專利名稱：抑制眼部血管生成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及可用于治療與血管生成相關(guān)的病癥和疾病的組合物和方法。具體 地,本發(fā)明涉及tetraspanin 12(TSPAN12)和Norrin的拮抗劑。
背景技術(shù)：
現(xiàn)已相當(dāng)確定血管生成是促進多種病癥發(fā)病的重要因子。這些包括實體瘤 和轉(zhuǎn)移瘤、眼內(nèi)新血管疾病(intraocular neovascular disease)如增殖性視網(wǎng)膜病 (proliferative retinopathies),例如糖尿病性視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy) > 視網(wǎng)膜靜脈閉塞(retinal vein occlusion, RV0)、濕性年齡相關(guān)的黃斑變性(wet age-related macular degeneration, AMD)、新血管性青光目艮(neovascular glaucoma)、 移植角膜組織和其它組織的免疫排斥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。Duda等人J. Clin. Oncology (臨 床腫瘤學(xué)雜志)25 (26) =4033-42 (2007) ；Kesisis 等人 Curr. Pharm. Des.(現(xiàn)代藥物設(shè) 計)13 :2795-809^007) ；Zhang 和 Ma Prog. Ret. & Eye Res.(視網(wǎng)膜和眼研究進展)26 1-37(2007)。視網(wǎng)膜從視網(wǎng)膜血管和脈絡(luò)膜血管獲得其血液供應(yīng)，視網(wǎng)膜血管供應(yīng)視網(wǎng)膜內(nèi) 部部分，脈絡(luò)膜血管供應(yīng)外部部分。視網(wǎng)膜血管損傷發(fā)生在數(shù)種疾病過程中，包括糖尿病 性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity)和視網(wǎng)膜中央和分支靜脈 1 塞(central and branched retinal vein occlusions) ( 生豐見網(wǎng)月莫病(ischemic retinopathies)) 0來自這種損傷的視網(wǎng)膜局部缺血導(dǎo)致不良的新血管形成。脈絡(luò)膜的新 血管形成在許多其它疾病過程(包括AMD)中發(fā)生。相比之下，視網(wǎng)膜不完全的血管化是 患有某些遺傳病的患者的標(biāo)志，該遺傳病例如由Wnt受體FrizzlecM0^(14)、共受體LRP5 或分泌的配體Norrin的突變導(dǎo)致的家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病(familial exudative vitreoretinopathy, FEVR)禾口諾里病(Norrie disease) (Berger 等人 Nature Genet.(自 然遺傳)1 :199-203(1992) ；Chen 等人 Nature Genet.(自然遺傳)1 :204-208 (1992)； Robitaille 等人 Nature Genet.(自然遺傳)32 :326-30(2002) ；Toomes 等人 Am. J. Hum-Genet. (美國人類遺傳性雜志)74 :721-30(2004))。可在敲除相應(yīng)同源基因的小鼠中獲得 這些遺傳病的模型。盡管在眼部血管生成領(lǐng)域有許多進展，仍然需要鑒定靶點并且開發(fā)能夠補充或增 強現(xiàn)有療法的效力的方式。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)，TSPAN12是Norrin誘導(dǎo)的、Frizzled_4-和LRP5-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組分并且在病理性的血管生成的發(fā)展中是必需的。因此， Norrin和TSPAN12是抑制異常眼部血管生成(包括不含Norrin、TSPANl2, Frizzled-4或 LRP5基因的遺傳突變的病癥)的藥物靶點。因此，本發(fā)明提供使用阻斷Norrin或TSPAN12 活性的試劑治療與血管生成相關(guān)的眼部疾病的新方法。一方面，本發(fā)明提供減少或抑制患有與血管生成相關(guān)的眼部疾病或病癥的受試 者中血管生成的方法，該方法包括向該受試者施用TSPAN12拮抗劑。在一些實施方案 中，該TSPAN12拮抗劑是抗-TSPAN12抗體。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗劑包含 TSPAN12的多肽片段，包括胞外域，如第二胞外環(huán)。在一些實施方案中，該拮抗劑還包含 免疫球蛋白恒定區(qū)，例如IgG Fe。在一些實施方案中，該眼部疾病或病癥選自下述各項 組成的組糖尿病性視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy)、脈絡(luò)膜新血管形成(choroidal neovascularization, CNV)Stffi^;WJtSEi^ft (age-related macular degeneration, AMD)、糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)、病理性近視(pathological myopia)、遺傳性斑痣性錯構(gòu)瘤病(von Hippel-Lindau disease)、眼睛的組織胞漿菌 ^f (histoplasmosis of the eye) > ^ N II Φ # J0C 1 ^ (central retinal vein occlusion，CRVO)、視網(wǎng)月莫分支靜脈 1 塞(branched central retinal vein occlusion, BRV0)、角膜新血管形成(corneal neovascularization)、視網(wǎng)膜新血管形成(retinal neovascularization)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity, R0P)、結(jié)膜下出血 (subconjunctival hemorrhage)禾口高血壓性視網(wǎng)膜病(hypertensive retinopathy)。在一些實施方案中，該方法還包括施用第二抗-血管生成劑。在一些實施方案中， 該第二抗-血管生成劑在施用該TSPAN12拮抗劑之前或之后施用。在一些實施方案中，該 第二抗-血管生成劑與該TSPAN12拮抗劑同時施用。在一些實施方案中，該第二抗-血管 生成劑是Norrin的拮抗劑或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的拮抗劑。在一些實施方案 中，該Norrin拮抗劑或該VEGF拮抗劑是抗-Norrin抗體或抗-VEGF抗體(例如，雷珠單抗 (ranibizumab))。另一方面，本發(fā)明提供減少或抑制罹患與血管生成相關(guān)的眼部疾病或病癥的受試 者中血管生成的方法，該方法包括向該受試者施用Norrin拮抗劑。在一些實施方案中，該 Norrin拮抗劑是抗-Norrin抗體。在一些實施方案中，該眼部疾病或病癥選自下述各項組 成的組糖尿病性視網(wǎng)膜病、CNV、AMD、DME、病理性近視、遺傳性斑痣性錯構(gòu)瘤病、眼睛的組 織胞漿菌病、CRV0、BRV0、角膜新血管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、R0P、結(jié)膜下出血和高血壓性 視網(wǎng)膜病。在一些實施方案中，該方法還包括施用第二抗-血管生成劑。在一些實施方案中， 該第二抗-血管生成劑在施用該Norrin拮抗劑之前或之后施用。在一些實施方案中，該第 二抗-血管生成劑與該Norrin拮抗劑同時施用。在一些實施方案中，該第二抗_血管生成 劑是VEGF的拮抗劑，例如抗-VEGF抗體，如雷珠單抗。另一方面，本發(fā)明提供治療受試者中與不希望的血管生成相關(guān)的眼部疾病或病癥 的方法，該方法包括向該受試者施用TSPAN12拮抗劑。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗 劑是抗-TSPAN12抗體。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗劑包含TSPAN12的多肽片段， 包括胞外域，如第二胞外環(huán)。在一些實施方案中，該拮抗劑還包含免疫球蛋白恒定區(qū)，例如 IgG Fe。在一些實施方案中，該眼部疾病或病癥選自下述各項組成的組包括增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病的增殖性視網(wǎng)膜病、CNV、AMD、糖尿病性及其它缺血相關(guān)的視網(wǎng)膜病、DME、病理 性近視、遺傳性斑痣性錯構(gòu)瘤病、眼睛的組織胞漿菌病、CRVO、BRV0、角膜新血管形成、視網(wǎng) 膜新血管形成、R0P、結(jié)膜下出血和高血壓性視網(wǎng)膜病。在一些實施方案中，該方法還包括施用第二抗-血管生成劑。在一些實施方案中， 該第二抗-血管生成劑在施用該TSPAN12拮抗劑之前或之后施用。在其它實施方案中，該 第二抗-血管生成劑與該TSPAN12拮抗劑同時施用。在一些實施方案中，該第二抗-血管 生成劑是Norrin的拮抗劑或VEGF拮抗劑。在一些實施方案中，該Norrin拮抗劑或該VEGF 拮抗劑是抗-Norrin抗體或抗-VEGF抗體(例如，雷珠單抗)。另一方面，本發(fā)明提供治療受試者中與不希望的血管生成相關(guān)的眼部疾病或病癥 的方法，該方法包括向該受試者施用Norrin拮抗劑。在一些實施方案中，該Norrin拮抗劑 是抗-Norrin抗體。在一些實施方案中，該眼部疾病或病癥選自下述各項組成的組包括 增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病的增殖性視網(wǎng)膜病、CNV、AMD、糖尿病性及其它缺血相關(guān)的視網(wǎng)膜 病、DME、病理性近視、遺傳性斑痣性錯構(gòu)瘤病、眼睛的組織胞漿菌病、CRVO、BRV0、角膜新血 管形成、視網(wǎng)膜新血管形成、R0P、結(jié)膜下出血和高血壓性視網(wǎng)膜病。在一些實施方案中，該方法還包括施用第二抗-血管生成劑。在一些實施方案中， 該第二抗-血管生成劑在施用該Norrin拮抗劑之前或之后施用。在其它實施方案中，該第 二抗-血管生成劑與該Norrin拮抗劑同時施用。在一些實施方案中，該第二抗_血管生成 劑是VEGF拮抗劑，例如抗-VEGF抗體，如雷珠單抗。另一方面，本發(fā)明提供使用肽產(chǎn)生抗體的方法，該肽基本上由氨基酸 CRREPGTDQMMSLK(SEQ ID NO 5)組成。在一些實施方案中，該方法包括用該肽免疫動物。在 一些實施方案中，該方法包括篩選文庫(例如Fab文庫)以鑒定結(jié)合該肽的抗體或抗體片 段。在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過任何此類方法產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，本 發(fā)明提供使用任何此類抗體檢測TSPAN12的方法。另一方面，本發(fā)明提供抑制FZD4多聚體形成的體外和體內(nèi)方法，其包括施用 TSPAN12拮抗劑。另一方面，本發(fā)明提供抑制Norrin-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的體外和體內(nèi)的方 法，其包括施用TSPAN12拮抗劑。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗劑是抗-TSPAN12抗 體。在一些實施方案中，該TSPAN12拮抗劑包括TSPAN12的多肽片段，包括胞外域，如第二 胞外環(huán)。在一些實施方案中，該拮抗劑還包括免疫球蛋白恒定區(qū)，例如IgG Fe。另一方面，本發(fā)明提供治療患有先天眼部疾病的受試者的方法，該眼部疾病是由 Norrin, TSPANl2, FZD4或LRP5基因中任意一個的遺傳突變導(dǎo)致的，該方法包括向該受試 者施用增強FZD4多聚體形成的試劑。在一些實施方案中，該疾病是FEVR、諾里病(Norrie disease)或滲出性視網(wǎng)膜病(Coate，s disease)。在一些實施方案中，提高FZD4多聚體 形成的試劑選自由下述各項組成的組=Norrin、抗-FZD4抗體、抗-LRP5抗體和雙特異性 抗-FZD4/抗-LRP5抗體。在一些實施方案中，該遺傳突變破壞FZD4-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。在 一些實施方案中，受試者中的該遺傳突變在該受試者中產(chǎn)生異常蛋白產(chǎn)物，該產(chǎn)物選自由 Norrin-C95R、FZD4-M105V和FZD4-M157V組成的組。在一些實施方案中，在治療受試者之 前檢測該突變在受試者中的存在。附圖簡述

圖1顯示代表性早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)視網(wǎng)膜切片野生型(頂部)和TSPAN12敲除(KO)小鼠(底部)。圖2顯示在來自于野生型(WT ；左)和TSPANl2 KO小鼠(Hom ；右)的ROP視網(wǎng)膜 切片中觀察的新血管核數(shù)目的定量結(jié)果。圖3顯示TSPAN12增強Norrin通過FzcM/LRPS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖4顯示TSPAN12對Norrin-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強是!^zcM特異性的。圖5顯示TSPAN12不增強介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖6顯示Norrin結(jié)合至!7ZtM但不結(jié)合至LRP5或TSPAN12。圖7顯示Norrin結(jié)合至表達(dá)!7ZtM的細(xì)胞，但不結(jié)合至表達(dá)!^(15，LRP5或TSPAN12 的細(xì)胞，并且Norrin不與TSPAN12免疫共沉淀。圖8顯示TSPAN12不與LRP5相關(guān)聯(lián)。圖9顯示TSPAN12不增強Norrin對Fzd4的結(jié)合。圖10顯示共表達(dá)TSPAN12不改變在質(zhì)膜上的表達(dá)。圖11顯示野生型Norrin和C95R突變體Norrin形成的高級結(jié)構(gòu)。圖12顯示過表達(dá)TSPAN12能夠補償單體C95R Norrin的缺陷。圖13顯示TSPAN12調(diào)節(jié)FZD4在信號傳導(dǎo)過程中的聚集(clustering)。優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述定義除非另有定義，本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人 員通常理解的相同含義。參見例如Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典)第二版，J. Wiley & (New York, NY 1994) ；Sambrook 等人，Molecular CloninR, A Laboratory Manual (分子克隆，實驗室指 南)，Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)。為本發(fā)明的目的，對某 些術(shù)語定義如下。當(dāng)用于本文時，術(shù)語“TSPAN12”、“TSPAN12多肽”、“Norrin”、和“Norrin多肽”是指 具有從自然界獲得的TSPAN12或Norrin多肽的氨基酸序列的多肽，而不論其制備方式或物 種。因此，此類多肽可具有來自于人、小鼠或任何其它物種的天然存在的TSPAN12或Norrin 的氨基酸序列。全長人TSPAN12氨基酸序列是MAREDSVKCLRCLLYALNLLFffLMSISVLAVSAWMRDYLNNVLTLTAETRVEEAVILTYFPVVHPVMI AVCCFLIIVGMLGYCGTVKRNLLLLAWYFGSLLVIFCVELACGVWTYEQELMVPVQWSDMVTLKARMTNYGLPRYR ffLTHAWNFFQREFKCCGVVYFTDWLEMTEMDWPPDSCCVREFPGCSKQAHQEDLSDLYQEGCGKKMYSFLRGTKQ LQVLRFLGISIGVTQILAMILTITLLWALYYDRREPGTDQMMSLKNDNSQHLSCPSVELLKPSLSRIFEHTSMAN SFNTHFEMEEL(SEQ ID NO :1).全長小鼠TSPANl2氨基酸序列是MAREDSVKCLRCLLYALNLLFWLMSISVLAVSAWMRDYLNNVLTLTAETRVEEAVILTYFPVVHPVMIA VCCFLIIVGMLGYCGTVKRNLLLLAWYFGTLLVIFCVELACGVWTYEQEVMVPVQffSDMVTLKARMTNYGLPRYRffL THAffNYFQREGCGKKMYSFLRGTKQLQVLRFLGISIGVTQILAMILTITLLffALYYDRREPGTDQMLSLKNDTSQHL SCHSVELLKPSLSRIFEHTSMANSFNTHFEMEEL(SEQ ID NO :2).全長人Norrin氨基酸序列是MRKHVLAASFSMLSLLVIMGDTDSKTDSSFIMDSDPRRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVL LARCEGHCSQASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECNS(SEQ ID NO 3).全長小鼠Norrin氨基酸序列是MRNHVLAASISMLSLLAIMGDTDSKTDSSFLMDSQRCMRHHYVDSISHPLYKCSSKMVLLARCEGHCSQ ASRSEPLVSFSTVLKQPFRSSCHCCRPQTSKLKALRLRCSGGMRLTATYRYILSCHCEECSS(SEQ ID NO 4).此類TSPAN12或Norrin多肽可從自然界分離或可通過重組和/或合成方式產(chǎn)生?！胺蛛x的”用于指多肽時意思是其已經(jīng)從天然來源純化或已經(jīng)通過重組或合成方 法制備并純化?！凹兓钡亩嚯幕旧蠠o其它多肽或肽。此處“基本上無”的意思是低于大 約5 %，優(yōu)選地低于大約2 %，更優(yōu)選地低于大約1 %，甚至更優(yōu)選地低于大約0.5%，最優(yōu)選 地低于大約0. 的其它來源蛋白的污染。術(shù)語“拮抗劑”以最廣義使用，包括部分或完全阻斷、抑制、或中和多肽生物學(xué)活性 的任何分子。例如TSPAN12或Norrin的拮抗劑將部分或完全阻斷、抑制或中和TSPAN12或 Norrin的下述能力，即轉(zhuǎn)導(dǎo)或起始Norrin-誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)或在眼中形成病理性血管的能 力。合適的拮抗劑分子具體包括拮抗性抗體或抗體片段、天然TSPAN12或Norrin多肽的片 段或氨基酸序列變體、肽、TSPAN12或Norrin共受體的可溶性片段、反義RNA、核酶、RNAi、有 機小分子等。用于鑒定TSPAN12或Norrin多肽的拮抗劑的方法可包括使TSPAN12或Norrin 多肽接觸候選拮抗劑分子并測量通常與該多肽有關(guān)的一種或多種生物學(xué)活性的可檢測的 變化。為本文的目的“有活性的”或“活性”是指保留生物學(xué)和/或免疫學(xué)活性的TSPAN12 或Norrin的形式，其中“生物學(xué)”活性是指TSPAN12或Norrin引起的、除了誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體 的能力之外的生物學(xué)功能，且“免疫學(xué)”活性是指誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力，該抗體針對TSPAN12 或Norrin具有的抗原表位。TSPAN12和Norrin主要的生物學(xué)活性是轉(zhuǎn)導(dǎo)或起始Norrin-誘 導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和誘導(dǎo)眼中病理性血管形成。"TSPANl2 共受體(co-rec^ptor) ”或"Norrin 共受體”是指 TSPANl2 或 Norrin 結(jié) 合并介導(dǎo)TSPAN12或Norrin生物學(xué)活性的分子。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，具體覆蓋人、非人(例如鼠的)和人源化的單克隆抗 體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段， 只要它們能展現(xiàn)出所期望的生物學(xué)活性?！疤烊豢贵w”通常是異源四聚體糖蛋白，大約150，000道爾頓，由兩條相同輕(L)鏈 和兩條相同重(H)鏈構(gòu)成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接至重鏈，而二硫鍵的數(shù)量在 不同免疫球蛋白同種型的重鏈中是變化的。每條重鏈和輕鏈也具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫 鍵。每條重鏈在一個末端具有可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，隨之是一些恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一個 末端具有可變結(jié)構(gòu)域(VJ，且在其另一個末端具有恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈 的第一恒定結(jié)構(gòu)域并排，且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域并排。認(rèn)為特定氨基酸殘 基形成輕-和重-鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。木瓜蛋白酶消化抗體得到兩個相同的抗原結(jié)合片段，各帶一個抗原結(jié)合位點，稱 為“Fab”片段，和剩余的“Fe”片段，該名稱反映了其易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理得到 F(ab' )2片段，該片段具有兩個抗原-結(jié)合位點，仍能交聯(lián)抗原?！癋v”是最小的含有完整抗原識別和結(jié)合位點的抗體片段。該區(qū)由一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域緊密、非共價結(jié)合的二聚體組成。Fab段還含有輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)。Fab’片段不同于 Fab片段，因為在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域羧基末端添加了數(shù)個殘基，包括來自抗體絞鏈區(qū)的一個或 多個半胱氨酸。本申請中Fab’_SH為其恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab’。 F(ab' )2抗體片段最初作為在彼此之間具有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab’片段而制備。其它 抗體片段的化學(xué)偶聯(lián)也已知。根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，任一脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕 鏈”都可被劃分為兩種完全不同的類型之一，稱kappa ( κ )和IambdaU )。根據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的類。主要有5 類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分為亞類(同種型)，例如， IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。免疫球蛋白不同類的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、 δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象已經(jīng)熟知?！翱贵w片段”包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域?？?體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab'片段。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即除 了可能少量存在的天然存在的突變之外，構(gòu)成群體的各個抗體相同。單克隆抗體是高度特 異性的，其針對單一抗原位點。另外，與典型地包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的 常規(guī)(多克隆)抗體制備物相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單克 隆”表明抗體的特征是從基本上同質(zhì)的抗體群中獲得的抗體，并不能解釋為要求通過任何 特定方法來生成抗體。例如，將用于本發(fā)明的單克隆抗體可通過雜交瘤方法(由Kohler等 人，Nature(自然)，256 =495(1975)第一次描述)制備，或可通過重組DNA法(參見如，美國 專利No. 4，816，567)制備?！皢慰寺】贵w”也可以使用例如在Clackson等人，Nature (自然)， 352 :624-628 (1991)和 Marks 等人，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)，222 :581-597 (1991) 中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。本文的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特 定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍 生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，還可以是此類 抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利No. 4，816，567 ；和Morrison等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國科學(xué)院院刊)，81 :6851-6855 (1984))。非人(例如鼠的)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白 的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中受體的高 變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(如小鼠、大鼠、兔或非 人靈長類動物)的高變區(qū)殘基替換。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用 相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。 進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部的 至少一個、通常兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有高變區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的 高變區(qū)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少 部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones等人， Nature (自然)321 :522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature (自然)332 :323-3 (1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.(結(jié)構(gòu)生物學(xué)新觀點)2 :593-596 (1992)。當(dāng)用于本文時，“治療0”是獲得有益或期望臨床結(jié)果的方式。為本發(fā)明的目的， 有益或期望的臨床結(jié)果包括但不限于緩解癥狀、減輕疾病程度、穩(wěn)定(例如不惡化)疾病病 癥、延緩或減慢疾病進展、改善或緩和疾病病癥、和緩解(無論部分或完全)、無論可檢測或 不可檢測?！爸委煛笔且环N介入，其實施的意圖是預(yù)防病癥的進展或改變疾病的病理。因此， “治療”可以指治療性處理或預(yù)防性或防范性措施。需要治療的那些包括已經(jīng)患有病癥的那 些，也包括其中需要預(yù)防病癥的那些。具體而言，治療可直接預(yù)防、減緩或其它情況下降低 細(xì)胞退化的病理或損傷，如在癌癥治療中腫瘤細(xì)胞的病理，或可使細(xì)胞更易于通過其它治 療劑治療?！伴L期”施用指與短期模式相反，以連續(xù)模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活 性)維持較長一段時間?！伴g歇”施用指不是無間斷連續(xù)進行的治療，而是本質(zhì)上周期性的。“眼內(nèi)新血管疾病(intraocular neovascular disease) ”是一種以眼部新血 管形成為特征的疾病。眼內(nèi)新血管疾病的實例包括，但不限于，包括增殖性糖尿病性視 網(wǎng)膜病(proliferative diabetic retinopathy)的增殖性視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新血管生
(choroidal neovascularization, CNV) Stffi^;WjtSEi^ft (age-related macular degeneration, AMD)、糖尿病性及其他缺血相關(guān)的視網(wǎng)膜病(diabetic and other ischemia-related retinopathies)、糖尿病性黃斑水月中(diabetic macular edema, DME)、病理性近視(pathological myopia)、遺傳性斑痣性錯構(gòu)瘤(von Hippel-Lindau disease)、眼睛的組織胞漿菌病(histoplasmosis of the eye)、視網(wǎng)膜中央靜脈閉塞 (central retinal vein occlusion，CRV0)、豐見網(wǎng)膜分支1 塞(branched central retinal vein occlusion，BI VO)、角月莫新il 管形 (corneal neovascularization) ^ 網(wǎng)膜新血管形成(retinal neovascularization)、早產(chǎn) JL視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity, R0P)、結(jié)膜下出血(subconjunctival hemorrhage)、禾口高血壓性視網(wǎng)膜病 (hypertensive retinopathy)。優(yōu)選地，眼內(nèi)新血管疾病不包括由于Norrin、TSPAN12、 Frizzled-4或LRP5基因的任一個遺傳突變導(dǎo)致的病癥。例如，本發(fā)明的眼內(nèi)新血管疾病優(yōu) 選不包括FEVR和諾里病等。疾病的“病理”包括危害患者健康的所有現(xiàn)象?！奥?lián)合”一種或多種其它治療劑的施用包括同時(共同)和以任意次序的連續(xù)施用。當(dāng)用于本文時，“載體”包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，其在所采用的 劑量和濃度對暴露于其的細(xì)胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學(xué)可接受的載體是水性PH 緩沖溶液。生理學(xué)可接受載體的例子包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗 氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠 或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰 胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑， 諸如EDTA ；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑， 諸如 TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。本文定義的“小分子”具有低于大約500道爾頓的分子量。實施本發(fā)明的方法
TSPANl2或Norrin活性的拮抗劑的制備和鑒定設(shè)計用于拮抗性藥物候選物的篩選測定以鑒定下述化合物，該化合物結(jié)合或與 TSPAN12或Norrin多肽復(fù)合，或另外干擾它們的活性和/或與其它細(xì)胞蛋白相互作用。小分子可具有作為TSPAN12或Norrin拮抗劑起作用的能力并因而在治療上是有 用的。此類小分子可包括天然存在的小分子、合成有機或無機化合物和肽。然而。本發(fā)明 的小分子不限于這些形式。小分子的廣泛文庫是可商業(yè)獲得的，并且本文教導(dǎo)的或本領(lǐng)域 熟知的廣泛的多種測定用于關(guān)于期望的活性來篩選這些分子。在一些實施方案中，小分子TSPAN12或Norrin拮抗劑通過它們抑制一種或多種 TSPANl2或Norrin生物學(xué)活性的能力來鑒定。因而，使候選化合物與TSPAN12或Norrin 接觸，并然后評定TSPAN12或Norrin的生物學(xué)活性。在一個實施方案中，評定TSPAN12或 Norrin轉(zhuǎn)導(dǎo)或起始Norrin-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的能力。當(dāng)TSPAN12或Norrin的生物學(xué)活性 被抑制時，化合物被鑒定為拮抗劑鑒定為TSPAN12或Norrin拮抗劑的化合物可用于本發(fā)明的方法。例如，TSPANl2 或Norrin拮抗劑可用于治療眼內(nèi)新血管疾病。多種熟知的動物模型(包括例如早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病和激光-誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新血管形 成的模型；Ruiz-Edera & Verkman hvest. Ophthalmol. & Vis. ki.(研究性眼科學(xué)和視覺 科學(xué))48 (10) =4802-10 (2007)，Yu 等人 Invest. Ophthalmol. & Vis. Sci.(研究性眼科學(xué)和 視覺科學(xué))49(6) :2599-605(2007))可用于進一步理解TSPAN12或Norrin在眼內(nèi)新血管疾 病的發(fā)展和發(fā)病中的作用，以及用于測試候選治療劑的效力，包括抗體和其它天然TSPAN12 或Norrin多肽的拮抗劑(諸如小分子拮抗劑)。此類模型的體內(nèi)性質(zhì)使得它們可特別對人 患者的反應(yīng)進行預(yù)測?？贵w結(jié)合研究測試了抗體結(jié)合并抑制TSPAN12或Norrin在Wnt信號傳導(dǎo)報告細(xì)胞中的效應(yīng)的 能力。示例性方法在實施例2中提供，但其它方法對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。示 例性抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的和異源偶聯(lián)的抗體，其制備在本 文中描述?？贵w結(jié)合研究可通過任何已知的測定方法(如競爭性結(jié)合測定、直接和間接 夾心測定、和免疫沉淀測定)來進行。Zola，Monoclonal Antibodies :A Manual of ^Techniques (單克隆抗體技術(shù)手冊)(CRC Press, Inc.，1987)，第 147-158 頁。競爭性結(jié)合測定依賴于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物和測試樣品分析物競爭性結(jié)合有限量的抗 體的能力。測試樣品中靶標(biāo)蛋白的量與已經(jīng)與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為助于確定 已經(jīng)結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，抗體在競爭前或競爭后優(yōu)選是不溶解的，從而結(jié)合至抗體的標(biāo)準(zhǔn) 物和分析物可方便地從保持未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物中分離。夾心測定涉及使用兩種抗體，每種能夠結(jié)合至待檢測蛋白的不同免疫原性部 分，或表位。在夾心測定中，測試樣品分析物通過固定于固相支持物上的第一抗體結(jié)合， 此后第二抗體結(jié)合至分析物，從而形成不溶的三-部分復(fù)合物。參見例如美國專利號 No. 4，376，110。第二抗體本身可通過可檢測的結(jié)構(gòu)部分標(biāo)記(直接夾心測定)或可使用標(biāo) 記有可檢測的結(jié)構(gòu)部分的抗-免疫球蛋白抗體測量(間接夾心測定)。例如，一種類型的夾 心測定是ELISA測定，在該情形中可檢測的結(jié)構(gòu)部分是酶。
對于免疫組化，例如組織樣品可以是新鮮的或冷凍的，或可以埋入石蠟并通過防 腐劑(如福爾馬林)固定。在治療心血管、內(nèi)皮和血管原性病癥中有用的組合物非限制性地包括抑制靶標(biāo)基 因產(chǎn)物的表達(dá)和/或活性的抗體、小有機分子和無機分子、肽、磷酸肽、反義的、siRNA和核 酶分子、三股螺旋(triple-helix)分子等。潛在拮抗劑的更具體的實例包括結(jié)合TSPAN12或Norrin的多肽，特別是抗體，該 抗體非限制性地包括多克隆和單克隆抗體和抗體片段、單鏈抗體、抗獨特型抗體、和此類抗 體或片段的嵌合或人源化版本，以及人抗體和抗體片段。對于TSPAN12，某些胞外結(jié)構(gòu)域 也可以作為拮抗劑(參見例如Ho等人J.Virol·(病毒學(xué)雜志)80(13) =6487-96(2006)； Hemler Nature Rev. Drug Discovery (自然綜述藥物發(fā)現(xiàn))7 :747-58 Q008))。備選地， 潛在的拮抗劑可以是密切相關(guān)蛋白，例如，與共受體相互作用但沒有效應(yīng)的突變形式的 TSPANl2或Norrin，由此競爭性抑制TSPAN12或Norrin的作用。另一種潛在的TSPANl2或Norrin拮抗劑是使用反義技術(shù)制備的反義RNA或DNA構(gòu) 建體，其中例如反義RNA或DNA分子通過與靶標(biāo)mRNA雜交并防止蛋白質(zhì)翻譯來起直接阻斷 mRNA翻譯的作用。反義技術(shù)可用于通過形成三股螺旋或者反義DNA或RNA來控制基因表達(dá)， 這兩種方法都以多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合為基礎(chǔ)。例如，編碼本文所述成熟TSPAN12 或Norrin多肽的多核苷酸序列的5’編碼部分，可用于設(shè)計長度為約10-40個堿基對的反 義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被設(shè)計成與參與轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域互補(三股螺旋-參見， Lee 等人，Nucl. Acids Res.(核酸研究)6 :3073 (1979) ；Cooney 等人，Science (科學(xué))241 456(1988) ；Dervan 等人，Science (科學(xué))251 1360 (1991))，從而阻止 TSPAN12 或 Norrin 的轉(zhuǎn)錄和生成。本文所述的與RNA —部分“互補的”序列是指，具有與RNA雜交形成穩(wěn)定 雙鏈體的足夠互補性的序列；在雙鏈反義核酸情況下，可以由此測試雙鏈體DNA的單鏈， 或者可以測試三股螺旋的形成。雜交能力取決于互補程度以及反義核酸的長度。通常，雜 交核酸越長，它含有的與RNA錯配的堿基越多，但仍可形成穩(wěn)定的雙鏈體(或者三鏈體，視 情況而定)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過使用常規(guī)方法測定雜交復(fù)合物的解鏈溫度，來確定 錯配的耐受程度。反義RNA寡核苷酸在體內(nèi)可與mRNA雜交，并阻斷所述mRNA分子翻譯成 TSPANl2 (反義-Okano,Neurochem.(神經(jīng)化學(xué))56 :560 (1991) :01iRodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(寡核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑)(CRC Press :Boca Raton, FL, 1988)。反義寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA、或其嵌合混合物或衍生物 或改良形式。例如，為了改善分子穩(wěn)定性、雜交等，所述寡核苷酸可以在堿基結(jié)構(gòu)部分、糖 結(jié)構(gòu)部分或磷酸骨架上進行修飾。所述寡核苷酸可以包括其它附加基團，例如肽(例 如，為了靶向體內(nèi)宿主細(xì)胞受體)，或有助于穿過細(xì)胞膜的試劑(參見，例如，Letsinger, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.(美國科學(xué)院院刊)86 :6553-6556 (1989) ；Lemaitre, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.(美國科學(xué)院院刊)84 :648-652(1987) ；PCT 公開 W088/09810，1988年12月15日公開)或有助于穿過血腦屏障的試劑(參見，例如，1988年 4月25目公開的PCT公開號為W089/10134)，雜交-觸發(fā)的切割試劑(參見，例如，Krol等 人，BioiTechniques (生物技術(shù))6 :958-976(1988))或嵌入劑(參見，例如，Zon，Pharm. Res. (藥物研究)5 :539-549(1988))。為此，可以將所述寡核苷酸與另一分子例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運劑、雜交-觸發(fā)的切割劑等偶聯(lián)。反義寡核苷酸可包括至少一種修飾的堿基結(jié)構(gòu)部分，其選自包括但不限于下列基 團的組5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰 胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧 啶、二氫尿嘧啶、β -D-半乳糖Q核苷(β -D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺 苷、1-甲基鳥苷、1-甲基肌苷、2，2_ 二甲基鳥苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、3-甲基胞苷、 5-甲基胞苷、N6-腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿 嘧啶、β -D-甘露糖基Q核苷(β -D-mannosylqueosine)、5’ -甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲 氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺苷、尿嘧啶-5-氧基乙酸(oxyacetic acid) (ν)、 wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2_硫代胞苷、5-甲基_2_硫尿嘧啶、2_硫尿嘧啶、4-硫尿 嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧 啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、仏叩3) 、和2，6-二氨基嘌呤。反義寡核苷酸另外還可以包含至少一種修飾的糖結(jié)構(gòu)部分，其選自包括但不限于 下列基團的組阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。另一實施方案中，所述反義寡核苷酸包含至少一種修飾的磷酸酯骨架，其選自硫 代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代亞磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷 酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯，及其formacetal或類似物組成的組。另一實施方案中，所述反義寡核苷酸是一種異頭(anomeric)寡核苷酸。異頭 寡核苷酸與互補RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中與通常的單元不同，所述鏈?zhǔn)潜舜似?行的(Gautier，等人，Nucl. Acids Res.(核酸研究)15 :6625-6641 (1987))。所述寡核 苷酸是一種2’ -0-甲基核糖核苷酸anoue，等人，Nucl. Acids Res.(核酸研究)15 6131-6148 (1987))，或一種嵌合的DNA-DNA類似物Qnoue,等人，F(xiàn)EBS Lett.(歐洲生化學(xué) 會聯(lián)盟通訊)215 =327-330 (1987))。在一些實施方案中，拮抗劑是抑制性雙鏈體RNA，例如siRNA，shRNA等。本發(fā)明的寡核苷酸可以用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如，通過利用一種自動 DNA合成儀(例如可購自Biosearch, Applied Biosystems等)。例如，硫代磷酸酯寡核苷 酸可以用Stein，等人(Nucl. Acids Res.(核酸研究)16 :3209(1988))所述的方法合成，甲 基膦酸酯寡核苷酸可以通過使用可控的有孔玻璃多聚體支持物(controlled pore glass polymer supports) (Sarin,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(美國科學(xué)院院刊)85 7448-7451(1988))等來制備。上述寡核苷酸還可以遞送至細(xì)胞，從而使反義RNA或DNA在體內(nèi)表達(dá)以抑制 TSPAN12或Norrin的生成。當(dāng)使用反義DNA時，優(yōu)選源自翻譯起始位點的寡脫氧核糖核苷 酸，例如，位于靶基因核苷酸序列約第-10至+10位之間。潛在的拮抗劑還包括與TSPAN12或Norrin6結(jié)合的小分子，從而封閉其活性。小 分子的實例包括，但不限于，肽或肽-樣小分子，優(yōu)選可溶性肽，和合成的非-肽基的有機或 無機化合物。另外的潛在拮抗劑是核酶，它是一種能催化RNA特異性切割的酶促RNA分子。核 酶通過與互補的靶RNA序列特異性雜交，然后內(nèi)核分離(endonucleolytic cleavage)來起作用。潛在RNA靶標(biāo)中的特異性核酶切割位點可以用已知技術(shù)鑒定。更多細(xì)節(jié)見，例如， Rossi，CurrentBiology (現(xiàn)代生物學(xué))4 :469-471 (1994)，和 PCT
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