可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細胞瓣膜及其制法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和生物材料領(lǐng)域，主要涉及新型去細胞瓣膜的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細胞瓣膜及其制法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]心臟瓣膜病是一種嚴(yán)重危害人類健康的世界性公共問題，發(fā)病率約2.5%。心臟瓣膜置換是治療瓣膜病的有效方法，到2050年，需行瓣膜置換手術(shù)病人估計將會超過85萬。臨床上常用的心臟瓣膜替換物多為機械瓣膜與生物瓣膜，但它們均有嚴(yán)重缺陷。機械瓣膜的血流流場紊亂常導(dǎo)致血液有形成分破壞，可能發(fā)生與凝血系統(tǒng)有關(guān)的出血及血栓形成的并發(fā)癥，術(shù)后需終生服用抗凝藥物治療。生物瓣膜大多為經(jīng)戊二醛交聯(lián)的豬心臟瓣膜或牛心包瓣，但因細胞毒性、鈣化位點暴露、缺少內(nèi)皮細胞屏障等，瓣膜組織會發(fā)生退行性變、鈣化，最終導(dǎo)致瓣膜裂解、衰壞而至功能障礙，使患者約10-15年后面臨再次手術(shù)的可能，且以上兩種瓣膜均無法隨患者生長而重構(gòu)。因此進一步改進或研制一種能夠克服上述缺陷的理想瓣膜替代物成為心臟外科醫(yī)生的追求目標(biāo)。
[0003]組織工程心臟瓣膜是一種新穎的瓣膜假體，利用組織工程技術(shù)將種子細胞種植于支架材料上，并于特定的條件下構(gòu)建組織工程心臟瓣膜，使之在植入體內(nèi)替換病變瓣膜后仍然具有生長、重建、修復(fù)能力，術(shù)后無需抗凝治療，其生物學(xué)性能、機械性能與正常瓣膜相當(dāng)。支架材料主要有去細胞的生物基質(zhì)和合成的高分子聚合物。
[0004]去細胞基質(zhì)由于其良好的生物相容性，并可為種子細胞黏附、增殖、分化等提供類似于體內(nèi)的基質(zhì)微環(huán)境，在組織工程學(xué)中得以廣泛應(yīng)用。目前去細胞基質(zhì)支架材料多為豬心臟瓣膜和牛心包，但去細胞基質(zhì)表面無完整的內(nèi)皮細胞覆蓋，不能控制血漿成分的滲入，可能是引起組織鈣化和衰敗的先行條件。另外，由于去細胞基質(zhì)表面膠原纖維的暴露，在體內(nèi)可能激活血小板而導(dǎo)致血栓的形成。最終，手術(shù)置換的瓣膜會裂解、衰壞而至功能障礙和產(chǎn)生一系列與血栓相關(guān)的并發(fā)癥，所以去細胞基質(zhì)的內(nèi)皮化非常重要。
[0005]血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)具有促進內(nèi)皮細胞增殖、生長、移行的功能，常用來修飾生物材料，使生物材料功能化。其與細胞膜上特異性受體結(jié)合，通過VEGF/VEGFR-2信號通路促進細胞的增殖和材料內(nèi)皮化、血管形成等。其中VEGF 165在各種細胞中分泌最多，也是VEGF發(fā)揮作用的主要形式。血管內(nèi)皮祖細胞表面高表達VEGFR-2，可與VEGF165特異性結(jié)合，利于促進血管內(nèi)皮祖細胞動員、迀移和在局部的定植、生長、分化。
[0006]納米載藥控釋系統(tǒng)可作為一種新穎的藥物載體，能夠攜帶多種藥物且能夠通過改變納米材料的分子量和投料量嚴(yán)格控制藥物的釋放速度和釋放周期，在局部可達到預(yù)定的藥物濃度，從而提高藥物的生物利用度。納米載藥控釋系統(tǒng)以合適的方法將蛋白類藥物包封后，既不影響蛋白活性，又能對其有效地保護，使其避免體內(nèi)蛋白酶的降解而過快清除。
[0007]聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈段以重復(fù)乙二醇氧化乙稀為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，具有高度親水性、無毒、無抗原性和免疫原性及良好組織相容性等優(yōu)點。聚己內(nèi)酯(polycaprolactone,PCL)具有優(yōu)良的藥物透過性、優(yōu)異的生物可降解性和生物相容性。PEG與疏水性PCL鏈段結(jié)合后的PEG-PCL共聚物，與PCL —樣，均可作為優(yōu)良的藥物運輸骨架材料，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。PCL和PEG均已被美國FDA組織批準(zhǔn)在人體內(nèi)使用，且PEG-PCL經(jīng)國際認(rèn)證無毒害，無免疫原性，具有良好的生物降解性和相容性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是:去細胞基質(zhì)表面如果沒有被內(nèi)皮細胞完整覆蓋，將不能控制血漿成分的滲入，可能會引起瓣膜組織的鈣化和激活血小板，但目前去細胞基質(zhì)的內(nèi)皮化技術(shù)還不成熟，其內(nèi)皮化速度和效果還有待提高，瓣膜支架材料的相關(guān)生物學(xué)性能還有待改善。
[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的新型去細胞瓣膜的制備方法。借鑒納米載藥控釋系統(tǒng)原理，利用MAL-PEG-PCL共聚物修飾的PCL納米粒包封生物信號分子VEGF165，形成可控釋放的載VEGF165的PCL納米粒，再通過MAL-PEG末端馬來酰亞胺中不飽和的碳碳雙鍵與引入到去細胞瓣膠原蛋白上的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，從而制備可控釋放VEGF165功能的去細胞瓣膜。該納米載體以合適的方法將VEGF165包封后，既不影響生物信號分子活性，又能對其有效地保護，使其免遭化學(xué)和酶降解以及體內(nèi)高速血流剪切力的破壞，最終保持生物信號分子的生物活性。通過調(diào)整PCL的分子量和投料量控制VEGF165的釋放速度和釋放周期，從而使去細胞瓣處維持一定濃度的VEGF165。
[0010]去細胞瓣膜上的VEGF165對內(nèi)皮祖細胞具有強烈的招募作用，使內(nèi)皮祖細胞在去細胞瓣膜局部定植、生長、分化，最終實現(xiàn)去細胞基質(zhì)支架材料的內(nèi)皮化，使去細胞基質(zhì)與血漿成分相隔開，從而防止鈣化位點和膠原纖維的暴露，進而防止或延緩瓣膜支架材料的鈣化和血小板的激活。將納米載藥控釋系統(tǒng)應(yīng)用于組織工程，制備了可控釋放VEGF165的新型去細胞瓣膜，為組織工程心臟瓣膜的改性修飾研宄提供一種新方法。
[0011]具體來說，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案:
[0012]本發(fā)明提供一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的納米材料，其特征在于，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯，聚己內(nèi)酯和血管內(nèi)皮生長因子。
[0013]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺一聚乙二醇-聚己內(nèi)酯4-10重量份，聚己內(nèi)酯20-40重量份，和血管內(nèi)皮生長因子0.001-0.01 重量份。
[0014]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯4-6重量份，聚己內(nèi)酯20-30重量份，和血管內(nèi)皮生長因子0.001-0.005 重量份。
[0015]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯，聚己內(nèi)酯，磷脂和血管內(nèi)皮生長因子。
[0016]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺一聚乙二醇-聚己內(nèi)酯4-10重量份，優(yōu)選為4-6重量份，聚己內(nèi)酯20-40重量份，優(yōu)選為20-30重量份，磷脂5-10重量份，優(yōu)選為5-8重量份，和血管內(nèi)皮生長因子0.001-0.01重量份，優(yōu)選為0.001-0.005重量份。
[0017]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述血管內(nèi)皮生長因子包含VEGF165。
[0018]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述血管內(nèi)皮生長因子占所述納米材料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.003 % -0.04 %，優(yōu)選為 0.03 % -0.02 %。
[0019]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料中血管內(nèi)皮生長因子的包封率為75% -85%。
[0020]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料的平均粒徑為80-220nm。
[0021]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料中血管內(nèi)皮生長因子在48h的釋放率為50-60%。
[0022]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料通過包含下述步驟的方法制備得到:
[0023]將血管內(nèi)皮生長因子、聚己內(nèi)酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于有機溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。
[0024]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述納米材料通過包含下述步驟的方法制備得到:
[0025](I)將所述血管內(nèi)皮生長因子和磷脂混合反應(yīng)得到血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物；
[0026](2)將血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物、聚己內(nèi)酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于有機溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。
[0027]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述超聲處理后還包括下述步驟:
[0028]將步驟超聲處理后所得水包油乳劑中所述有機溶劑揮發(fā)，得到所述納米材料。
[0029]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述有機溶劑選自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，優(yōu)選為二氯甲烷。所述水溶性聚合物選自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮或乙烯-乙烯醇共聚物，優(yōu)選為聚乙烯醇。
[0030]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述血管內(nèi)皮生長因子和磷脂的重量比為1:1000?1:5000ο
[0031]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述油相與水相的體積比為1:6?1:8。
[0032]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯采用包含下述組分的原料制成:馬來酰亞胺_聚乙二醇1-5重量份，和ε -己內(nèi)醋0.4-2重量份。
[0033]優(yōu)選的，上述納米材料中，馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯采用包含下述組分的原料制成:馬來酰亞胺_聚乙二醇1-2重量份，和ε -己內(nèi)醋0.4-1.5重量份。
[0034]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯的平均分子量為4000-7000 ο
[0035]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯通過包括下述步驟的方法制備得到:
[0036](I)將馬來酰亞胺-聚乙二醇、ε -己內(nèi)酯和催化劑混合，在65-70°C溫度下發(fā)生開環(huán)聚合，合成馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯初產(chǎn)物；
[0037](2)將步驟(I)所述初產(chǎn)物溶解于有機溶劑中，加入沉淀劑使其沉淀，得到所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯。
[0038]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述有機溶劑選自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，優(yōu)選為二氯甲烷。所述沉淀劑選自乙醚、甲醇、正己烷或環(huán)己烷中的一種或兩種以上，優(yōu)選為乙醚或甲醇的一種或兩種。
[0039]優(yōu)選的，上述納米材料中，所述血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物通過包括下述步驟的方法制備得到:
[0040]將磷脂加入叔丁醇中，配制成磷脂/叔丁醇溶液，將磷脂/叔丁醇溶液與血管內(nèi)皮生長因子水溶液混合，在-50?_60°C條件下冷凍，得到所述血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物。
[0041]優(yōu)選的，上述磷脂/叔丁醇溶液的濃度為5-10mg/ml，所述血管內(nèi)皮生長因子水溶液的濃度為1-10 μ g/ml，優(yōu)選為1-5 μ g/mlo
[0042]本發(fā)明還提供一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細胞瓣膜，其特征在于，包括巰基化的去細胞瓣膜和連接于所述巰基化的去細胞瓣膜上的上述任一種納米材料。
[0043]優(yōu)選的，上述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細胞瓣膜，其通過包括下述步驟的方法制備得到:
[0044](I)去細胞瓣膜和巰基化試劑N-丁二酸-S-乙?；鶐€基乙二醇酯發(fā)生巰基化反應(yīng)后，用鹽酸羥胺對所生成的乙?；瘞€基進行保護，得到巰基化的去細胞瓣膜；
[0045](2)將步驟(I)所述巰基化的去細胞瓣膜與上述任一納米材料混合，反應(yīng)后得到所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細胞瓣膜。
[0046]本發(fā)明還提供上述任一種納米材料的制備方法，包括下述步驟:
[0047]將血管內(nèi)皮生長因子、聚己內(nèi)酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于有機溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。
[0048]優(yōu)選的，上述制備方法中，包括下述步驟:
[0049](I)將所述血管內(nèi)皮生長因子和磷脂混合反應(yīng)得到血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物；
[0050](2)將血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物、聚己內(nèi)酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于有機溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。
[0051]優(yōu)選的，上述制備方法中，還包括下述步驟:
[0052]將超聲處理后所得水包油乳劑中所述有機溶劑揮發(fā)，得到所述納米材料。
[0053]優(yōu)選的，上述制備方法中，所述有機溶劑選自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，優(yōu)選為二氯甲烷。所述水溶性聚合物選自聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纖維素、甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素，優(yōu)選為聚乙烯醇。
[0054]優(yōu)選的，上述制備方法中，還包括下述步驟:
[0055]加入聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破壞未包封的血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物。
[0056]優(yōu)選的，上述制備方法其中，所述血管內(nèi)皮生長因子和磷脂的重量比為1:1000?1:5000ο
[0057]優(yōu)選的，上述制備方法中，所述油相與水相的體積比為