾的因子IX(FIX)多肽的藥 物組合物，所述CTP修飾的因子IX(FIX)多肽由FIX多肽和連接至所述CTP修飾的FIX多 肽的羧基端的3個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種編碼CTP修飾的多肽的多核苷酸，所述 CTP修飾的多肽由因子IX(FIX)多肽和連接至所述FIX多肽的羧基端的3個(gè)促性腺激素羧 基端肽（CTP)組成。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含編碼CTP修飾的多肽 的多核苷酸，所述CTP修飾的多肽由因子IX(FIX)多肽和連接至所述FIX多肽的羧基端的 3個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含表達(dá)載體的細(xì)胞，所述表達(dá)載體包 含編碼CTP修飾的多肽的多核苷酸，所述CTP修飾的多肽由因子IX(FIX)多肽和連接至所 述FIX多肽的羧基端的3個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含表達(dá)載體的組合物，所述表達(dá)載體 包含編碼CTP修飾的多肽的多核苷酸，所述CTP修飾的多肽由因子IX(FIX)多肽和連接至 所述FIX多肽的羧基端的3個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
[0013] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種延長(zhǎng)因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的 方法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FIX多 肽的羧基端，由此延長(zhǎng)所述FIX多肽的生物半衰期。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種提高因子IX(FIX)多肽的曲線下面積 (AUC)的方法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所 述FIX多肽的羧基端，由此提高所述FIX多肽的AUC。
[0015] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種降低因子IX(FIX)多肽的施用頻率的方 法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FIX多肽 的羧基端，由此降低所述FIX多肽的施用頻率。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種降低因子IX(FIX)多肽的清除率的方 法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FIX多肽 的羧基端，由此降低所述FIX多肽的清除率。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)CTP修飾的因子IX(FIX)多肽的方 法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FIX多肽 的羧基端，由此生產(chǎn)CTP修飾的FIX多肽。
[0018] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療受試者中的血友病的方法，所述方 法包括：給所述受試者施用CTP修飾的因子IX(FIX)多肽，所述CTP修飾的因子IX(FIX)多 肽包含F(xiàn)IX多肽和連接至所述FIX多肽的羧基端的3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)， 由此治療所述受試者中的血友病。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙的方 法，所述方法包括下述步驟：給所述受試者施用CTP修飾的凝血因子，所述CTP修飾的凝血 因子包含連接至所述FVII多肽的羧基端的3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此 預(yù)防所述受試者中的血友病。
[0020] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙的方 法，所述方法包括下述步驟：給所述受試者施用CTP修飾的凝血因子，所述CTP修飾的凝血 因子包含連接至所述凝血因子的羧基端的3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此 預(yù)防所述受試者中的血友病。
[0021] 從下述詳細(xì)描述實(shí)施例和附圖將明白本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。但是，應(yīng)當(dāng)理解， 所述詳細(xì)描述和具體實(shí)施例盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是僅僅通過(guò)例證給出， 因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員從該詳細(xì)描述會(huì)明白在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1A.顯示的條形圖顯示了在有g(shù)/ml維生素 K3存在下用FIX-CTP和 FIX-CTP-CTP變體有限稀釋的、轉(zhuǎn)染的和選擇的細(xì)胞的收獲物。使用人FIX ELISA試劑盒 (Affinity Biologicals;目錄號(hào)FIX-AG RU0)定量FIX的水平,計(jì)算的蛋白質(zhì)濃度Og/ ml)是兩個(gè)獨(dú)立運(yùn)行的平均值。圖IB顯示了 FIX Ab識(shí)別的SDS-PAGE凝膠顯微照片。顯 微照片A描繪了在蛋白質(zhì)印跡中抗-FIX抗體的識(shí)別；顯微照片B描繪了在蛋白質(zhì)印跡中 抗-Y羧化抗體的識(shí)別。A-B中的泳道1加載了含有重組FIX的樣品。A-B中的泳道2加 載了含有FIX-CTP收獲物的樣品。A-B中的泳道3加載了含有FIX-(CTP) 2收獲物的樣品。
[0023] 圖 2?顯不的圖顯不了與 rhFIX (American Diagnostics)相比的 FIX-CTP 和 FIX-(CTP)2收獲物對(duì)比產(chǎn)色活性（通過(guò)EC5tl.濃度測(cè)量）。
[0024] 圖3.顯示的圖顯示了 rhFIX、FIX-CTP-CTP的收獲物、和FIX-CTP收獲物的PK譜。
[0025] 圖4.顯示的條形圖顯示了使用人FIX ELISA試劑盒（Affinity Biologicals ;目 錄號(hào)FIX-AG RU0)確定的FIX-CTP收獲物和FIX-CTP-CTP收獲物和FIX-CTP-CTP純化的蛋 白FIX抗原水平。計(jì)算的蛋白濃度（yg/ml)是兩個(gè)獨(dú)立運(yùn)行的平均值。
[0026] 圖5.顯示了 FIX Ab識(shí)別的SDS-PAGE凝膠顯微照片。顯微照片A描繪了考馬斯 藍(lán)染色；顯微照片B描繪了蛋白質(zhì)印跡中抗-FIX抗體的識(shí)別；顯微照片C描繪了蛋白質(zhì)印 跡中抗_ Y羧化抗體的識(shí)別。A-C中的泳道1加載了含有FIX- (CTP) 2的樣品。A-C中的泳 道2加載了含有未結(jié)合的FIX-(CTP)2W樣品。A-C中的泳道3加載了含有FIX-(CTP) 2的 濃縮洗脫液的樣品。
[0027] 圖6?顯示的圖顯示了與人正常合并血楽和rhFIX(American Diagnostics)相比 的FIX-(CTP) 2產(chǎn)色活性（樣品濃度/0. D.)。
[0028] 圖 7?顯示的圖顯示了純化的FIX-CTP-CTP、rhFIX、FIX-CTP-CTP 收獲物和FIX-CTP 收獲物的PK譜。
[0029] 圖8.顯示了與3、4或5個(gè)CTP融合的FIX的抗-CTP和抗-Y羧化抗體蛋白質(zhì)印 跡。使用 Precision plus 雙色蛋白標(biāo)志物（Bio-Rad)將 FIX-CTP3、FIX-CTPjP FIX-CTP 5收 獲物加載上12% Tris-甘氨酸凝膠。使用抗-CTP多克隆Ab(Adar Biotech Production) 或抗-Gla Ab (American Diagnostica)通過(guò)蛋白免疫印跡進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0030] 圖 9.顯示了 FIX-CTP3、FIX-CTPjP FIX-CTP 5的考馬斯藍(lán)檢測(cè)。在利用 Jacalin 柱的純化過(guò)程（糖基化蛋白的免疫親和純化）以后，使用Precision Plus雙色蛋白標(biāo)志物 (Bio-Rad)將 FIX-CTP3、FIX-CTPjP FIX-CTP 5加載上 12% Tris-甘氨酸凝膠。用考馬斯藍(lán) 染料進(jìn)行SDS-PAGE染色用于樣品檢測(cè)。
[0031] 圖10.顯示了 FIX產(chǎn)色活性。使用商購(gòu)可得的產(chǎn)色活性試驗(yàn)試劑盒 BI0PHEN (Hyphen BioMed 221802)進(jìn)行完全純化的（HA 柱）FIX-CTP3、FIX-CTP4和 FIX-CTP5相對(duì)于人血庫(kù)正常血漿的體外效能的對(duì)比評(píng)估。將所有樣品系列稀釋，并通過(guò)將劑量響應(yīng) 曲線與由正常人血漿組成的參考制劑進(jìn)行對(duì)比來(lái)評(píng)估效能。
[0032] 圖11.顯示了 FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的對(duì)比藥代動(dòng)力學(xué)（PK)分布。使 用人FIX Elisa試劑盒（Affinity Biologicals)定量血漿樣品中的FIX濃度。計(jì)算藥代 動(dòng)力學(xué)分布，為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只動(dòng)物的平均值。使用PK Solutions 2.0軟件計(jì)算終末半衰 期。
[0033] 圖 12.顯示了 Fix-CtP3SDS-PAGE 分析-考馬斯 SDS-PAGE。使用 Precision Plus 雙色蛋白標(biāo)志物（Bio-Rad)將FIX-CTP3 Y-羧化的富集的蛋白rhFIX和rFIXa(活化的 FIX)加載上12% Tris-甘氨酸凝膠。通過(guò)用考馬斯藍(lán)試劑（800ng蛋白）對(duì)凝膠染色，進(jìn)行 SDS-PAGE考馬斯分析（圖12A)。使用IOOng蛋白用抗-人FIX多克隆Ab (圖12B)、抗-人 Y羧化單克隆抗體（American Diagnostics目錄號(hào)499, 3570)(圖12C)、抗-FIX前肽多克 隆Ab (圖12D)和抗-CTP多克隆Ab (圖12E)進(jìn)行蛋白免疫印跡。
[0034] 圖13:顯示了 色活性。使用商購(gòu)可得的產(chǎn)色活性試驗(yàn)試劑盒 BI0PHEN(Hyphen BioMed 221802)進(jìn)行？1乂-〇?3收獲物和 FIX-CTP3 Y-羧化的富集的蛋白 相對(duì)于人血庫(kù)正常血漿的體外效能的對(duì)比評(píng)估。將獲物和蛋白系列稀釋，并通 過(guò)將劑量響應(yīng)曲線與由正常人血漿組成的參考制劑進(jìn)行對(duì)比來(lái)評(píng)估效能。
[0035] 圖14:顯示了對(duì)比凝固時(shí)間。進(jìn)行了將FIX-CTP3的凝血活性與BeneFIX進(jìn)行對(duì) 比的體外aPTT (活化的部分凝血酶時(shí)間測(cè)定）。將蛋白系列稀釋，并摻入除去FIX的人血漿 中，并評(píng)價(jià)凝固時(shí)間。
[0036] 圖 15.顯示了 FIX-CTP3對(duì)比 PK 譜。使用人 FIX ELISA 試劑盒（Affinity Biologicals;目錄號(hào)FIX-AG RU0)定量FIX濃度。計(jì)算每種蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)分布，為每 個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只動(dòng)物的平均值。
[0037] 圖16.顯示了活性譜參數(shù)。與PK取樣平行地，通過(guò)aPTT測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)施用了 BeneFIX?或FIX-CTP3的FIX-缺陷型動(dòng)物的檸檬酸鹽化的血漿樣品的凝血活性，將其轉(zhuǎn) 換為活性百分比。將在每個(gè)收集點(diǎn)的活性百分比計(jì)算為當(dāng)前凝固時(shí)間/正常血庫(kù)小鼠血漿 的凝固時(shí)間*100。
[0038] 圖17.顯示了第一次攻擊出血參數(shù)。給Fix-缺陷型小鼠施用lOOIU/Kg BeneFIX?或rFix-CTP3的單次靜脈內(nèi)注射。在給藥后48小時(shí)稍微剪斷尾靜脈，并評(píng)價(jià) 尾靜脈出血時(shí)間（TVBT)和出血強(qiáng)度（血紅蛋白0D)。在達(dá)到體內(nèi)穩(wěn)態(tài)以后15分鐘進(jìn)行第 二次出血攻擊，并測(cè)量相同的參數(shù)。
[0039] 圖18.顯示了第二次攻擊出血參數(shù)。在圖19的說(shuō)明中描述的第一次出血自發(fā)地 或手工地停止以后，在第一次出血以后15分鐘進(jìn)行第二次出血攻擊，并重新測(cè)量時(shí)間和 出血強(qiáng)度。
[0040] 圖19.顯示了的簡(jiǎn)圖解釋了 rFVII-CTP構(gòu)建體（A)、rFVII-CTP-CTP構(gòu)建體（B)、 rFIX-CTP 構(gòu)建體（C)和 rFIX-CTP-CTP 構(gòu)建體（D)。
[0041] 圖20A.顯示的條形圖顯示了在有5iig/ml維生素 K3存在下用FVII-CTP變體有 限稀釋的、克隆轉(zhuǎn)染的和選擇的細(xì)胞的收獲物。使用FVII ELlSA(AssayPr0)定量FVII水 平。
[0042] 圖20B.顯示的條形圖顯示了在有5 iig維生素 K3存在下用FVII-CTP變體有限 稀釋的、轉(zhuǎn)染的和選擇的細(xì)胞的收獲物.活性.使用FVII產(chǎn)色活性測(cè)定（AssayPro)定量 FVII活性。
[0043] 圖20C.顯示的條形圖顯示了在有5 ii g維生素 K3存在下用FVII-CTP變體有限稀 釋的、轉(zhuǎn)染的和選擇的細(xì)胞的收獲物。通過(guò)將活性值除以收獲物FVII濃度，為每種形式計(jì) 算FVII的比活性。
[0044] 圖20D.顯示的圖顯示了 FVII、FVII-CTP-CTP和FVII-CTP收獲物的PK譜。
[0045] 圖21.顯示了使用抗-FVII、抗-CTP和抗-Y羧化抗體檢測(cè)的與3、4和5個(gè)CTP融 合的FVII的蛋白質(zhì)印跡。使用Precision plus雙色蛋白標(biāo)志物（Bio-Rad)將FVII_CTP3、 FVII-CTPJP FVII-CTP 5收獲物加載上 12% Tris-甘氨酸凝膠（expedeon)。使用抗-FVII Ab、抗-CTP 多克隆 Ab (Adar Biotech Production)或抗-Gla Ab (American Diagnostica) 通過(guò)蛋白免疫印跡進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0046] 圖22.顯示了 FVII活性-產(chǎn)色活性。使用商購(gòu)可得的產(chǎn)色活性試驗(yàn)試劑盒 BI0PHEN(Hyphen BioMed 221304)，進(jìn)行 HA 純化的（高度 Y 羧化的級(jí)分）FVII-CTP3、 FVII-CTPJP FVII-CTP 5相對(duì)于正常人合并血漿的體外效能的對(duì)比評(píng)估。將所有樣品系列 稀釋，并通過(guò)將劑量響應(yīng)曲線與由正常人血漿組成的參考制劑進(jìn)行對(duì)比來(lái)評(píng)估效能。
[0047] 圖23.顯示了第一對(duì)比藥代動(dòng)力學(xué)（PK)分布-FVII 3、4和5個(gè)CTP。以250 ii g/ kg體重的劑量將FVII-CTP3、FVII-CTP# FVII-CTP 5 (分別是組A、B和C)在單次靜脈內(nèi)注 射中施用給Sprague Dawley大鼠（6只大鼠/治療）。可替代地在給藥后0. 083、0. 5、2、5、 8、24、48、72和96小時(shí)從3只大鼠在眶后抽取血液樣品。在取樣后立即制備檸檬酸鹽化的 血漿（0. 38% )，并在分析之前在-20°C儲(chǔ)存。FVII-CTP5表現(xiàn)出與其它2種形式相比優(yōu)越 的特性。
[0048] 圖24.顯示了第二對(duì)比PK譜-FVII 3、4和5個(gè)CTP。以29. 45iig/kg體重的劑 量將FVII選擇和HA純化過(guò)程以后的FVII-CTP3、FVII-CTPJP FVII-CTP 5(分別是組A、B 和C)在單次靜脈內(nèi)注射中施用給Sprague Dawley大鼠（每種物質(zhì)3只大鼠）。在給藥后 0. 083、0. 5、2、8、24、48和72小時(shí)在眶后抽取血液樣品。在取樣后立即制備檸檬酸鹽化的血 漿（0. 38% )，并在分析之前在-20°C儲(chǔ)存。
[0049] 圖25.顯示了 FVII-CTPji^t過(guò)程的示意圖。生產(chǎn)了批次31用于PK/H)研究。生 產(chǎn)了批次38用于存活研究。
[0050] 圖26.顯示了最終的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。將IOiig(批次 31)或5 ii g (批次38)加載進(jìn)考馬斯染色的SDS-PAGE的每個(gè)泳道中。將I ii g蛋白加載進(jìn) 蛋白質(zhì)印跡的每個(gè)泳道中。LFVn-CTP3多肽；2.重鏈，包括3x CTP ;3.輕鏈。所有3種抗 體都檢測(cè)FVII。a -CTP檢測(cè)FVIIa重鏈，a -FVII和a -Gla檢測(cè)輕鏈。
[0051] 圖 27?表明，由于在 Ceramic Hydroxyapatite(HA)柱上的純化，增強(qiáng)了 FVII-CTP3產(chǎn)色活性。使用商購(gòu)可得的產(chǎn)色活性試驗(yàn)試劑盒BI0PHEN(Hyphen BioMed 221304)，進(jìn)行 FVII-CTP3收獲物、過(guò)程中級(jí)分和純化的FVII-CTP 3相對(duì)于人血庫(kù)正常血漿的體外效能的對(duì) 比評(píng)估。將FVII-CtIV^獲物和蛋白系列稀釋，并通過(guò)將劑量響應(yīng)曲線與正常人血漿的參 考制劑進(jìn)行對(duì)比來(lái)評(píng)估效能。
[0052] 圖28.顯示了 FVIII-缺陷型小鼠中FVIIa-CTP3相對(duì)于NovoSeven⑧的PK譜。 在FVII選擇、HA純化過(guò)程和活化以后，生產(chǎn)FVIIa-CTP3。將FVIIa-CTP^ NoVoSeven?. 在單次靜脈內(nèi)注射中施用給FVIII-/-血友病小鼠。在給藥后0. 083、0. 5、2、8、24、48和72 小時(shí)，在眶后抽取血液樣品。在取樣后立即制備檸檬酸鹽化的血漿（0.38%)，并在分析之 前在-20°C儲(chǔ)存，并使用STACLOT商業(yè)試劑盒基于FVIIa凝血活性來(lái)建立PK譜。
[0053] 圖29.表明，在FVII選擇、HA純化過(guò)程和活化以后生產(chǎn)FVIIa-CTP3。 將 FVIIa-CTP3* NovoSeven?.在單次靜脈內(nèi)注射中施用給FVIII-/-血友病小鼠。在給藥 后0. 083、0. 5、2、8、24、48和72小時(shí)在眶后抽取血液樣品。在取樣后立即制備朽1橡酸鹽化 的血漿（0. 38% )，并在分析之前在-20°C儲(chǔ)存。在PK實(shí)驗(yàn)過(guò)程中評(píng)價(jià)凝血酶產(chǎn)生參數(shù)，并 評(píng)價(jià)包括達(dá)到峰值的最大量、達(dá)到時(shí)間點(diǎn)的凝血酶的量和凝血酶產(chǎn)生速率在內(nèi)的參數(shù)。
[0054] 圖30.顯示了尾靜脈橫斷（TVT)以后的血友病小鼠存活曲線。在給藥后⑷15min、 (B) 24小時(shí)或（C) 48小時(shí)進(jìn)行TVT。在TVT以后觀察小鼠存活24小時(shí)，并對(duì)于前12小時(shí)中 的每個(gè)小時(shí)和24小時(shí)以后進(jìn)行記錄。圖33D總結(jié)了 TVT后24小時(shí)記錄的小鼠存活。對(duì)照 組數(shù)據(jù)（媒介物）是使用5只小鼠/實(shí)驗(yàn)的3個(gè)實(shí)驗(yàn)的總和。
[0055] 圖31.顯示了 FVII-3-CTP和FVII-5CTP免疫印跡：A)針對(duì)GLA的印跡。B)針對(duì) FVIIa的印跡。C)針對(duì)CTP的印跡。
[0056] 圖32?顯示了得自選擇和HA柱純化（FVIIS相對(duì)于FVII HA)的對(duì)比PK譜（FVII 3個(gè)和5個(gè)CTP)。
[0057] 圖33.顯示了第二個(gè)研究（靜脈內(nèi)相對(duì)于皮下）的對(duì)比PK譜（FVII 3個(gè)和5個(gè) CTP)。
[0058] 圖34.顯示了尾靜脈橫斷（TVT)以后的血友病小鼠存活曲線。在皮下施用后12 小時(shí)進(jìn)行TVT。在TVT以后觀察小鼠存活24小時(shí)，并對(duì)于前12小時(shí)中的每個(gè)小時(shí)和24小 時(shí)以后進(jìn)行記錄。
[0059] 圖35?顯示了靜脈內(nèi)或皮下施用以后mod-5014相對(duì)于NovoSeven?的PK譜。 A)顯示了靜脈內(nèi)施用；B)顯示了皮下施用。
[0060] 圖36.顯示了單次皮下施用以后M0D-5014(克隆61#75、#81)相對(duì)于 NovoSeven? 的 PK 譜。

【具體實(shí)施方式】
[0061] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了長(zhǎng)效凝血因子以及生產(chǎn)和使用它們的方法。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，長(zhǎng)效凝血因子包含羧基端肽（CTP，也被稱作CTP單元）。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，包含凝血因子的長(zhǎng)效多肽還包含人絨毛膜促性腺激素（hCG)的羧基端肽（CTP)。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，CTP充當(dāng)對(duì)抗凝血因子降解的保護(hù)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CTP會(huì)延 長(zhǎng)凝血因子的Cmax。在另一個(gè)實(shí)施方案中，CTP會(huì)延長(zhǎng)凝血因子的Tmax。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，CTP會(huì)延長(zhǎng)凝血因子的循環(huán)半衰期。在某些實(shí)施方案中，CTP會(huì)增強(qiáng)凝血因子的效能。 [0062] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了一種延長(zhǎng)凝血因子的生物半衰期的方法，所述 方法包括下述步驟：將1-10個(gè)CTP連接至所述凝血因子的羧基端，由此延長(zhǎng)所述凝血因子 的生物半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了一種延長(zhǎng)凝血因子的生物半衰期的方法， 所述方法包括下述步驟：將1-5個(gè)CTP連接至所述凝血因子的羧基端，由此延長(zhǎng)所述凝血因 子的生物半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種延長(zhǎng)凝血因子的循環(huán)半衰期的 方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種增加凝血因子的半衰期的方法。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種延長(zhǎng)凝血因子的半衰期的方法。
[0063] 凝血因子VII (FVII)是作為無(wú)活性前酶由肝細(xì)胞分泌進(jìn)血流中的444個(gè)氨基酸的 糖蛋白（50KDa)。在組織損害和暴露于循環(huán)血液以后，F(xiàn)VII會(huì)與組織因子（TF)形成復(fù)合 物，所述組織因子是FVII的真實(shí)受體蛋白且由位于血管壁的深層中的不同細(xì)胞表達(dá)。該 FVII-TF復(fù)合物的形成會(huì)導(dǎo)致FVII的活化?；罨腇VII (FVIIa)會(huì)通過(guò)活化因子IX和因 子X(jué)啟動(dòng)外因性凝血途徑。
[0064] FVII屬于一群與凝血系統(tǒng)有關(guān)的維生素 K依賴性的糖蛋白。除了 FVII以外，該群 由因子IX、因子X(jué)、蛋白C和凝血酶原組成。這些蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)，并且被合成 為具有N-端前肽和隨后的成熟氨基酸序列的前體。所述前肽含有Y羧化酶的停泊位點(diǎn)， 所述Y羧化酶將谷氨酸（Glu)轉(zhuǎn)化成Y羧基谷氨酸（Gla)。該結(jié)構(gòu)域后面是2個(gè)表皮生 長(zhǎng)因子樣（EGF)結(jié)構(gòu)域、連接區(qū)域（CR)和C-端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。在分泌之前，F(xiàn)VII前 肽被切割從而形成406個(gè)氨基酸的單鏈酶原FVII糖蛋白。在分泌之后，所述蛋白可以通過(guò) 在CR中的切割活化成二硫鍵連接的雙鏈異源二聚體FVIIa。FVII的血漿濃度是10nM，且大 約1 %在健康個(gè)體中以活性形式循環(huán)。
[0065] 因子IX(FIX)是一種415個(gè)氨基酸（55KDa)的糖蛋白；它屬于一群維生素 K依賴 性的與凝血系統(tǒng)有關(guān)的糖蛋白。FIX具有與因子FVII、因子X(jué)、蛋白C和凝血酶原（它們合 成為具有N-端前肽和隨后的成熟氨基酸序列的前體）類似的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)。
[0066] FIX被分泌為經(jīng)歷復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后修飾的單鏈分子，其中的許多修飾對(duì)于它的生化 和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)而言是關(guān)鍵性的。在所有的轉(zhuǎn)錄后修飾中，在FIX的氨基端附近的12個(gè) 谷氨酸殘基（其被維生素 K依賴性的Y羧化酶Y羧化）是最關(guān)鍵的殘基。羧化是FIX與 磷脂表面的相互作用和最佳FIX活性所必需的。所述氨基端前肽充當(dāng)Y羧化酶的識(shí)別位 點(diǎn)，并因此在Y羧化之后由被稱作成對(duì)的堿性氨基酸裂解酶（PACE/弗林蛋白酶）的高爾 基體絲氨酸蛋白酶裂解除去。在高爾基體處可能發(fā)生四個(gè)額外的轉(zhuǎn)錄后修飾：酪氨酸155 的硫酸化、絲氨酸158的磷酸化、Ser 63和61上的0-糖基化、以及最后在Asn 157和16上 的N-糖基化，但是被證實(shí)不是FIX的適當(dāng)活性所必需的。
[0067] FIX作為單鏈無(wú)活性酶原在血漿中循環(huán)（5 ii g/ml的平均濃度）。在一種或兩種生 理激活物FVIIa-TF復(fù)合物或FIXa在兩個(gè)肽鍵Arg 145和Argl80處發(fā)生蛋白水解性裂解 以后，活化肽被除去，從而將FIX轉(zhuǎn)化成由單個(gè)二硫鍵保持在一起的輕鏈和重鏈組成的完 全活性的酶。所述N-端輕鏈含有非催化性的Y羧基谷氨酸（Gla)和兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣 結(jié)構(gòu)域，而C-端重鏈含有該分子的胰蛋白酶樣催化結(jié)構(gòu)域。單獨(dú)的FIXa的特征在于較差 的催化活性。但是，當(dāng)與FVIII形成復(fù)合物時(shí)，它對(duì)于它的天然底物FX的蛋白水解活性增 加了 4-5個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0068] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了一種延長(zhǎng)凝血因子的生物半衰期的方法或提高 曲線下面積（AUC)的方法，所述方法包括下述步驟：將1-10個(gè)CTP連接至所述凝血因子的 羧基端，由此延長(zhǎng)所述凝血因子的生物半衰期或提高AUC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供 了一種延長(zhǎng)凝血因子的生物半衰期的方法或提高曲線下面積（AUC)的方法，所述方法包括 下述步驟：將1-5個(gè)CTP連接至所述凝血因子的羧基端，由此延長(zhǎng)所述凝血因子的生物半衰 期或提高AUC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了一種延長(zhǎng)FIX的生物半衰期的方法或提 高曲線下面積（AUC)的方法，所述方法包括下述步驟：將1-5個(gè)CTP連接至FIX的羧基端， 由此延長(zhǎng)生物半衰期或提高FIX的AUC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了一種延長(zhǎng)FVII 或FVIIa的生物半衰期的方法或提高曲線下面積（AUC)的方法，所述方法包括下述步驟：將 1-5個(gè)CTP連接至FVII或FVIIa的羧基端，由此延長(zhǎng)生物半衰期或提高FVII或FVIIa的 AUC。
[0069] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種延長(zhǎng)因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的 方法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FIX多 肽的羧基端，由此延長(zhǎng)所述FIX多肽的生物半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明另外提供 了一種延長(zhǎng)因子Vila (FVIIa)多肽的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步驟：將至多5 個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此延長(zhǎng)所述FVIIa 多肽的生物半衰期。在一個(gè)實(shí)施方案中，將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至 所述FVIIa多肽的羧基端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將4個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP) 連接至所述FVIIa多肽的羧基端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端 肽（CTP)連接至所述FVIIa多肽的羧基端。
[0070] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種提高因子IX(FIX)多肽的曲線下面積 (AUC)的方法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所 述FIX多肽的羧基端，由此提高所述FIX多肽的AUC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種提高因子Vila(FVIIa)多肽的曲線下面積（AUC)的方法，所述方法包括下述步驟：將至 多5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此提高所述 FVIIa多肽的AUC。在一個(gè)實(shí)施方案中，將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所 述FVIIa多肽的羧基端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將4個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP) 連接至所述FVIIa多肽的羧基端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端 肽（CTP)連接至所述FVIIa多肽的羧基端。
[0071] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝血因子是蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明 的凝血因子是肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的凝血因子是多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述凝血因子是酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是絲氨酸蛋白酶。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述凝血因子是糖蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是無(wú)活性酶原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意凝血因子。
[0072] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子VIII (FVIII)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述凝血因子是因子V(FV)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子X(jué)III(FXIII)。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子X(jué) (FX)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是纖 維蛋白。
[0073] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子VIIa(FVIIa)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述凝血因子是因子VII (FVII)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子IX (FIX)。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子X(jué) (FX)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因 子X(jué)Ia(FXIa)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子X(jué)II (FXII)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述凝血因子是因子X(jué)a(FXa)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子Va(FVa)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是凝血酶原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是 凝血酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子X(jué)I (FXI)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述凝血因子是Von Willebrand因子（vWF)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子 Villa(FVIIIa)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是B刪除的結(jié)構(gòu)域FVIII (FVIIIBDD)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是B結(jié)構(gòu)域刪除的FVIII (FVIIIBDD)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述凝血因子是P結(jié)構(gòu)域刪除的FVIII(FVIIIBDD)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 凝血因子是因子IXa(FIXa)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是前激肽釋放酶。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是激肽釋放酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子 XIIa(FXIIa)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是纖維蛋白原。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述凝血因子是血栓調(diào)節(jié)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是因子II (FII)。
[0074] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是糖蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因 子是維生素 K依賴性的糖蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是維生素 K非依賴性 的糖蛋白。
[0075] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血 因子是重組糖蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組糖蛋白FV。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述凝血因子是重組FVI。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FVII。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FVIII。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組 FIX。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FX。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子 是重組FXI。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FXII。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 凝血因子是重組FvW。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FII。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述凝血因子是重組FIXa。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FXIa。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組纖維蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組 FVIIa。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FXa。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因 子是重組FVa。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組凝血酶原。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述凝血因子是重組凝血酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FVIIIa。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組前激肽釋放酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子 是重組激肽釋放酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是重組FXIIa。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述凝血因子是任意已知的重組凝血因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含信號(hào)肽的凝 血因子是任意已知的重組凝血因子。
[0076] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，凝血因子包含1-10個(gè)連接至C-端的CTP重復(fù)且不包含連 接至N-端的CTP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，凝血因子包含至少一個(gè)連接至C-端的CTP且不 包含連接至N-端的CTP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含1-10個(gè)連接至C-端的CTP重復(fù)且不 包含連接至N-端的CTP的凝血因子是經(jīng)工程改造的凝血因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含 至少一個(gè)連接至C-端的CTP且不包含連接至N-端的CTP的凝血因子是經(jīng)工程改造的凝 血因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含1-10個(gè)連接至C-端的CTP重復(fù)且不包含連接至N-端 的CTP的凝血因子是綴合的凝血因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少一個(gè)連接至C-端的 CTP且不包含連接至N-端的CTP的凝血因子是綴合的凝血因子。
[0077] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種CTP修飾的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多 肽和連接至所述CTP修飾的FIX多肽的羧基端的3個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
[0078] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明另外提供了一種CTP修飾的因子VIIa(FVIIa)多肽， 其由FVIIa多肽和連接至所述FVIIa的羧基端的5個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
[0079] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是包含與FIX、FVII、因子X(jué)、蛋白C或凝血酶 原的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)類似或相同的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)的凝血因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因 子被合成為具有N-端前肽的前體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文中使用的凝血因子是呈無(wú)活 性的前酶形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血因子是在肝細(xì)胞中產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述凝血因子包含Y羧化酶的停泊位點(diǎn)，所述Y羧化酶將谷氨酸（Glu)轉(zhuǎn)化成Y 羧基谷氨酸（Gla)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文中使用的凝血因子是商購(gòu)可得的凝血因子。
[0080] 在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼因子VII的核酸序列包含下述核酸序列：

【權(quán)利要求】
1. 一種CTP修飾的因子IX (FIX)多肽，其由FIX多肽和連接至所述CTP修飾的FIX多 肽的羧基端的3個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CTP修飾的FIX多肽，其中至少一個(gè)CTP是由選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氛基酸序列編碼。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的FIX多肽，其中至少一個(gè)CTP被糖 基化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的FIX多肽，其中至少一個(gè)CTP被截 短。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的FIX多肽，其中至少一個(gè)CTP經(jīng)由 接頭連接至所述FIX多肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的CTP修飾的FIX多肽，其中所述接頭是肽鍵。
7. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的FIX多肽。
8. -種多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的多肽。
9. 一種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求8所述的多核苷酸。
10. -種細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體。
11. 一種組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體。
12. -種治療受試者中的血友病的方法，所述方法包括：給受試者施用根據(jù)權(quán)利要求 1-6中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的因子IX(FIX)多肽。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的因子IX(FIX)多肽在制備用于治 療受試者中的血友病的組合物中的用途。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的因子IX(FIX)多肽用于治療受試 者中的血友病的用途。
15. -種延長(zhǎng)因子IX(FIX)多肽的生物半衰期、提高曲線下面積（AUC)、降低施用頻率 或降低清除率的方法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連 接至所述FIX多肽的羧基端，由此延長(zhǎng)所述FIX多肽的生物半衰期、提高曲線下面積（AUC)、 降低施用頻率或降低清除率。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中至少一個(gè)CTP是由選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列編碼。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15-16中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP被糖基化。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15-17中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP被截短。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15-18中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP經(jīng)由接頭連接至所 述FIX多肽。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述接頭是肽鍵。
21. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述CTP修飾的FIX多肽的序列是在SEQ ID NO: 31中闡述的序列。
22. -種生產(chǎn)CTP修飾的因子IX(FIX)多肽的方法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè)絨 毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FIX多肽的羧基端，由此生產(chǎn)CTP修飾的FIX 多肽。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述CTP修飾的FIX多肽的序列是在SEQ ID NO :31中闡述的序列。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22-23中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP是由選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氛基酸序列編碼。
25. 根據(jù)權(quán)利要求22-24中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP被糖基化。
26. 根據(jù)權(quán)利要求22-25中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP被截短。
27. 根據(jù)權(quán)利要求22-26中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP經(jīng)由接頭連接至所 述FIX多肽。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述接頭是肽鍵。
29. -種預(yù)防受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙的方法，所述方法包括下述步驟：給所 述受試者施用CTP修飾的凝血因子，所述CTP修飾的凝血因子包含連接至所述凝血因子的 羧基端的3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此預(yù)防所述受試者中的血液凝固或 凝結(jié)障礙。
30. 包含連接至所述凝血因子的羧基端的3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修飾的凝血因子在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防受試者中的血液凝固或凝結(jié) 障礙。
31. 包含連接至所述凝血因子的羧基端的3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修飾的凝血因子在預(yù)防受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙中的用途。
32. -種治療受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙的方法，所述方法包括下述步驟：給所 述受試者施用CTP修飾的凝血因子，所述CTP修飾的凝血因子包含連接至所述凝血因子的 羧基端的3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)，由此治療所述受試者中的血液凝固或 凝結(jié)障礙。
33. 包含連接至所述凝血因子的羧基端的3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修飾的凝血因子在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療受試者中的血液凝固或凝結(jié) 障礙。
34. 包含連接至所述凝血因子的羧基端的3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)的 CTP修飾的凝血因子用于治療受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙的用途。
35. 根據(jù)權(quán)利要求29-34中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述CTP修飾的凝血因子 的序列選自：SEQ ID NO:25、27或29。
36. 根據(jù)權(quán)利要求29-35中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中至少一個(gè)CTP是由選自 SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2的氨基酸序列編碼。
37. 根據(jù)權(quán)利要求29-36中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中至少一個(gè)CTP被糖基化。
38. 根據(jù)權(quán)利要求29-37中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中至少一個(gè)CTP被截短。
39. 根據(jù)權(quán)利要求29-38中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中至少一個(gè)CTP經(jīng)由接頭連 接至所述凝血因子。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法或用途，其中所述接頭是肽鍵。
41. 根據(jù)權(quán)利要求29-40中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述凝血因子是FVII。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法或用途，其中所述FVII是活化的FVII (FVIIa)。
43. 根據(jù)權(quán)利要求29-42中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述障礙是血友病。
44. 根據(jù)權(quán)利要求29-43中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述受試者是兒童。
45. 根據(jù)權(quán)利要求29、32或35-44中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用是經(jīng)由皮下途 徑。
46. -種延長(zhǎng)因子VII (FVII)多肽的生物半衰期、提高曲線下面積（AUC)、降低施用 頻率或降低清除率的方法，所述方法包括下述步驟：將3-5個(gè)絨毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)連接至所述FVII多肽的羧基端，由此延長(zhǎng)所述FVII多肽的生物半衰期、提高曲線下 面積（AUC)、降低施用頻率或降低清除率。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中至少一個(gè)CTP是由選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列編碼。
48. 根據(jù)權(quán)利要求46-47中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP被糖基化。
49. 根據(jù)權(quán)利要求46-48中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP被截短。
50. 根據(jù)權(quán)利要求46-49中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP經(jīng)由接頭連接至所 述FVII多肽。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述接頭是肽鍵。
52. 根據(jù)權(quán)利要求46-51中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FVII是活化的 FVII(FVIIa)。
53. -種生產(chǎn)CTP修飾的因子VII (FVII)多肽的方法，所述方法包括下述步驟：將3個(gè) 絨毛膜促性腺激素羧基端肽（CTP)連接至所述FVII多肽的羧基端，由此生產(chǎn)CTP修飾的 FVII多肽。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中至少一個(gè)CTP是由選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列編碼。
55. 根據(jù)權(quán)利要求53-54中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP被糖基化。
56. 根據(jù)權(quán)利要求53-55中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP被截短。
57. 根據(jù)權(quán)利要求53-56中的任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)CTP經(jīng)由接頭連接至所 述FVII多肽。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述接頭是肽鍵。
59. 根據(jù)權(quán)利要求53-58中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FVII是活化的 FVII(FVIIa)。
60. -種CTP修飾的因子VII (FVII)多肽，其由FVII多肽和連接至所述CTP修飾的 FVII多肽的羧基端的3-5個(gè)促性腺激素羧基端肽（CTP)組成。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的CTP修飾的FVII多肽，其中至少一個(gè)CTP是由選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氛基酸序列編碼。
62. 根據(jù)權(quán)利要求60-61中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的FVII多肽，其中至少一個(gè)CTP 被糖基化。
63. 根據(jù)權(quán)利要求60-62中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的FVII多肽，其中至少一個(gè)CTP 被截短。
64. 根據(jù)權(quán)利要求60-63中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的FVII多肽，其中至少一個(gè)CTP 經(jīng)由接頭連接至所述FVII多肽。
65. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的CTP修飾的FVII多肽，其中所述接頭是肽鍵。
66. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求60-76中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的FVII 多肽。
67. -種多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求60-65中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的多肽。
68. -種表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求67所述的多核苷酸。
69. -種細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求68所述的表達(dá)載體。
70. -種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求68所述的表達(dá)載體。
71. -種治療或預(yù)防受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙的方法，所述方法包括：給受試 者施用根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的因子IX(FIX)多肽。
72. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的因子IX(FIX)多肽在制備組合物 中的用途，所述組合物用于治療或預(yù)防受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙。
73. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項(xiàng)所述的CTP修飾的因子IX(FIX)多肽用于治療或預(yù) 防受試者中的血液凝固或凝結(jié)障礙的用途。
74. 根據(jù)權(quán)利要求71-73中的任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述障礙是血友病。
【文檔編號(hào)】A61K38/24GK104427994SQ201380019660
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月14日
【發(fā)明者】U·E·菲馬, G·哈特 申請(qǐng)人:奧普科生物制品有限公司