專利名稱：一種孔鰩血管生成抑制因子rcaif-i的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及的是一種源于孔鰩的血管生成抑制因子的分離、純化制備方法，具體地講是一種從孔鰩軟骨中制備有抑制血管生成作用的蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
自1972年美國哈佛醫(yī)學(xué)院教授Folkman首次提出的“腫瘤生長依賴于血管形成” 的觀點以來，腫瘤新生血管的形成與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移關(guān)系受到普遍關(guān)注。諸多研究表明， 血管生成是一個由多種細(xì)胞因子參與的、動態(tài)的、協(xié)調(diào)的復(fù)雜過程，涉及一系列形態(tài)學(xué)改變 (如內(nèi)皮細(xì)胞的定向運動和增殖、新生微血管、內(nèi)皮細(xì)胞新的基底膜合成和血管腔產(chǎn)生等一系列步驟)及生化學(xué)改變(如血管生成因子、細(xì)胞因子及相關(guān)抑制因子之間的調(diào)節(jié)失衡)。 而腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移依賴血管生成，建立豐富的血液循環(huán)，以供應(yīng)腫瘤組織異常旺盛的生化代謝以及瘤細(xì)胞的繁殖與轉(zhuǎn)移。因此，血管生成是腫瘤生長、發(fā)展的必經(jīng)之路，且與實體瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，從而以其為重要靶點的抗腫瘤藥物研發(fā)受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。近年來，源于鯊魚的血管生長抑制因子得到廣泛和深入研究，而從中提取的 Neovastat已進(jìn)入III期臨床實驗。但是，隨著鯊魚資源的減少和資源保護(hù)，尋找鯊魚軟骨的替代資源成為研究的熱點，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，魟魚，亦稱鰩魚的軟骨與鯊魚軟骨具有相似的生理或藥理活性，而且軟骨資源總量遠(yuǎn)高于鯊魚，并從中發(fā)現(xiàn)了部分血管生成抑制因子。如中國發(fā)明專利CN1978464A “鰩血管生成抑制因子I的分離、純化及其N-末端氨基酸序列” 即從鰩類魚中發(fā)現(xiàn)了一種分子量為42kDa的血管生成抑制因子。鰩魚資源豐富，僅浙江沿海就有20多種，其中赤紅和孔鰩最為常見。血管生成抑制因子RCAIF-I是從孔鰩軟骨中分離得到的一種活性蛋白，雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型實驗表明該蛋白具有顯著的血管生成抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種孔鰩血管生成抑制因子RCAIF-I的制備方法，制得的抑制因子RCAIF-I具有顯著的血管生成抑制作用，可用于腫瘤疾病的治療。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種孔鰩血管生成抑制因子 RCAIF-I的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)提取RCAIF-I粗提物將孔鰩軟骨破碎勻漿，按1 4 1 8 (g/mL)的比例放置于磷酸鹽緩沖溶液中于O 4°C下振蕩抽提24 48h，以8000 12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15 25min，上清液用30% 60% (重量/體積百分比)的飽和硫酸銨進(jìn)行分級沉淀， 將得到的沉淀物置于透析袋中用蒸餾水透析12 24h，透析液冷凍干燥，得血管生成抑制因子RCAIF-I粗提物；2)離子交換層析純化將上述得到的RCAIF-I粗提物溶于磷酸鹽緩沖溶液中，用微孔濾膜過濾，濾液上Cellulose DE-52離子交換樹脂進(jìn)行層析，洗脫速度為3 5ml/min，獲得5個明顯的分離峰，收集第5峰，合并洗脫液透析12 24h，冷凍干燥； 3)凝膠色譜純化將離子交換純化粗品溶于磷酸鹽緩沖溶液中，濃度為15 20mg/ml，用微孔濾膜過濾后于葡聚糖凝膠G-75柱中進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0. 8 1. 5ml/ min,獲得4個明顯分離峰，收集第2峰，透析12 24h，冷凍干燥，得RCAIF-I。經(jīng)高效液相色譜檢測為一單峰(高效液相色譜條件為流動相40%乙腈-水(0.05% TFA)，流速Iml/ min，上樣量為10 μ 1，樣品濃度為0. 5mg/ml)。作為改進(jìn)，所述磷酸緩沖溶液的PH為6. 8 7. 8，濃度為0. 01 0. 02mol · L-I0再改進(jìn)，所述步驟2)中的Cellulose DE-52離子交換樹脂進(jìn)行層析，層析條件為色譜柱型號為1. 6 2. 6cmX80 120cm，流動相A為0. 01 0. 02mol ~1,ρΕ6. 8 7. 8的磷酸鹽緩沖溶液；B液為A液加NaCl溶液，二元梯度洗脫的NaCl溶液的濃度分別為 0. Imol/L、0. 5mol/L 氯化鈉、1. Omol/L0最后，所述步驟3)中的葡聚糖凝膠G-75柱的層析條件為色譜柱型號為1.6 2. 6cmX80 120cm，流動相為 0. 01 0. 02mol .L-lmol .L-l，pH6· 8 7· 8 的磷酸鹽緩沖溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于原料為資源較廣泛的孔瑤軟骨，用來替代鯊魚在成本上較低廉；提取、純化工藝較簡單，易于操作；制得的抑制因子RCAIF-I經(jīng)12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳-考馬斯亮藍(lán)(Coomassie blue)染色法顯示為一條帶，分子量為36. 2kDa，等電點約為5. 0-6. 0，具有顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜 (CAM)血管生成的作用，可用于腫瘤疾病的治療。


圖1是本發(fā)明實施例用Cellulose DE-52離子交換柱進(jìn)行離子交換時所獲得的分離峰圖，其中橫軸為接收管數(shù)，縱向軸是吸光度值(mAU)，曲線A280-1為洗脫曲線；圖2是本發(fā)明實施例用Superdex 75進(jìn)行層析時所獲得的分離峰圖，其中橫軸為接收管數(shù)，縱向軸是吸光度值(mAU)，曲線A280-21為洗脫曲線；圖3是本發(fā)明實施例用ZORBAX 300SB-C18HPLC柱進(jìn)行層析時所獲得的分離峰圖， 其中橫軸為洗脫時間t (min)，縱向軸是吸光度值(V)，曲線為洗脫曲線；圖4是本發(fā)明實施例用SDS-PAGE電泳-考馬斯亮藍(lán)染色法顯示圖，縱軸為分子量 (kDa)，其中泳道為1標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)，泳道2為RCAIF-I電泳條帶；圖5是本發(fā)明實施例作抑制CAM血管生成的測定的結(jié)果比較圖，其PBS為陰性對照，CS為陽性對照。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實施例一種孔鰩血管生成抑制因子RCAIF-I的制備方法，制備流程如下孔鰩軟骨一組織破碎一硫酸銨沉淀粗分一離子交換層析純化一凝膠滲透色譜純化一冷凍干燥一血管生成抑制因子RCAIF-I。1、孔鰩軟骨組織搗碎機(jī)破碎；
2、孔鰩軟骨有碎粒IOOg和500mL抽提液混和，抽提液中有0. 9867g磷酸氫二鈉和0. 1123g磷酸二氫鉀，隨后將該混和物的pH值調(diào)至7. 4，于20°C下振蕩24h，再于4°C、 lOOOOr/min轉(zhuǎn)速下離心20min，棄殘渣，得到上清液；3、將第2步所得上清液依次用30 %、60 %，(重量/體積百分比)的飽和硫酸銨溶液對所得孔鰩軟骨粗提液進(jìn)行分級沉淀，將所得的30% 60%沉淀以蒸餾水透析過夜，再經(jīng)冷凍干燥獲得RCAIF-I粗提物；5、用Cellulose DE-52離子交換柱進(jìn)行層析，洗脫速度為5ml/min，氯化鈉階梯洗脫濃度分別用0. Imol/L、0. 5mol/L氯化鈉、1. 0mol/L氯化鈉，獲得5個明顯的分離峰，收集第5峰；6、用Superdex 75柱進(jìn)行層析，洗脫速度為1. Oml/min，獲得4個明顯分離峰，收集第2峰；7、用ZORBAX 300SB-C18HPLC進(jìn)行檢測(高效液相色譜條件為流動相40 %乙腈-水(0. 05 % TFA)，流速lml/min,上樣量為10 μ 1，樣品濃度為0. 5mg/ml)，僅發(fā)現(xiàn)1個峰；8、用重蒸水進(jìn)行脫鹽，冷凍干燥，獲得RCAIF-I樣品。所得的RCAIF-I經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳-考馬斯亮藍(lán)染色法顯示為一條帶，分子量為 36. 2kDa。將制得的RCAIF-I作抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的測定，測定方法參考賀國安、羅進(jìn)賢、張?zhí)碓取案倪M(jìn)的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)-無氣室孵育法”[記載于《中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》，2003年第2冊(第42卷)第126-128頁]，測定時濾紙片大小為3mmX3mm ；加樣前孵化時間為4天；加樣量=RCAIF-I分別為0. Ig/L、0. 4g/L、0. 8g/L ； 0. 01mol/L pH 7. 6的磷酸鹽緩沖液(PBS)為陰性對照；0. 4g/L的硫酸軟骨素(CS)為陽性對照，加樣量為10yL。加樣后繼續(xù)孵化24h，以給藥點為中心，以半徑間隔5mm將CAM劃分為3個區(qū)域，計數(shù)各區(qū)域的血管數(shù).結(jié)果表明，孔鰩血管生成抑制因子顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成并呈劑量依賴關(guān)系(表1，圖5)表1加樣48h后CAM上RCAIF-I的血管生成抑制效果的統(tǒng)計學(xué)分析
權(quán)利要求
1.一種孔鰩血管生成抑制因子RCAIF-I的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)提取RCAIF-I粗提物將孔鰩軟骨破碎勻漿，按1 4 1 8g/mL的比例放置于磷酸鹽緩沖溶液中于O 4°C下振蕩抽提24 48h，以8000 12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15 25min，上清液用30% 60% (重量/體積百分比)的飽和硫酸銨進(jìn)行分級沉淀，將得到的沉淀物置于透析袋中用蒸餾水透析12 24h，透析液冷凍干燥，得到血管生成抑制因子 RCAIF-I粗提物；2)離子交換層析純化將上述得到的RCAIF-I粗提物溶于磷酸鹽緩沖溶液中，用微孔濾膜過濾，濾液上Cellulose DE-52離子交換樹脂進(jìn)行層析，洗脫速度為3 5ml/min，獲得 5個明顯的分離峰，收集第5峰，合并洗脫液透析12 24h，冷凍干燥；3)凝膠色譜純化將離子交換純化粗品溶于磷酸鹽緩沖溶液中，濃度為15 20mg/ml， 用微孔濾膜過濾后于葡聚糖凝膠G-75柱中進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0. 8 1. 5ml/min，獲得4 個明顯分離峰，收集第2峰，透析12 24h，冷凍干燥，得RCAIF-I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.8 7. 8，濃度為 0. 01 0. 02mol · Γ1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的CelluloseDE-52離子交換樹脂進(jìn)行層析，層析條件為色譜柱型號為1. 6 2. 6cmX80 120cm，流動相A為 0. 01 0. 02mol · L—1，pH6. 8 7. 8的磷酸鹽緩沖溶液；B液為A液加NaCl溶液，二元梯度洗脫的NaCl溶液的濃度分別為0. Imol/L、0. 5mol/L氯化鈉、1. Omol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的葡聚糖凝膠 G-75柱的層析條件為色譜柱型號為1.6 2. 6cmX80 120cm，流動相為0.01 0. 02mol · L-Imol · L-I, pH6. 8 7. 8 的磷酸鹽緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種孔鰩血管生成抑制因子RCAIF-I的制備方法，步驟為將孔鰩軟骨勻漿，離心去渣，取上清液，加入硫酸銨、靜置、離心，取沉淀透析，進(jìn)行離子交換層析，收集各峰后，透析脫鹽，經(jīng)凝膠柱反復(fù)分離，得一單峰，即為抑制因子RCAIF-I。本發(fā)明的原料為資源較廣泛的孔瑤軟骨，用來替代鯊魚在成本上較低廉；提取、純化工藝較簡單，易于操作；制得的抑制因子RCAIF-I經(jīng)12％的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳-考馬斯亮藍(lán)(Coomassie blue)染色法顯示為一條帶，分子量為36.2kDa，等電點約為5.0-6.0，具有顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的作用，可用于腫瘤疾病的治療。
文檔編號C07K1/36GK102167725SQ20101059320
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者馮剛, 曲有樂, 王斌, 羅紅宇 申請人:浙江海洋學(xué)院